Fabbricazione di un dispositivo a microfluidi per la compartimentazione dei Neuron Soma e assoni

Benvenuti nel laboratorio del Dott. Newly John. Il John Lab si specializza nell'ingegnerizzazione di piattaforme microfluidiche per applicazioni biologiche. In questo video, illustreremo la produzione e l'utilizzo di un dispositivo microfluidico progettato per compartimentare e coltivare neuroni primari.

Il dispositivo neurale è stato pubblicato per la prima volta su Nature Methods nell'agosto del 2005. Da quando è stato introdotto, il dispositivo neurale è stato ampiamente utilizzato da collaboratori in tutto il mondo. Il dispositivo neurale è costituito da un pezzo di PDMS che è stato stampato su una piastrina di silicio contenente un pattern SUA del dispositivo, precedentemente creato mediante fotolitografia.

Il dispositivo presenta tre caratteristiche principali, quattro serbatoi del diametro di otto millimetri, due canali principali larghi ciascuno 1,5 millimetro, lunghi sette millimetri e alti cento micron, e microsolchi larghi 10 micrometri e alti tre micrometri che collegano i due canali principali. La lunghezza dei microsolchi può variare da 150 micron a 900 micron, anche se la lunghezza standard scelta è di 450 micron. Osservando il dispositivo in modo che i canali principali e i microsolchi siano in posizione verticale, si può notare che i serbatoi a sinistra dei solchi sono collegati tramite i canali principali, così come lo sono i serbatoi a destra.

Questa caratteristica permette al liquido di fluire attraverso il canale principale, un aspetto importante che rende possibile il caricamento delle cellule e la sostituzione dei mezzi di coltura. Il dispositivo per neuroni presenta tre vantaggi principali rispetto alle piattaforme tradizionali di coltura tissutale. Primo, consente la compartimentazione separata dei corpi cellulari, o soma, e degli assoni. Con il dispositivo per neuroni, è possibile ottenere frazioni assonali pure.

La dimensione e la lunghezza delle microincisioni permettono agli assoni di passare attraverso l'altro canale principale, impedendo al contempo ai corpi cellulari di attraversare. Secondo, grazie alla progettazione del dispositivo e sfruttando la pressione idrostatica, è possibile sottoporre separatamente a trattamenti il lato cellulare e/o il lato assone del dispositivo semplicemente mantenendo un volume maggiore nei serbatoi da un lato rispetto all'altro. E terzo, la frazione puramente assonica del dispositivo può essere isolata mediante aspirazione a vuoto, consentendo al ricercatore di studiare e osservare la rigenerazione assonica.

La ricercatrice Hina Lee mostrerà ora come preparare il dispositivo microfluidico per neuroni. Viene utilizzato un wafer di silicio di tre pollici con un motivo realizzato in SU-8 mediante fotolitografia per ottenere il calco in PDMS (polidimetilsilossano) per il microcanale. Indichiamo il wafer di silicio con motivo in SU-8 come stampi principali o semplicemente master.

Il PDMS viene mescolato con l'agente indurente in un rapporto ponderale di 10 a 1. Cioè, ad esempio, 15 grammi di PDMS per 1,5 grammi di agente indurente. Il PDMS viene quindi mescolato accuratamente e versato sulla wafer di silicio.

Il wafer di silicio è contenuto all'interno di una piastra di Petri in polistirene da 10 centimetri. Per ricoprire le MA con uno spessore di circa quattro millimetri sono necessari approssimativamente da 12 grammi a 15 grammi di PDMS. Il master con il PDMS viene quindi posizionato in un essiccatore sotto vuoto con il coperchio della piastra di Petri rimosso e viene applicato il vuoto.

Questo passaggio serve ad aiutare la rimozione delle bolle d'aria dal PDMS che si sono formate durante la miscelazione dell'agente indurente. Sono necessari circa 15 minuti per eliminare completamente le bolle d'aria. Dopo 15 minuti nel desiccante sotto vuoto, il master con il PDMS viene rimosso dal desiccante.

Sono ancora presenti alcune bolle d'aria sul master in PDMS. Per rimuovere le bolle residue viene utilizzata una pistola ad aria con filtro da 0,45 micron. Il master viene quindi posizionato su una piastra riscaldante a 80 °C per un'ora per completare la polimerizzazione.

Se non è disponibile un essiccatore sotto vuoto, il campione può essere lasciato a temperatura ambiente per diverse ore. Le bolle d'aria si dissiperanno gradualmente da sole. Se non è disponibile una piastra riscaldante, il PDMS si polimerizzerà a temperatura ambiente dopo 24 ore.

È importante assicurarsi che il master sia livellato durante il processo di polimerizzazione. Una volta che il PDMS è polimerizzato sul master, viene trasferito in una cappa sterile utilizzando una lama chirurgica. Viene effettuato un taglio circolare lungo il perimetro dei dispositivi.

È importante che, quando si inserisce la lama nel PDMS per entrare in contatto con la piastrina di silicio, non si eserciti troppa pressione sulla piastrina, altrimenti il master si romperà con un taglio circolare che circonda completamente i dispositivi. Ci sono quattro dispositivi per ogni master di silicio da tre pollici. Il PDMS viene sollevato con cura dal master.

Questa operazione può essere iniziata ruotando delicatamente la lama chirurgica mentre viene inserita nel taglio precedente. È molto sottile con i dispositivi in PDMS sullo stampo. I serbatoi rivolti verso l'alto vengono perforati nel dispositivo utilizzando un punch per biopsia tissutale di otto millimetri.

Il materiale residuo rimasto nel puncher viene espulso con una bacchetta. I dispositivi vengono quindi divisi in quarti e il PDMS in eccesso viene tagliato, in modo che il dispositivo si adatti perfettamente a un coverglass Corning. Si utilizza aria azotata per rimuovere eventuali residui in eccesso da un vetrino di dimensioni 24 millimetri per 40 millimetri, numero uno.

Detriti ostinati possono essere rimossi anche utilizzando nastro vinilico 3M Scotch Brand 4 7 1. I dispositivi puliti sono ora pronti per la saldatura al plasma. Un pulitore al plasma Herrick viene utilizzato per saldare brevemente i dispositivi neuronali ai coverslip.

I dispositivi e i vetrini sono posizionati su un vassoio, che verrà quindi inserito nel pulitore al plasma e una pompa a vuoto verrà utilizzata per rimuovere l'aria dalla camera. È importante notare che i dispositivi in PDMS vengono posizionati con la faccia rivolta verso l'alto, ovvero con il disegno rivolto verso l'alto, in modo da essere esposti al gas al plasma.

Dopo che la pressione del vuoto ha raggiunto i 300 millitorr, l'alimentazione viene attivata sulla bobina elettrica e impostata al massimo. Si apre leggermente la porta per far entrare un po' d'aria nella camera, il che aiuterà a generare il plasma. I dispositivi e il vetro di copertura vengono trattati al plasma per due minuti.

Osservare il colore viola nella camera. Questo è il plasma reale. La bobina elettrica genera un plasma, che è un gas parzialmente ionizzato costituito da elettroni, ioni e atomi o molecole neutri.

Il plasma genera specie reattive sulla superficie del vetro e del dispositivo, che, quando vengono posti a contatto, formeranno un legame permanente. Il plasma rende inoltre la superficie idrofila, favorendo l'aggiunta di liquidi. Il pulitore al plasma sterilizza anche i dispositivi.

Dopo il trattamento al plasma per due minuti, si spegne l'alimentazione nel vuoto e si introduce aria nella camera. Le superfici trattate al plasma del vetro e del dispositivo microfluidico vengono assemblate a contatto l'una con l'altra in un banco pulito. I dispositivi vengono quindi posizionati in piastre sterili da 60 millimetri.

Le superfici del vetro e del dispositivo trattate al plasma formano un legame stretto e irreversibile. Entro 10 minuti dal legame al plasma, al dispositivo viene aggiunto poliol lisina. Dopo 10 minuti, l'idrofilicità del dispositivo diminuirà.

Rende difficile l'ingresso del PLL nel dispositivo. È importante controllare la presenza di bolle d'aria nel dispositivo dopo l'aggiunta del PLL. Un metodo semplice per rimuovere le bolle d'aria presenti consiste nell'utilizzare una pipetta P 200 riempita con 100 microlitri di liquido.

In questo caso, posizionare la punta della pipetta direttamente all'apertura del canale principale, quindi premere con forza il pulsante della P200. Questa operazione potrebbe dover essere ripetuta più volte, ma alla fine la forza esercitata dalla pipetta espellerà le bolle d'aria. I dispositivi contenenti PLL vengono lasciati in incubazione tutta la notte in un normale incubatore per colture cellulari a 37 gradi con 5% CO2.

Dopo 24 ore di incubazione con PLL, i dispositivi vengono risciacquati due volte rapidamente con acqua deionizzata proveniente dall'autoclave. Durante questo processo, il liquido viene rimosso completamente solo dai serbatoi, mai dai canali principali. Rimuovere il liquido dai canali principali introdurrebbe bolle d'aria.

Dopo due risciacqui rapidi, i dispositivi vengono riempiti nuovamente con acqua deionizzata proveniente dall'autoclave e rimessi nell'incubatrice per almeno tre ore o per tutta la notte. Il giorno successivo, dopo che i dispositivi sono stati incubati con acqua per tutta la notte o per un minimo di tre ore, vengono nuovamente trasferiti nella cappa a sicurezza biologica e risciacquati due volte con acqua deionizzata. Successivamente, viene aggiunto ai dispositivi il mezzo basale neuronale contenente i supplementi necessari, B27 e glutammato, per la coltura di neuroni primari di ratto.

I dispositivi vengono quindi riposti nell'incubatrice per un uso futuro. I dispositivi sono ora pronti per l'innesto dei neuroni. In questo video, abbiamo dimostrato la tecnica della litografia morbida, che utilizziamo per produrre i nostri dispositivi neuronali.

Questi dispositivi possono essere utilizzati per coltivare neuroni e altri tipi cellulari di interesse. Il vantaggio principale di questi dispositivi è la capacità di separare e compartimentalizzare la coltura dei corpi cellulari dei neuroni su un lato del dispositivo da una frazione pura di assoni sull'altro lato. Nel prossimo video, vi mostreremo come prepariamo i neuroni corticali fetali di ratto a E 18 e come carichiamo le cellule nel dispositivo.

Questo è tutto dal laboratorio di John. Grazie per averci seguito.