PDMS fabbricazione del dispositivo e la modifica della superficie

Mi chiamo Ken Kotz. Sono un postdoc qui al Bio MAs Resource Center affiliato al Massachusetts General Hospital. Il mio principale progetto di ricerca consiste nell'isolare i neutrofili utilizzando un dispositivo di cattura dell'immunoaffinità con strutture microfluidiche.

Utilizziamo questo dispositivo in cinque diversi ospedali in tutto il paese per isolare l'RNA per l'analisi genomica a valle. Fondamentalmente quello che hai è un maestro di SU otto fotoresist sopra il silicio. Verseremo un elastomero in due parti A-P-D-M-S sopra quel master e quel PDMS formerà uno stampo.

Rimuoviamo lo stampo master dalla sua custodia e lo mettiamo in una capsula di Petri. Il master è fissato con del nastro adesivo sul fondo di una capsula di Petri. Sulla bilancia pesiamo una miscela di PDMS, indurente e resina di base.

Il rapporto è di una parte di indurente per 10 parti di resina. In genere, per i nostri dispositivi che sono stati tagliati, pesiamo rispettivamente da 20 a 30 grammi di resina e da due a tre grammi di indurente. Dopo aver versato sia l'indurente che la resina nella piccola barchetta di siero, usiamo una forchetta di plastica standard per mescolare i due insieme.

Vuoi assicurarti di mescolare energicamente e piegare la miscela l'una sull'altra per assicurarti che l'indurente sia distribuito uniformemente all'interno della resina. In genere, monitoriamo quanto bene i due sono stati mescolati. Osservando il numero di bolle d'aria, cerchiamo di ottenere una distribuzione uniforme di piccole bolle d'aria in tutto l'elastomero.

Quindi versiamo il PDMS sopra il master SU eight che si trova nella capsula di Petri. Posizioniamo il master con il PDMS sopra di esso in una campana di vetro a vuoto ed evacuiamo la camera per degassare l'aria che abbiamo mescolato in essa. In genere, il processo di degasaggio richiede da 30 minuti a un'ora.

Dopo il degasaggio, rimuoviamo i dispositivi dalla camera a vuoto e li mettiamo in un forno a una temperatura compresa tra 65 e 80 gradi C. Il tempo minimo di polimerizzazione a queste temperature è compreso tra tre e sei ore. Nel nostro laboratorio, di solito lasciamo i dispositivi nel forno durante la notte.

In genere, utilizziamo un coltello in acciaio chirurgico numero 11. Facciamo tagli dritti a circa mezzo centimetro dal bordo del master in silicone, e tagliamo intorno al bordo del master creando un disco grande. Sbucciamo lo stampo PDMS dal master e posizioniamo la caratteristica con il lato rivolto verso l'alto in una capsula di Petri pulita.

Togliamo lo stampo liberato dalla capsula di Petri e lo posizioniamo su una superficie di taglio utilizzando un coltello o un coltello montato su una guida lineare. Sezioniamo i dispositivi che sono contenuti nello stampo. Ogni dispositivo di sezione viene quindi reinserito nella piastra di Petri per un'ulteriore elaborazione.

In genere, per interfacciare i nostri dispositivi con i fluidi, eseguiamo dei fori nel dispositivo PDMS. Il dispositivo che utilizziamo per praticare i fori è una siringa standard a tre mulini. Sulla punta della siringa a tre mulini c'è un ago in acciaio inossidabile a punta smussata.

All'interno dell'ago in acciaio inossidabile c'è un filo che si adatta al diametro interno dell'ago. Quel filo è attaccato allo stantuffo della siringa Tirando indietro lo stantuffo e ritraendo l'ago, è possibile praticare un foro o inserire un tappo nel PDMS. Capovolgere il dispositivo PDMS ed espellerlo spingendo sullo stantuffo.

Il segreto dei dispositivi di punzonatura è mantenere lo stantuffo il più verticale possibile e non ruotare affatto il dispositivo di punzonatura. Quando si perfora il PDMS, si solleva l'intero dispositivo, l'intero dispositivo PDMS con un paio di pinzette, lo si capovolge e si espelle la spina premendo sullo stantuffo. Afferri la spina con un paio di pinzette e la smaltisci.

Quindi si ritrae nuovamente lo stantuffo, si abbassa il dispositivo ed si estrae il dispositivo di taglio. Ripeti l'operazione fino a quando non hai tutti i buchi. Quindi, per il processo di incollaggio, colleghiamo i nostri dispositivi PDMS ai vetrini.

Per i nostri dispositivi, collegheremo in modo non reversibile o collegheremo in modo covalente il PDMS ai vetrini. Il modo in cui ciò si ottiene è mettendoli in un, mettendoli in un Asher al plasma ed esponendoli a un plasma di ossigeno reattivo. Quindi i passaggi per farlo sono prendere il dispositivo PDMS e posizionarlo sul vassoio dell'Asher al plasma.

Con le caratteristiche del dispositivo rivolte verso l'alto, è possibile utilizzare qualsiasi vetrino da microscopio in vetro standard. Usiamo un vetrino da microscopio leggermente ingrandito da un pollice e mezzo per adattarsi al nostro dispositivo. Puoi usarli direttamente dalla confezione.

Preferiamo trattarli in una soluzione piranha. In questo modo si puliscono eventuali contaminanti organici che potrebbero essere presenti sulla superficie del vetrino. Dopo aver posizionato il dispositivo e il vetrino sulla parte superiore del vassoio per l'Asher al plasma, si fa scorrere il vassoio nell'Asher al plasma e lo si espone al plasma reattivo dell'ossigeno.

Dopo aver completato il programma dell'Asher al plasma, apriamo la camera e rimuoviamo la piastra con i nostri dispositivi sul piano del banco. Usando una pinzetta, solleviamo con cautela il dispositivo PDMS, facendo attenzione a non toccare le superfici di incollaggio con le dita. Capovolgiamo il lato di incollaggio sul vetro, sul vetrino, e poi ci assicuriamo che non ci siano bolle d'aria tra il PDMS e il vetrino.

Posizioniamo il dispositivo PDMS ora incollato al vetro su una piastra calda per una temperatura compresa tra 65 e 75 gradi C per 10 minuti per ottenere un migliore legame chimico. In questa sezione, modificheremo chimicamente le superfici del PDMS nel vetro dopo l'incollaggio nella camera bianca, ci rimane una superficie A PMS che ha gruppi OL reattivi sulla superficie. Abbiamo bisogno che questa superficie reattiva sia idrofila e alla fine si diffonda nella maggior parte della PMS.

Quindi la chimica delle superfici si realizza al meglio immediatamente dopo il trattamento al plasma, useremo una soluzione al 5% di un me capto. È un tre me capto, propyl, trimeth oxy. È una soluzione al 5% in volume, e fondamentalmente quello che facciamo è iniettarla nell'ingresso e assicurarci di riempire completamente il dispositivo senza bolle d'aria.

Se sono presenti bolle d'aria, le spingi fuori con una pinzetta. Questo, una volta che hai iniettato lo slan, lo lasci riposare per 15-30 minuti. A temperatura ambiente, in genere, iniettiamo un secondo volume di slan dopo 10 minuti dall'inizio della reazione.

Quindi, dopo che il cilin ha reagito per circa mezz'ora, prenderemo un, laveremo tutti i dispositivi con tre o quattro volumi di etanolo puro. L'eccesso che espelliamo verrà semplicemente cancellato con una salvietta chimica Dopo il risciacquo dei dispositivi, raccogliamo i dispositivi e li posizioniamo su una piastra calda, che è impostata a cento gradi C, e fondamentalmente lasceremo evaporare l'etanolo che è lì dentro. Questo aiuta a inginocchiare la superficie di fissaggio.

Una volta che il dispositivo è asciutto, può essere conservato in un essiccato per mesi oppure può, puoi prendere il dispositivo e procedere immediatamente al passaggio successivo. Dopo che i dispositivi si sono induriti, sono stati polimerizzati con un rivestimento sinusoidale sia sul vetro che sulla superficie del PDMS. Il seno è un capto seno con il gruppo tiolico, che reagirà con il nostro reticolante etero bifunzionale, che è GMBS.

È diluito in etanolo puro. È reattivo all'acqua, quindi è necessario fare attenzione a non esporlo a condizioni acquose. Lo iniettiamo nei dispositivi e rimuoviamo eventuali bolle d'aria con una pinzetta come sto facendo qui per assicurarci che tutte le superfici siano sposate con questa molecola.

Lo copriamo e lo lasciamo agire per mezz'ora. Dopo che il GMBS ha reagito per mezz'ora, sciacquieremo i dispositivi con acqua deionizzata per rimuovere eventuali tracce di etanolo presenti nel dispositivo. E poi scorreremo attraverso la neu travain, che è una proteina legante la biotina.

Il neutravain viene quindi prediluito a una concentrazione di 10 microgrammi per mil. Se, se l'aria viene iniettata accidentalmente nel dispositivo, il dispositivo dovrà essere risciacquato nuovamente con etanolo per rimuovere efficacemente tutta l'aria bagnata dall'etanolo, il dispositivo superficie meglio e consente di rimuovere eventuali bolle d'aria che sono state introdotte accidentalmente nel dispositivo. E una volta che i dispositivi sono stati lavati con l'acqua ionizzata, in genere riempiamo il dispositivo con due o quattro volumi del dispositivo della soluzione diluita di T travain neutra.

Il travain Nutt reagirà con il GMBS, che è immobilizzato in superficie attraverso qualsiasi mezzo primario sul travain Nutt. Questo processo può avvenire a temperatura ambiente per un'ora. In genere, metto i dispositivi nella cella frigorifera a quattro gradi C durante la notte.

Prima di aggiungere l'anticorpo, tuttavia, vogliamo eliminare qualsiasi Aden che non è legato in soluzione. E lo facciamo facendo scorrere attraverso la soluzione BSA all'1% diluita in PBS. Poiché questi chip verranno utilizzati per l'analisi genomica a valle, tutte le soluzioni che utilizziamo sono prive di RNA.

In genere, quello che facciamo è lavare il dispositivo con quattro o cinque volumi della soluzione all'1% di BSA. E poi, in seguito, aggiungiamo il nostro anticorpo. L'anticorpo per questo esperimento è il CD 66 B e gli anticorpi specifici per i granulociti nel sangue intero.

Usiamo una concentrazione compresa tra 10 e 25 microgrammi per mil e iniettiamo l'anticorpo. Inietteremo 200 microlitri di anticorpi in ogni dispositivo. Faremo due iniezioni di cento microlitri, una in ciascuna porta del dispositivo.

In genere, iniettiamo un centinaio di microlitri in una porta e aspettiamo 30 minuti e iniettiamo altri cento microlitri nella porta opposta.