Fabbricazione di un dispositivo a microfluidi per la compartimentazione dei Neuron Soma e assoni

Benvenuti nel laboratorio del Dr.Newly John. Il John Lab è specializzato nell'ingegnerizzazione di piattaforme microfluidiche per applicazioni biologiche. In questo video, dimostreremo la produzione e l'utilizzo di un dispositivo microfluidico progettato per la compartimentazione e la coltura di neuroni primari.

Il dispositivo neuronale è stato pubblicato per la prima volta su Nature Methods nell'agosto del 2005. Sin dalla sua introduzione, il dispositivo neuronale è stato ampiamente utilizzato da collaboratori di tutto il mondo. Il dispositivo neuronale è costituito da un pezzo di PDMS che è stato fuso su un wafer di silicio contenente un modello SUA del dispositivo, che è stato precedentemente creato mediante fotolitografia.

Il dispositivo ha tre caratteristiche principali, quattro serbatoi, otto millimetri di diametro, due canali principali ciascuno di 1,5 millimetri di larghezza, sette millimetri di lunghezza e cento micron di altezza e micro scanalature, che sono 10 micrometri di larghezza e tre micrometri di altezza che uniscono i due canali principali. Le micro scanalature possono variare in lunghezza da 150 micron a 900 micron, anche se la lunghezza standard scelta è di 450 micron. Osservando il dispositivo in modo che i canali principali e le micro scanalature siano verticali, possiamo vedere che i serbatoi a sinistra delle scanalature sono collegati tramite i canali principali, così come i serbatoi a destra.

Questa caratteristica consente al liquido di fluire attraverso il canale principale, che è una caratteristica importante, rendendo possibile il caricamento delle celle e il cambio dei fluidi. Il dispositivo neuronale presenta tre principali vantaggi rispetto alle tradizionali piattaforme di coltura tissutale. Uno, consente la compartimentazione dei corpi cellulari o soma e degli assoni Con il dispositivo neuronale è possibile ottenere frazioni assonali pure.

Le dimensioni e la lunghezza delle micro scanalature consentono agli assoni di passare attraverso l'altro canale principale, impedendo al contempo l'attraversamento dei corpi della sega. Numero due, a causa del design del dispositivo e sfruttando la pressione idrostatica, è possibile sottoporre sia il lato della cella che il lato dell'assone del dispositivo a trattamenti separati semplicemente mantenendo il volume e i serbatoi più alti su un lato del dispositivo rispetto all'altro. E numero tre, la frazione assonale pura del dispositivo può essere tagliata mediante aspirazione a vuoto, consentendo al ricercatore di studiare e osservare la rigenerazione assonale.

La ricercatrice Hina Lee dimostrerà ora la preparazione del dispositivo per neuroni microfluidici. Un wafer di silicio a tre Ang con un modello realizzato in SU otto mediante fotolitografia viene utilizzato per fondere lo stampo microfluidico PDMS in polidimetile. Ci riferiamo al wafer di silicio del modello SUA come stampi master o semplicemente master.

Il PDMS viene miscelato con l'agente indurente con un rapporto peso/peso di 10 a uno. Cioè, ad esempio, 15 grammi di PDMS per 1,5 grammi di agente indurente. Il PDMS viene quindi miscelato bene e versato sul wafer di silicio.

Il wafer di silicio è contenuto all'interno di una capsula di Petri in polistirene da 10 centimetri. Sono necessari da 12 a 15 grammi di PDMS per coprire le MA con uno spessore di circa quattro millimetri. Il master con il PDMS viene quindi posto in un essiccato sottovuoto con il coperchio della piastra di Petri e viene applicato il vuoto.

Questo viene fatto per aiutare a rimuovere le bolle d'aria dal PDMS che sono state introdotte durante l'agitazione dell'agente indurente. Ci vogliono circa 15 minuti per rimuovere le bolle d'aria. Il master con PDMS viene rimosso dall'essiccato dopo 15 minuti nell'essiccato sottovuoto.

Ci sono ancora alcune bolle rimanenti sul master PDMS. Una pistola ad aria compressa con un filtro da 0,45 micron viene utilizzata per rimuovere eventuali bolle rimanenti. Il master viene quindi posto su una piastra calda a 80 gradi per un'ora per polimerizzare.

Se non è disponibile un essiccante sottovuoto, il master può essere lasciato a temperatura ambiente per diverse ore. Le bolle d'aria alla fine si dissiperanno da sole. Se non è disponibile una piastra riscaldante, il PDMS polimerizzerà a temperatura ambiente dopo 24 ore.

È importante assicurarsi che il master sia a livello durante il processo di polimerizzazione. Una volta che il PDMS è indurito sul master, viene portato su una cappa pulita utilizzando una lama chirurgica. Viene praticato un cerchio tagliato attorno al perimetro dei dispositivi.

È importante che quando si inserisce la lama nel PDMS entri in contatto con il wafer di silicio, ma non esercitare troppa pressione sul wafer, altrimenti il master si spezzerà con un taglio circolare tutto intorno ai dispositivi. Ci sono quattro dispositivi per ogni master in silicio da tre pollici. Il PDMS viene sollevato con cautela dal master.

Questo può essere avviato ruotando delicatamente la lama chirurgica mentre viene inserita nel taglio precedente. È davvero sottile con i dispositivi PDMS sullo stampo. I serbatoi rivolti verso l'alto vengono perforati nel dispositivo utilizzando un punzone per biopsia tissutale da otto millimetri.

I detriti rimasti nel perforatore vengono espulsi con un'asta. I dispositivi vengono quindi tagliati in quarti e il PDMS in eccesso viene tagliato via in modo che il dispositivo si adatti perfettamente a un coperchio Corning. L'aria di azoto di 24 millimetri per 40 millimetri viene utilizzata per soffiare via i detriti in eccesso.

I detriti ostinati possono anche essere rimossi utilizzando il nastro in vinile 3M Scotch Brand 4 7 1. I dispositivi clean sono ora pronti per l'incollaggio al plasma. Un pulitore al plasma di Herrick viene utilizzato per legare brevemente i dispositivi neuronali ai vetrini coprioggetti.

I dispositivi e i vetrini coprioggetto vengono posizionati su un vassoio, che verrà quindi inserito nel pulitore al plasma e in una pompa a vuoto utilizzata per evacuare l'aria dalla camera. È importante notare che i dispositivi PDMS sono posizionati a faccia in su. Cioè, con il design rivolto verso l'alto in modo che siano esposti al gas plasma.

Dopo che la pressione del vuoto ha raggiunto i 300, la potenza in millitorr viene attivata sulla bobina elettrica e impostata su un valore elevato. Tutto è rotto sulla porta per far entrare un po' d'aria nella camera, che aiuterà a generare il plasma. I dispositivi e il vetro di copertura sono trattati al plasma per due minuti.

Nota il colore viola nella camera. Questo è il plasma vero e proprio. La bobina elettrica crea il plasma, che è un gas parzialmente ionizzato costituito da elettroni, ioni e atos o molecole neutre.

Il plasma crea specie reattive sulla superficie del vetro e del dispositivo, che una volta messe insieme formeranno un legame permanente. Il plasma trasforma anche la superficie in idrofilia, il che aiuta a facilitare l'aggiunta di liquidi. Il pulitore al plasma sterilizza anche i dispositivi.

Dopo il trattamento al plasma per due minuti, l'alimentazione nel vuoto viene spenta e l'aria viene condotta nella camera. I servizi trattati al plasma del vetro e del dispositivo microfluidico sono assemblati a contatto tra loro in un banco pulito. I dispositivi vengono quindi posti in piastre sterili da 60 millimetri.

Le superfici trattate al plasma del vetro e del dispositivo formano un legame stretto e irreversibile. Entro 10 minuti dal legame al plasma, il dispositivo viene aggiunto al poliolo di vetro lisina al dispositivo. Dopo 10 minuti, l'idrofilia del dispositivo diminuirà.

Rendendo difficile l'ingresso del PLL nel dispositivo. È importante verificare la presenza di bolle d'aria nel dispositivo dopo l'aggiunta di PLL. Un metodo semplice per rimuovere le bolle d'aria presenti consiste nell'utilizzare una pipetta P 200 riempita con 100 microlitri di liquido.

In questo caso, PLL posiziona la punta direttamente all'apertura del canale principale, quindi preme con forza il P 200. Potrebbe essere necessario ripetere questa operazione più volte, ma alla fine la forza della pipetta farà uscire le bolle. I dispositivi contenenti PLL possono essere incubati durante la notte e un incubatore standard per colture tissutali a 37 gradi con il 5% di CO2.

Dopo 24 ore di incubazione con PLL, i dispositivi vengono risciacquati due volte rapidamente con acqua deionizzata in autoclave. Durante questo processo, il liquido non viene mai completamente rimosso dai canali principali, ma solo dai serbatoi. La rimozione del liquido dai canali principali introdurrà bolle.

Dopo due rapidi risciacqui, i dispositivi vengono riempiti nuovamente con acqua deionizzata in autoclave e riposti nell'incubatrice per un minimo di tre ore o durante la notte. Il giorno successivo, dopo che i dispositivi sono stati incubati con acqua durante la notte o per un minimo di tre ore, vengono nuovamente portati nella cabina di biosicurezza e risciacquati due volte con acqua deionizzata. Quindi ai dispositivi vengono aggiunti i terreni basali neurali contenenti gli integratori necessari, B 27 e glutammato per la coltura dei neuroni primari di ratto.

I dispositivi vengono quindi riposti nell'incubatrice per un uso futuro. I dispositivi sono ora pronti per l'inserimento dei neuroni. In questo video, abbiamo dimostrato la tecnica della litografia morbida, che utilizziamo per produrre i nostri dispositivi neuronali.

Questi dispositivi possono essere utilizzati per coltivare neuroni e altri tipi di cellule di interesse. Il vantaggio principale di questi dispositivi è la capacità di separare e compartimentalizzare la coltura dei corpi cellulari neuronali su un lato del dispositivo da una frazione assonale pura sull'altro lato del dispositivo. Nel prossimo video, ti mostreremo come prepariamo i neuroni corticali fetal rack E 18 e come carichiamo le cellule nel dispositivo.

Questo è tutto dal John Lab. Grazie per l'attenzione.