Cambiamenti di equilibrio nella struttura di monitoraggio RNA da 'perossidativi' e 'ossidativo' Footprinting radicale ossidrile

L'obiettivo generale del seguente esperimento è quello di accertare come le molecole di RNA si ripiegano utilizzando l'impronta del radicale ossidrile. Ciò si ottiene mediante marcatura finale, purificazione del gel e pre-ripiegamento dell'RNA, che garantisce la conferma dell'integrità dell'RNA prima del ripiegamento mediato dal magnesio come passaggio successivo, i reagenti Fenton vengono miscelati per generare radicali ossidrilici, che possono successivamente scindere la spina dorsale dell'RNA in base alla sua accessibilità al solvente. Successivamente, i prodotti di scissione dell'RNA vengono separati mediante elettroforesi su gel di poliacrilammide denaturante e visualizzati mediante autoradiografia.

Gli integrali di banda sono quantificati mediante software di analisi semi-automatica dell'impronta. L'obiettivo finale è quello di generare isoterme di ripiegamento che riflettano la formazione della struttura terziaria dell'RNA. Ciò si ottiene scalando gli integrali di banda normalizzati alla saturazione frazionaria.

Le isoterme possono essere successivamente adattate all'equazione di hill. Il vantaggio principale dell'impronta idrossilata è che si ottengono informazioni sulla struttura terziaria dell'RNA utilizzando sostanze chimiche poco costose a causa della maggiore attività nei radicali idrossilati di piccole dimensioni sono sonde perfette per distinguere tra nucleotidi accessibili ai solventi e sepolti. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo della biologia strutturale dell'RNA.

Ad esempio, in che modo i ribosomi impiegano gli ioni metallici per raggiungere la loro conferma attiva? L'impronta del radicale idrossilato può essere utilizzata per comprendere i fondamenti della specificità e del riconoscimento dell'RNA. Oltre a rivelare informazioni sulla struttura terziaria dell'RNA, questo metodo può essere utilizzato per determinare i siti precisi di legame delle proteine nell'RNA o nelle molecole di DNA.

Le principali sfide di questo metodo sono prevenire la degradazione del campione da parte della ribonucleasi e ottimizzare la concentrazione di ferro al fine di ottenere la giusta quantità di scissione dell'RNA. Inoltre, l'analisi dettagliata degli intervalli di banda può essere piuttosto complicata. Il vantaggio principale di questo video è quello di aiutare il pubblico a comprendere le fasi di pianificazione e l'esecuzione di successo dell'esperimento sull'impronta dei radicali idrossiradicali Prima dell'inizio di questo protocollo, preparare tutta l'impronta nei reagenti come descritto nel protocollo scritto.

Accompagnando questo video, l'RNA può essere prodotto DFO quattro correlati e marcati all'estremità come descritto lì. Purificare l'RNA marcato radioattivamente utilizzando l'elettroferesi su gel denaturante. Recuperare l'RNA purificato mediante due successive estrazioni su gel utilizzando acetato di sodio 0,3 molari.

Quindi precipitare l'RNA mescolando 0,5 millilitri di soluzione acquosa con un millilitro di etanolo. Incubare la miscela per un minuto su ghiaccio secco Dopo aver centrifugato il campione, scartare il supinato. Lavare il pellet di RNA con etanolo al 70%.

Rimuovere il supinato dopo un'ulteriore centrifugazione ed essiccare il pellet sotto vuoto. Quindi, sciogliere i campioni di RNA purificati marcati con P 32. In 330 microlitri di tampone di reazione una tantum pipettare 30 microlitri della soluzione di RNA in una nuova provetta di reazione.

Far precipitare l'RNA con etanolo e quindi essiccare il pellet sotto vuoto una volta essiccato, questo pellet può essere utilizzato per generare la scala di riferimento come descritto nella procedura scritta per naturare la soluzione di RNA tamponato rimanente riscaldando a 95 gradi Celsius per due minuti. Chiamare i campioni a temperatura ambiente per 15 minuti e seguire con una rapida centrifuga per riportare la condensa in soluzione. Per iniziare l'esperimento dell'impronta, impostare 27 provette di reazione per campioni sufficienti a riempire un gel per elettroforesi a 30 pozzetti.

Dopo aver incluso le scale e il controllo scisso, determinare le concentrazioni finali di magnesio ferro in modo che siano uniformemente distanziate su una scala logaritmica su diversi ordini di grandezza attorno al punto medio di titolazione, la preparazione degli ioni magnesio in un tempo il tampone di reazione è descritto nel testo separatamente. Incubare l'RNA e le soluzioni di ioni magnesio a 50 gradi Celsius per cinque minuti. Quindi mescolare 10 microlitri della soluzione di RNA con 90 microlitri della corrispondente quantità di soluzione di ferro e magnesio.

Per raggiungere un volume finale di 100 microlitri, incubare ogni miscela per 30 minuti a 50 gradi Celsius. Successivamente, lasciare che le soluzioni si equilibrino a 25 gradi Celsius per un'ora mentre si verifica il ripiegamento dell'RNA. Come nel frattempo, immediatamente prima di iniziare l'impronta del radicale ossidrile in reazione, preparare la miscela di reazione fantasma come descritto nel protocollo scritto.

Preparare la reazione di perossidazione pipettando due goccioline da microlitro ciascuna di ferro, EDTA, ascorbato di sodio e perossido di idrogeno nella parte superiore all'interno della provetta di reazione contenente la soluzione di RNA, in modo che le goccioline non si tocchino. Avviare la reazione di impronta mescolando energicamente. Dopo 15 secondi, interrompere la reazione aggiungendo 300 microlitri di etanolo puro a freddo.

Girare i tubi da tre a cinque volte. Infine, precipitare, lavare e asciugare il pellet come eseguito in precedenza in alternativa alla reazione ossidativa, la reazione ossidrilica ossidativa verrebbe eseguita aggiungendo ai campioni cinque microlitri della miscela di reazione Fenton appena preparata. Incubare la reazione ossidativa per 30 minuti a 25 gradi Celsius.

Quindi aggiungere 300 microlitri di etanolo freddo puro per spegnere la reazione e mescolare girando i tubi. Ancora una volta, precipitate. Lavare e asciugare il pellet al termine della reazione ossidativa o ossidativa.

Sciogliere i pellet di RNA essiccati in otto microlitri di colorante di caricamento gel due. Confermare che l'RNA marcato con P 32 sia risospeso utilizzando un contatore geer per preparare un gel di sequenziamento denaturante all'8% di poliacrilammide secondo i protocolli standard. Utilizzando un pettine a 30 pozzetti, caricare i campioni, inclusi due riferimenti e un controllo tagliato.

Separare i frammenti di RNA a 60-75 watt per due ore e mezza. Esporre il gel essiccato a uno schermo fosfofatico per la notte. Scansiona lo schermo fosfofatico con un sistema di imaging per la radiografia automatica senza pellicola.

Quindi trasferire il file immagine del gel sul computer per l'analisi. Per iniziare l'analisi dei dati, apri Safa e il software open source per l'adattamento e la quantificazione a banda singola. Caricare la sequenza di RNA come file TXT a punti, seguita dall'immagine del gel come file a punti su gel.

Definisci le corsie e regola le intensità delle bande. Quindi scegliere una corsia di ancoraggio ed eseguire un'assegnazione di allineamento gel delle bande ai nucleotidi in riferimento agli RNA T una scala di digestione. Quantifica le intensità delle bande e utilizza la funzione di normalizzazione del grafico a colori per normalizzare e assegnare residui potenzialmente invarianti.

Salva l'output come file txt. SFA produce un foglio di calcolo contenente colonne, che rappresentano le corsie sul gel e le righe che rappresentano i singoli integrali di banda corrispondenti al frammento di RNA. In primo luogo, i siti di protezione che mostrano un notevole cambiamento nell'accessibilità del solvente devono essere identificati confrontando il profilo di protezione derivato dal campione di ioni senza magnesio con il profilo della concentrazione finale di ioni magnesio.

Più basso è il valore, più il nucleotide è protetto contro l'attacco dei radicali ossidrilici e viceversa. Successivamente, crea curve di transizione di banda, intensità di singoli o gruppi di nucleotidi rispetto alla concentrazione di ferro magnesio utilizzando un foglio di calcolo scala individualmente queste transizioni alla funzione di saturazione frazionaria come descritto nella parte di testo di questo protocollo. Come passaggio finale, adattare i dati all'equazione della collina.

Questa analisi scala la transizione alla saturazione frazionaria, determina il punto medio della transizione e fornisce un test fenomenologico per verificare se una transizione è mostrata sigmoidale. Ecco i risultati rappresentativi degli esperimenti sull'impronta del radicale ossidrile P quattro P sei RRNA. Le isoterme sono state derivate da gel di sequenziamento analizzati da Safa e poi adattate come descritto nella sezione di analisi.

L'immagine del gel indica che la scissione di fondo è minima e che l'assegnazione di un singolo nucleotide è possibile a causa di bande ben definite nella corsia T uno. La frammentazione dell'RNA indotta dal radicale ossidrile è ben al di sopra del fondo. La transizione da ioni magnesio bassi ad ioni alti è selettivamente associata alla diminuzione dell'intensità di singoli e gruppi di bande che indicano la formazione di RNA.

La protezione della struttura terziaria si riferisce a singoli o gruppi di nucleotidi contigui le cui variazioni di scissione in concomitanza con intensità di banda sono quantificate e normalizzate mediante analisi di Saferer. L'output è un grafico termico che visualizza il grado di protezione contro i radicali ossidrilici. La transizione di colore descrive il cambiamento di accessibilità con l'aggiunta di ferro al magnesio: il bianco al rosso mostra nucleotidi più accessibili, mentre il bianco al blu mostra nucleotidi più protetti.

Ogni grado di ombreggiamento è associato a un valore numerico, che può essere tracciato come una curva di protezione e analizzato da un modello vincolante come l'equazione di Hill. In questo esempio, la costante di dissociazione di equilibrio di affiliato alla protezione da 1 5 3 a 1 5 5 è circa il doppio di quella del corrispondente valore di protezione da 1 6 3 a 1 6 4. Questo esperimento sull'impronta dei radicali idrossilati può essere eseguito in un giorno e mezzo se viene eseguito correttamente.

Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordarsi di indossare guanti e camice da laboratorio per evitare qualsiasi contaminazione da RNA. Inoltre, la concentrazione finale di ferro dipende dal sistema sperimentale. Pertanto, si consiglia di eseguire un esperimento dose-risposta prima di eseguire l'impronta seguendo questa procedura.

Altri metodi, come l'impronta del radicale idrossilato risolta nel tempo, possono essere eseguiti per rispondere a ulteriori domande. Ad esempio, in quale punto critico le molecole di RNA raggiungono una conferma mal ripiegata o attiva dopo il suo sviluppo? Questa tecnica ha aperto la strada ai ricercatori nel campo della biologia strutturale per esplorare le interazioni terziarie molecolari inter e intermedie degli acidi nucleici.

Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come determinare la formazione della struttura terziaria delle molecole di RNA. Non dimenticare che il caate e il fosforo stadio due sono precauzioni pericolose, come indossare guanti e occhiali protettivi, nonché l'uso di schermature in plexiglass sono raccomandate durante l'esecuzione di questa procedura.