Name: Fabbricazione di un dispositivo a microfluidi per la compartimentazione dei Neuron Soma e assoni (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2007-08-22T00:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 58 s
Description: Impara la litografia morbida con PDMS per fabbricare dispositivi microfluidici che compartimentano soma e assoni neuronali. Questo metodo avanzato facilita studi neurobiologici sulla rigenerazione assonale.

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Parte 1: Preparazione del dispositivo a microfluidi neurone <ol><li> A 3 &quot;wafer di silicio con un modello fatto di SU-8 di fotolitografia è utilizzata per lanciare l&#39;(PDMS) Polidimetilsilossano stampo microfluidica. Ci riferiamo al SU-8 wafer di silicio modellata come stampi master o&quot; maestri &quot;. </li><li> PDMS è mescolato con catalizzatore nel p / w rapporto di 10:1, cioè per 10 grammi di PDMS, 1 grammo di catalizzatore è aggiunto ad esso. </li><li> Il PDMS è poi mescolato bene e versato sul wafer di silicio. Il wafer di silicio è contenuto in un piatto di polistirolo 10 centimetri di Petri. Ci vogliono circa 12 g per 15 g di PDMS per coprire il master con uno spessore di circa 4 mm. </li><li> Il master con il PDMS viene poi posto in un essiccatore a vuoto con il coperchio della scatola di Petri, e pompa a vuoto. Questo viene fatto per aiutare a rimuovere le bolle d&#39;aria dal PDMS che sono state introdotte durante l&#39;agitazione in del catalizzatore. Ci vogliono circa 15 minuti per le bolle d&#39;aria da rimuovere. </li><li> Il master con PDMS viene rimosso dal essiccatore. Un fucile ad aria con un filtro da 0,45 um viene utilizzato per rimuovere eventuali bolle rimanenti. </li><li> Il master è quindi posto su una piastra di 80 ° C a caldo per 1 ora da curare. </li></ol> Nota: se un essiccatore a vuoto non è disponibile, il master può essere lasciato a temperatura ambiente per diverse ore. Le bolle d&#39;aria alla fine dissipare per conto proprio. Se un piatto caldo non è disponibile, il PDMS curerà a temperatura ambiente dopo 24 ore. Nota: E &#39;anche importante assicurarsi che il master sia in piano durante il processo di polimerizzazione. Parte 2: Taglio del dispositivo neurone microfluidi <ol><li> Una volta che il PDMS è curata sul master, che viene portato in una cappa pulita. </li><li> Utilizzando una lama chirurgica, un cerchio è tagliato intorno al perimetro dei dispositivi. Quando si inserisce la lama nel PDMS, è importante prendere contatto con il wafer di silicio, ma non mettere troppa pressione sul wafer, altrimenti il ​​padrone si spezzerà. </li><li> Con un cerchio tagliare tutto il modo per aggirare i dispositivi (ci sono 4 dispositivi per ogni &quot;3 Master Silicio), il PDMS è alzato attentamente fuori il padrone. Questo può essere avviato da torcere delicatamente la lama chirurgica in quanto è inserito nel sezionate prima . </li><li> Successivamente, i serbatoi sono forati nel dispositivo utilizzando un 8 mm biopsia punch. </li><li> I dispositivi sono poi squartato e tagliato via l&#39;eccesso PDMS in modo che il dispositivo si adatta perfettamente a Corning coperchio di vetro (n. 1) 24 mm x 40 mm. L&#39;azoto dell&#39;aria è usato per soffiare via tutti i detriti in eccesso. Detriti testardo può anche essere rimosso utilizzando Marca 3M Scotch 471 nastro in vinile. </li></ol> Parte 3: Plasma incollaggio i dispositivi scivola copertura in vetro. <ol><li> Cleaner plasma viene utilizzato per legare un Harrick i dispositivi neurone al coprioggetto. In breve, i dispositivi vengono inseriti nella pulizia al plasma e una pompa da vuoto è utilizzato per evacuare l&#39;aria dalla camera. </li><li> Dopo la pressione di vuoto ha raggiunto 300 milliTorr, si accende la bobina elettrica e impostato su alto. </li><li> La bobina elettrica crea plasma &quot;, un gas parzialmente ionizzato costituito da elettroni, gli ioni e atomi neutri o molecole&quot; - <a href="http://www.harrickplasma.com/plasma_physics.php">http://www.harrickplasma.com/plasma_physics.php</a> , fuori le molecole di aria residua nella camera di sinistra. Il plasma crea specie reattive sulle superfici del vetro e del dispositivo, che una volta messi insieme formeranno un legame permanente. Il plasma si trasforma anche le superfici idrofile, che aiuta a facilitare l&#39;aggiunta di liquidi. Inoltre, il dispositivo di pulizia al plasma sterilizza i dispositivi. La superficie del dispositivo PDMS che contiene il dispositivo a microfluidi è posizionato rivolto verso il filtro al plasma con le diapositive di vetro. Le superfici trattate al plasma del vetro e dispositivo a microfluidi sono assemblati in contatto con l&#39;altro in un banco pulito, poi messo in sterili 60 piatti mm. Le superfici trattate formare un legame stretto irreversibile. </li><li> Entro 10 minuti di plasma incollaggio dei dispositivi al vetro, Poli-L-lisina (PLL) viene aggiunto al dispositivo. Dopo 10 minuti, l&#39;idrofilia del dispositivo diminuisce rendendo difficile per il PLL per entrare nel dispositivo. Nota: è importante verificare la presenza di bolle d&#39;aria nel dispositivo dopo l&#39;aggiunta di PLL. Le bolle d&#39;aria nel canale principale sono indesiderabili, come farebbero ossidare le cellule. Un metodo semplice per rimuovere eventuali bolle d&#39;aria esistente è quello di utilizzare una pipetta P200 riempito con 150 ul di liquido (in questo caso PLL), posizionare la punta direttamente all&#39;apertura del canale principale, e premere il P200 con forza. Questo può essere necessario ripetere più volte ma alla fine la forza dalla pipetta guiderà le bolle fuori. </li><li> I dispositivi contenenti PLL sono autorizzati a incubare una notte in una cultura incubatore standard di tessuto a 37 ° C con 5% di CO 2. </li><li> Il giorno successivo, devizi sono sciacquate due volte rapidamente con autoclave dH2O. Durante questo processo, il liquido non è mai completamente rimossa dai canali principali, solo dai serbatoi. La rimozione di liquido dai canali principali introdurrà bolle. Dopo 2 risciacqui veloci, i dispositivi sono pieni di autoclave dH2O e reinserito nella incubatore per un minimo di 3 ore, o durante la notte. </li><li> Il giorno dopo, i dispositivi sono ancora una volta risciacquati 2 volte rapidamente con autoclave dH2O. Poi, neurali dei media basale, contenente le integrazioni necessarie B27 e glutamax per i neuroni di ratto coltura principale, si aggiunge ai dispositivi. I dispositivi sono rimesse in incubatrice per un uso futuro. I dispositivi sono ora pronti per la semina dei neuroni. </li></ol>

<ol><li>Park, J. W., Vahidi, B., , A. M., Rhee, S. W., Jeon, N. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidic+culture+platform+for+neuroscience+research.%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Microfluidic culture platform for neuroscience research.</a> Nat Protoc. 1, 2128-2136 (2006).</li>
<li>Taylor, A. M., Blurton-Jones, M., Rhee, S. W., Cribbs, D. H., Cotman, C. W., Jeon, N. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+microfluidic+culture+platform+for+CNS+axonal+injury%2C+regeneration+and+transport%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">A microfluidic culture platform for CNS axonal injury, regeneration and transport.</a> Nat Methods. 2, 599-605 (2005).</li>
</ol>

In questo video abbiamo dimostrato come fare e preparare un dispositivo PDMS microfluidi che usiamo per i neuroni cultura in Il dispositivo permette di ottenere una frazione pura assonale separati da microscolpiture dal vano contenente un mix di corpi cellulari, dendriti e degli assoni . Questi dispositivi consentono al ricercatore di studiare gli effetti dei vari trattamenti, oltre a fornire una piattaforma per effettuare danni fisici allo assoni e osservare quello che questi trattamenti hanno effetti sui neuroni. Il dispositivo fornisce anche un livello di coltura per i neuroni che aiuta a facilitare gli studi di trasporto. Inoltre, il microscolpiture, che separano il vano di coltura cellulare dal vano assone, permette di isolamento fluido tra i due comparti che rende possibile il trattamento di un lato del dispositivo senza influenzare l&#39;altro lato del dispositivo direttamente con il trattamento. Questa proprietà consente al ricercatore di studiare gli effetti come la trasduzione del segnale e dei trasporti che risultano dal trattamento.

<table><tbody><tr><td>PDMS</td><td>Reagente</td><td>Dow Corning</td><td></td><td>Sylgard 184 con agente indurente. Si prega di consultare Dow Corning per trovare un fornitore nelle vicinanze</td></tr><tr><td>Plasma Cleaner</td><td>Strumento</td><td>Harrick Scientific Products, Inc.</td><td></td><td>http://www.harrickplasma.com/</td></tr><tr><td>Neural Basal Media</td><td>Reagente</td><td>Invitrogen</td><td>21103-049</td><td>Neural Basal Media è ottenuto da Invitrogen attraverso la loro linea Gibco di reagenti per colture cellulari.</td></tr><tr><td>B27</td><td>Reagente</td><td>Invitrogen</td><td>17504-044</td><td>B27 è un supplemento commerciale disponibile tramite Invitrogen attraverso la loro linea Gibco di reagenti per colture cellulari.</td></tr><tr><td>Glutamax</td><td>Reagente</td><td>Invitrogen</td><td>35050-061</td><td>Glutamax è disponibile tramite Invitrogen attraverso la loro linea Gibco di reagenti per colture cellulari.</td></tr><tr><td>Cornig No. 1 Cover Glass</td><td>vetro coprioggetto</td><td>Corning</td><td>Corning No. X2935 244</td><td>Disponibile tramite Fisher Scientific, numero di catalogo Fish 12-531D</td></tr><tr><td>Piatto di Petri da 60 mm</td><td>Strumento</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-757-13A</td><td>Piatti di Petri sterili in polistirene da 60 mm sono utilizzati per alloggiare il dispositivo fissato al vetro.</td></tr><tr><td>Tubo BD Falcon da 50 ml</td><td>Strumento</td><td>BD Biosciences</td><td>Falcon No. 352098</td><td>Disponibile tramite il numero di catalogo Fisher Scientific 14-959-49A</td></tr><tr><td>Tubo BD Falcon da 15 ml</td><td>Strumento</td><td>BD Biosciences</td><td>Falcon No. 352097</td><td>Disponibile tramite il numero di catalogo Fisher Scientific 14-959-70C</td></tr><tr><td>Poli-L-Lisina</td><td>Reagente</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P-1274</td><td></td></tr><tr><td>Nuovo elemento</td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

fabbricazione di un dispositivo a microfluidi per la compartimentazione dei neuron soma e assoni

Fabrication of a Microfluidic Device for the Compartmentalization of Neuron Soma and Axons

In questo video, dimostriamo la tecnica della litografia soft con polidimetil silossano (PDMS) che usiamo per fabbricare un dispositivo a microfluidi per i neuroni di coltura. In precedenza, un wafer di silicio è stato modellato con la progettazione del dispositivo neurone microfluidica utilizzando SU-8 e fotolitografia per creare uno stampo maestro, o che cosa ci riferiamo semplicemente come un &quot;master&quot;. Successivamente, versate il silicio polimero PDMS in cima al maestro che viene poi curata dal riscaldamento del PDMS a 80 ° C per 1 ora. Il PDMS forma uno stampo negativo del dispositivo. Il PDMS è poi accuratamente tagliata e sollevata dal maestro. I buchi sono forati in cui i serbatoi saranno e l&#39;eccesso PDMS tagliato fuori dal dispositivo. L&#39;azoto è usato per soffiare via i detriti in eccesso dal dispositivo. A questo punto i dispositivi sono ora pronti per l&#39;uso e può legato a corning n ° 1 bicchiere coprire con un plasma sterilizzatore / pulitore o può essere reversibile legata al vetro di copertura, semplicemente posizionando il dispositivo sulla parte superiore del vetro di copertura. Il legame reversibile del dispositivo al vetro è coperto in un altro video e richiede prima che il dispositivo da sterilizzare sia con il 70% di etanolo o in autoclave. Plasma trattamento sterilizza i dispositivi in ​​modo che nessun ulteriore trattamento è necessario. E &#39;tuttavia importante, quando plasma trattamento dei dispositivi, per aggiungere liquido al dispositivo entro 10 minuti di trattamento al plasma, mentre le superfici sono ancora idrofile. In attesa più lunghi di 10 minuti per aggiungere liquido al dispositivo rende difficile per il liquido di entrare nel dispositivo. I dispositivi sono in genere neurone plasma legato alla copertura in vetro e 0,5 mg / ml di poli-L-lisina (PLL) a pH 8,5 tampone borato è immediatamente aggiunto al dispositivo. Dopo un minimo di 3 ore di incubazione con PLL, i dispositivi vengono lavati con acqua dH2O un minimo di 3 volte con almeno 15 minuti tra ogni lavaggio. Successivamente, l&#39;acqua viene rimossa e mezzi freschi si aggiunge al dispositivo. A questo punto il dispositivo è pronto per l&#39;uso. E &#39;importante ricordare, a questo punto per rimuovere mai tutti i media dal dispositivo. Lasciare sempre i media nel canale principale.

In questo video ci mostrano la tecnica della litografia soft con polidimetil silossano (PDMS) che usiamo per farbricate un dispositivo a microfluidi per i neuroni di coltura.

Fabbricazione di un dispositivo a microfluidi per la compartimentazione dei Neuron Soma e assoni

In questo video, dimostriamo la tecnica della soft lithography con polidimetilsilossano (PDMS), che utilizziamo per fabbricare un dispositivo microfluidico per...

Benvenuti nel laboratorio del Dott. Newly John. Il John Lab si specializza nell'ingegnerizzazione di piattaforme microfluidiche per applicazioni biologiche. In questo video, illustreremo la produzione e l'utilizzo di un dispositivo microfluidico progettato per compartimentare e coltivare neuroni primari.Il dispositivo neurale è stato pubblicato per la prima volta su Nature Methods nell'agosto del 2005. Da quando è stato introdotto, il dispositivo neurale è stato ampiamente utilizzato da collaboratori in tutto il mondo. Il dispositivo neurale è costituito da un pezzo di PDMS che è stato stampato su una piastrina di silicio contenente un pattern SUA del dispositivo, precedentemente creato mediante fotolitografia.Il dispositivo presenta tre caratteristiche principali, quattro serbatoi del diametro di otto millimetri, due canali principali larghi ciascuno 1,5 millimetro, lunghi sette millimetri e alti cento micron, e microsolchi larghi 10 micrometri e alti tre micrometri che collegano i due canali principali. La lunghezza dei microsolchi può variare da 150 micron a 900 micron, anche se la lunghezza standard scelta è di 450 micron. Osservando il dispositivo in modo che i canali principali e i microsolchi siano in posizione verticale, si può notare che i serbatoi a sinistra dei solchi sono collegati tramite i canali principali, così come lo sono i serbatoi a destra.Questa caratteristica permette al liquido di fluire attraverso il canale principale, un aspetto importante che rende possibile il caricamento delle cellule e la sostituzione dei mezzi di coltura. Il dispositivo per neuroni presenta tre vantaggi principali rispetto alle piattaforme tradizionali di coltura tissutale. Primo, consente la compartimentazione separata dei corpi cellulari, o soma, e degli assoni. Con il dispositivo per neuroni, è possibile ottenere frazioni assonali pure.La dimensione e la lunghezza delle microincisioni permettono agli assoni di passare attraverso l'altro canale principale, impedendo al contempo ai corpi cellulari di attraversare. Secondo, grazie alla progettazione del dispositivo e sfruttando la pressione idrostatica, è possibile sottoporre separatamente a trattamenti il lato cellulare e/o il lato assone del dispositivo semplicemente mantenendo un volume maggiore nei serbatoi da un lato rispetto all'altro. E terzo, la frazione puramente assonica del dispositivo può essere isolata mediante aspirazione a vuoto, consentendo al ricercatore di studiare e osservare la rigenerazione assonica.La ricercatrice Hina Lee mostrerà ora come preparare il dispositivo microfluidico per neuroni. Viene utilizzato un wafer di silicio di tre pollici con un motivo realizzato in SU-8 mediante fotolitografia per ottenere il calco in PDMS (polidimetilsilossano) per il microcanale. Indichiamo il wafer di silicio con motivo in SU-8 come stampi principali o semplicemente master.Il PDMS viene mescolato con l'agente indurente in un rapporto ponderale di 10 a 1. Cioè, ad esempio, 15 grammi di PDMS per 1,5 grammi di agente indurente. Il PDMS viene quindi mescolato accuratamente e versato sulla wafer di silicio.Il wafer di silicio è contenuto all'interno di una piastra di Petri in polistirene da 10 centimetri. Per ricoprire le MA con uno spessore di circa quattro millimetri sono necessari approssimativamente da 12 grammi a 15 grammi di PDMS. Il master con il PDMS viene quindi posizionato in un essiccatore sotto vuoto con il coperchio della piastra di Petri rimosso e viene applicato il vuoto.Questo passaggio serve ad aiutare la rimozione delle bolle d'aria dal PDMS che si sono formate durante la miscelazione dell'agente indurente. Sono necessari circa 15 minuti per eliminare completamente le bolle d'aria. Dopo 15 minuti nel desiccante sotto vuoto, il master con il PDMS viene rimosso dal desiccante.Sono ancora presenti alcune bolle d'aria sul master in PDMS. Per rimuovere le bolle residue viene utilizzata una pistola ad aria con filtro da 0,45 micron. Il master viene quindi posizionato su una piastra riscaldante a 80 °C per un'ora per completare la polimerizzazione.Se non è disponibile un essiccatore sotto vuoto, il campione può essere lasciato a temperatura ambiente per diverse ore. Le bolle d'aria si dissiperanno gradualmente da sole. Se non è disponibile una piastra riscaldante, il PDMS si polimerizzerà a temperatura ambiente dopo 24 ore.È importante assicurarsi che il master sia livellato durante il processo di polimerizzazione. Una volta che il PDMS è polimerizzato sul master, viene trasferito in una cappa sterile utilizzando una lama chirurgica. Viene effettuato un taglio circolare lungo il perimetro dei dispositivi.È importante che, quando si inserisce la lama nel PDMS per entrare in contatto con la piastrina di silicio, non si eserciti troppa pressione sulla piastrina, altrimenti il master si romperà con un taglio circolare che circonda completamente i dispositivi. Ci sono quattro dispositivi per ogni master di silicio da tre pollici. Il PDMS viene sollevato con cura dal master.Questa operazione può essere iniziata ruotando delicatamente la lama chirurgica mentre viene inserita nel taglio precedente. È molto sottile con i dispositivi in PDMS sullo stampo. I serbatoi rivolti verso l'alto vengono perforati nel dispositivo utilizzando un punch per biopsia tissutale di otto millimetri.Il materiale residuo rimasto nel puncher viene espulso con una bacchetta. I dispositivi vengono quindi divisi in quarti e il PDMS in eccesso viene tagliato, in modo che il dispositivo si adatti perfettamente a un coverglass Corning. Si utilizza aria azotata per rimuovere eventuali residui in eccesso da un vetrino di dimensioni 24 millimetri per 40 millimetri, numero uno.Detriti ostinati possono essere rimossi anche utilizzando nastro vinilico 3M Scotch Brand 4 7 1. I dispositivi puliti sono ora pronti per la saldatura al plasma. Un pulitore al plasma Herrick viene utilizzato per saldare brevemente i dispositivi neuronali ai coverslip.I dispositivi e i vetrini sono posizionati su un vassoio, che verrà quindi inserito nel pulitore al plasma e una pompa a vuoto verrà utilizzata per rimuovere l'aria dalla camera. È importante notare che i dispositivi in PDMS vengono posizionati con la faccia rivolta verso l'alto, ovvero con il disegno rivolto verso l'alto, in modo da essere esposti al gas al plasma.Dopo che la pressione del vuoto ha raggiunto i 300 millitorr, l'alimentazione viene attivata sulla bobina elettrica e impostata al massimo. Si apre leggermente la porta per far entrare un po' d'aria nella camera, il che aiuterà a generare il plasma. I dispositivi e il vetro di copertura vengono trattati al plasma per due minuti.Osservare il colore viola nella camera. Questo è il plasma reale. La bobina elettrica genera un plasma, che è un gas parzialmente ionizzato costituito da elettroni, ioni e atomi o molecole neutri.Il plasma genera specie reattive sulla superficie del vetro e del dispositivo, che, quando vengono posti a contatto, formeranno un legame permanente. Il plasma rende inoltre la superficie idrofila, favorendo l'aggiunta di liquidi. Il pulitore al plasma sterilizza anche i dispositivi.Dopo il trattamento al plasma per due minuti, si spegne l'alimentazione nel vuoto e si introduce aria nella camera. Le superfici trattate al plasma del vetro e del dispositivo microfluidico vengono assemblate a contatto l'una con l'altra in un banco pulito. I dispositivi vengono quindi posizionati in piastre sterili da 60 millimetri.Le superfici del vetro e del dispositivo trattate al plasma formano un legame stretto e irreversibile. Entro 10 minuti dal legame al plasma, al dispositivo viene aggiunto poliol lisina. Dopo 10 minuti, l'idrofilicità del dispositivo diminuirà.Rende difficile l'ingresso del PLL nel dispositivo. È importante controllare la presenza di bolle d'aria nel dispositivo dopo l'aggiunta del PLL. Un metodo semplice per rimuovere le bolle d'aria presenti consiste nell'utilizzare una pipetta P 200 riempita con 100 microlitri di liquido.In questo caso, posizionare la punta della pipetta direttamente all'apertura del canale principale, quindi premere con forza il pulsante della P200. Questa operazione potrebbe dover essere ripetuta più volte, ma alla fine la forza esercitata dalla pipetta espellerà le bolle d'aria. I dispositivi contenenti PLL vengono lasciati in incubazione tutta la notte in un normale incubatore per colture cellulari a 37 gradi con 5% CO2.Dopo 24 ore di incubazione con PLL, i dispositivi vengono risciacquati due volte rapidamente con acqua deionizzata proveniente dall'autoclave. Durante questo processo, il liquido viene rimosso completamente solo dai serbatoi, mai dai canali principali. Rimuovere il liquido dai canali principali introdurrebbe bolle d'aria.Dopo due risciacqui rapidi, i dispositivi vengono riempiti nuovamente con acqua deionizzata proveniente dall'autoclave e rimessi nell'incubatrice per almeno tre ore o per tutta la notte. Il giorno successivo, dopo che i dispositivi sono stati incubati con acqua per tutta la notte o per un minimo di tre ore, vengono nuovamente trasferiti nella cappa a sicurezza biologica e risciacquati due volte con acqua deionizzata. Successivamente, viene aggiunto ai dispositivi il mezzo basale neuronale contenente i supplementi necessari, B27 e glutammato, per la coltura di neuroni primari di ratto.I dispositivi vengono quindi riposti nell'incubatrice per un uso futuro. I dispositivi sono ora pronti per l'innesto dei neuroni. In questo video, abbiamo dimostrato la tecnica della litografia morbida, che utilizziamo per produrre i nostri dispositivi neuronali.Questi dispositivi possono essere utilizzati per coltivare neuroni e altri tipi cellulari di interesse. Il vantaggio principale di questi dispositivi è la capacità di separare e compartimentalizzare la coltura dei corpi cellulari dei neuroni su un lato del dispositivo da una frazione pura di assoni sull'altro lato. Nel prossimo video, vi mostreremo come prepariamo i neuroni corticali fetali di ratto a E 18 e come carichiamo le cellule nel dispositivo.Questo è tutto dal laboratorio di John. Grazie per averci seguito.

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BioMEMS: Fucinatura nuove collaborazioni tra biologi e ingegneri

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Depolarizzazione selettiva assistita da microfluidica dei mitocondri assonali

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Chip microfluidico per la costruzione di modelli di lesioni assonali e l'abilitazione dell'analisi multi-omica

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