Name: Cambiamenti di equilibrio nella struttura di monitoraggio RNA da perossidativi e ossidativo Footprinting radicale ossidrile (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-10-17T13:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 41 s
Description: Scopri come quantificare la formazione della struttura terziaria dell'RNA mediante footprinting con radicali idrossile. Questo metodo biochimico utilizza reagenti di Fenton e elettroforesi su gel per analizzare l'accessibilità al solvente.

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Questo lavoro è stato sostenuto dalle concessioni dal National Institute of Health RO1-GM085130 e la National Science Foundation MCB0929394. Ringraziamo il Dott. Marion Schmidt per la sua ospitalità e per averci permesso di filmare nel suo laboratorio.

1. Preparazione dei reagenti Footprinting <ol><li> Preparare un tampone di reazione 10x contenente 100 cacodilato sodio mM, 1 mM EDTA, e 1 M KCl. Regolare il pH a 7,4. Filtrare il tampone usando un dispositivo di acetato 0,2 mM filtro (Nalgene). Nota: non RNA pipettare direttamente nel buffer 10x. </li><li> Preparare la miscela di reazione di titolazione per ogni reazione, come indicato nella tabella 1. Il volume del mix di titolazione (1x buffer e Mg (II) alla concentrazione desiderata) dovrebbe essere di 90 microlitri, prima di aggiungere 10μl di RNA nel buffer 1x. </li><li> Preparare una digestione RNasi T1 tampone contenente urea 6.63M, citrato di sodio 20 mM, 1mM EDTA, 0,25 mg / tRNA microlitri, cyanol xilene 0,025%, e il blu bromofenolo 0,025%. Questo buffer può essere conservato a 4 ° C per un massimo di 6 mesi. </li><li> La reazione di Fenton richiede preparati al momento le soluzioni acquose di 250 mm Fe (NH 4) 2 (SO 4) 2, 250 mM EDTA, sodio e 500 mM L-ascorbato. Le concentrazioni osservato nel capitolo 10,5 sono ottimali per esperimenti di equilibrio in un tampone come cacodilato di sodio che non eliminano i radicali e diverse concentrazioni di ioni bivalenti. </li><li> Reagenti per la perossidazione (1.5.1) e di ossidazione (1.5.2) di reazione footprinting. <ol><li> La reazione di Fenton perossidativi richiede preparati al momento le soluzioni acquose di 100 mM Fe-EDTA soluzione di sodio e 50 mM di L-ascorbato e 1,5% di H 2 O 2. La Fe-EDTA soluzione viene preparata mescolando Fe (NH 4) 2 (SO 4) 2 con EDTA di avere 1,1 volte l'eccesso di EDTA su ferro. </li><li> Poco prima di iniziare la reazione ossidativa scissione (3.4.2), creare il mix reazione di Fenton, combinando 2 l di Fe (NH 4) 2 (SO 4) 2 (250 mm), 2,2 ml di EDTA (250 mm), 62,5 microlitri L-ascorbato di sodio (500 mm), 22,5 reazione microlitri di buffer 10x e 135,5 ml di H 2 O per raggiungere le concentrazioni finali nella miscela di reazione footprinting (3.4.2) pari a 0.10 mM, 0,11 mm e 6,61 mm, rispettivamente. </li></ol></li></ol> 2. Preparazione di RNA per Esperimento Footprinting <ol><li> L'RNA può essere prodotto da standard di trascrizione del DNA in vitro di modelli 6 o, se più corta di 50 nucleotidi, essere acquistato (ad es Integrated Technologies DNA, www.idtdna.com). Seguire le procedure di pulizia raccomandato di laboratorio per mantenere l'integrità del campione di RNA durante gli esperimenti footprinting 7. </li><li> Defosforilazione 8 di RNA trascritto in vitro è necessario prima di 32 etichettatura P del 5 'di RNA. 10 pmol di RNA sono end-etichettati da kinasing. 9 La soluzione deve essere torbida dopo il successo inattivazione della fosfatasi. </li><li> Purificare l'RNA radioattivo mediante elettroforesi su gel denaturante. L'RNA viene recuperato da due successive estrazioni gel utilizzando acetato di sodio 0,3 M (pH 5,5). RNA è precipitato mescolando 0,5 ml di soluzione acquosa con 1 ml di etanolo e successiveincubazione per 1 minuto in ghiaccio secco. Spin campione a 4 ° C, 12500 rpm per 0,5 ore. Eliminare il surnatante e lavare RNA a pellet con etanolo al 70%. Rimuovere il surnatante dopo centrifugazione ulteriore e secco di pellet nel vuoto. </li><li> Sciogliere il 32 P-etichettati campioni di RNA in 330 ul di 1x Buffer.Pipet 30 microlitri della soluzione di RNA in un tubo di reazione, precipitato con etanolo e l'RNA secco nel vuoto; tenere questo tubo per generare la scala di riferimento (punto 3.5). Denaturare la soluzione tamponata di RNA da riscaldamento a 95 ° C per 2 min. Raffreddare i campioni a temperatura ambiente per 15 minuti e dare un giro rapido per abbattere i condensati sui coperchi dei tubi di riportare in soluzione. </li></ol> 3. Il Footprinting Experiment <ol><li> Il pettine elettroforesi determina il numero massimo di punti dati per gel analitici. Noi usiamo un 30 pettine bene. La scala di riferimento occupa 2 pozzi e quello di controllo uncleaved. Preparare 27 provette di reazione. La finale Mg (II) Concentration deve essere equamente distanziati su una scala logaritmica si estende ordini di grandezza attorno al punto medio di titolazione. </li><li> Separatamente, incubare l'RNA e la (II) soluzioni Mg a 50 ° C per 5 min. Miscelare 10 ml di soluzione di RNA con 90 microlitri della corrispondente quantità di Mg (II) in 1x tampone per raggiungere un volume finale di 100 ul. Incubare le soluzioni per 30 minuti a 50 ° C. </li><li> Lasciate che le soluzioni equilibrare a 25 ° C per 1 ora, mentre si piega. </li><li> Perossidativi (3.4.1) o ossidativi (3.4.2) idrossile reazione footprinting radicale. <ol><li> Avviare la reazione di perossidazione mettendo gocce di 2 microlitri Fe-EDTA (100 mm), 2 microlitri di sodio L-ascorbato (50 mm) e 2 microlitri H 2 O 2 (1,5%), separati l'uno dall'altro nella parte superiore interna della reazione tubo contenente la soluzione di RNA e avviare la reazione di footprinting mescolando vigoroso. Arrestare la reazione dopo 15 secondi con l'aggiunta di 300 ml di etanolo assoluto freddo. Girare i tubi 3-5 volte. Precipitato, lavaggio easciugare il pellet come al punto 2.4. </li><li> Avviare il ossidativo footprintingreaction radicale ossidrile aggiungendo 5 ml di preparati al momento della miscela di reazione Fenton (1,6). Incubare per 30 min a 25 ° C. Aggiungere 300 ml di etanolo assoluto freddo per placare la reazione e mescolare girando i tubi 3-5 volte. Precipitato, lavare e asciugare il pellet come indicato al punto 2.4. </li></ol></li><li> Generare un RNasi T1 campione di riferimento digerire secondo le procedure standard 10 utilizzando la soluzione preparata al punto 1.3. </li><li> Sciogliere pellet di RNA a 8 microlitri gel colorante carico II (Ambion) e confermare l'RNA viene risospeso utilizzando il contatore Geiger. </li><li> Preparare una denaturazione, 8% gel di sequenziamento poliacrilammide secondo protocolli standard. 11 campioni di carico tra cui due riferimenti e un controllo. Separare frammenti di RNA a 60 W - 75 W per 2,5 ore. Esporre gel essiccato ad uno schermo ai fosfori durante la notte. Scansione schermo al fosforo con un sistema di imaging per autoradiografia filmless, ad esempio,. Tempesta 865 (GE Healthcare) o Typhoon (GE Healthcare). Trasferimento di file immagine di gel sul tuo computer. </li></ol> 4. Analisi dei dati <ol><li> La reattività del radicale idrossile ogni nucleotide è determinato da quantificare l'intensità di ogni banda sul gel analitici. Scaricare, installare e aprire SAFA, un facile da usare software open source per il montaggio singola banda e la quantificazione. 12, 13, seguire le istruzioni per l'uso manuale. In breve, caricare la sequenza di RNA come file. Txt seguito dalla foto come gel. Gel file. Regolare intensità di banda, definire i vicoli, scegliere una corsia di ancoraggio, ed eseguire un allineamento gel. Assegnazione di bande di nucleotidi si verifica in riferimento alla scala RNasi T1 digestione. Quantificare gli integrali banda e utilizzare la normalizzazione / colorplot funzione per normalizzare e assegnare i residui potenzialmente invarianti. Salvare l'output come file. Txt. </li><li> SAFA uscite un foglio di calcolo contenente le colonne che rappresentano corsie sul gel e le righe che rappresentano i integrated densità banda delle bande isolata corrispondente al frammento di RNA. In primo luogo, individuare i siti della protezione che mostrano un notevole cambiamento nella accessibilità al solvente confrontando il profilo di protezione deriva dalla non Mg (II) campione con il profilo del punto finale Mg (II) concentrazione (50 mM nel nostro esempio). Più basso è il valore, più protetto il nucleotide è contro l'attacco dei radicali idrossili e viceversa. </li><li> Crea isoterme pieghevole dal integrali banda normalizzata di singoli o di gruppi di nucleotidi contro Mg (II) la concentrazione. Le isoterme sono individualmente scalata a saturazione frazionale di fi = L + (U - L) • <img src="files/ftp_upload/3244/3244y.jpg" alt="Y"> dove f indica la densità integrata della band (s) oggetto di analisi, L e U rappresentano i limiti inferiore e superiore alla transizione e <img src="/files/ftp_upload/3244/3244y.jpg" alt="Y" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Y"> è la saturazione frazionale. 14 I dati sono idonei con una non-lineare lest piazza programma di analisi (si può usare o Origin (OriginLab) o GraphPad (GraphPad Software, Inc.).) all'equazione Hill (1), <img alt="Equazione 1" src="/files/ftp_upload/3244/3244eq1.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Equazione 1"> dove K d è l'equilibrio costante di dissociazione, [M] corrisponde alla concentrazione della variabile che media la reazione pieghevole, Mg (II) in questo esempio, e n H è il coefficiente di Hill. Questo scala procedura la transizione alla saturazione frazionale, determina il suo punto medio e fornisce una prova fenomenologico di se una transizione è sigmoidale. Isoterme derivati ​​dal sequenziamento gel (Figura 3A) che sono stati analizzati da SAFA (Figura 3B) e in forma, come descritto sopra sono mostrati in Figura 3C. Le isoterme di saturazione frazionale mostrato in Figura 3 sono stati generati dalla scala in un foglio i valori generati dalla SAFA migliori contro i limiti in forma superiore e inferiore (U e L), utilizzando la frazione equazione = valore / (U - L) - L / (U - L). </li></ol> 5. Rappresentante dei risultati: La figura 3 mostra i risultati rappresentante P4-P6 RNA • esperimenti footprinting OH. L'immagine gel (a sinistra) indica che a) scissione di fondo è minima (corsia di destra), b) l'assegnazione singolo nucleotide è possibile grazie alle bande ben definite nella corsia T1 (RNasi T1 si unirà ad ogni G), ec) il radicale ossidrile frammentazione indotta di RNA è ben al di sopra di fondo. Il passaggio da bassa ad alta Mg (II) è affiliato con la diminuzione della densità integrata banda di singoli e gruppi di bande indicando formazione della struttura terziaria dell'RNA. Singoli o gruppi di nucleotidi contigui la cui scissione cambiamenti in concomitanza sono indicati come una 'protezione'. Il • Protezioni OH caratteristica del Mg (II) mediata ripiegamento della P4-P6 RNA strettamente corrispondere alle regioni solvente inaccessibili della molecola osservata nella sua struttura cristallina. 15 Molecole di RNA ripiegato c uno hanno estensioni molto diverse (ad esempio, quanto vicino al fondo del declino banda densità) di protezione dei contatti terziario che non sono stati correlati con evidente fenomeno strutturale e dinamico. Così, alcune molecole di RNA mostrerà ben definite transizioni strutturali, come mostrato in Fig. 3, e altri no. Intensità di banda sono quantificati e normalizzati per SAFA 12 analisi (Figura 3B). L'uscita è un complotto 'termico' visualizzando il relativo grado di protezione contro • OH. La transizione dei colori descrive il cambiamento di accessibilità su Mg (II) aggiunta. Bianco a spettacoli rosso o blu nucleotidi più accessibile o più protetti, rispettivamente. Ogni grado di ombreggiatura è affiliato con un valore numerico che può essere tracciata una curva di protezione (Figura 3C) e analizzati da un modello di associazione come ad esempio l'equazione di Hill (1). La costante di equilibrio di dissociazione affiliato Protezione 153-155 è all'incirca doppio rispetto a quello del corrispondente valore di Protezione 163-164. CONTENUTO "&gt; <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/3244/3244fig1.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 1"> Figura 1. Produzione di radicali ossidrile e P4-P6 pieghevole RNA. A) Fe (II) catalizza la produzione di radicali idrossili da perossido di idrogeno. Ascorbato riduce Fe (III) torna a ferro ferroso. B) In assenza di Mg (II), non P4-P6 struttura terziaria è formato, permettendo di penetrare radicali idrossili e unirà tutte le posizioni spina dorsale accessibile. Aggiunta di Mg (II) avvia pieghevole del P4-P6, consentendo solo la spina dorsale solvente accessibile ad essere spaccati dai radicali idrossili. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/3244/3244fig2.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 2"> Figura 2. Schema di esperimento di footprinting radicali idrossile. A) Dephophorylation e 32 P 5'-end di etichettatura di RNA. B) Purificazione di 32 P-RNA marcato su un gel di poliacrilammide denaturante. C) Escissione di banda di RNA, dopo l'estrazione di RNA, e la precipitazione in etanolo. D) Prefolding epieghevole di RNA. E) L'aggiunta di preparati al momento miscela di reazione Fenton per generare i radicali idrossili. F) separazione frammento di RNA con elettroforesi su gel di poliacrilammide denaturante. G) La determinazione quantitativa di frammenti di RNA da un software SAFA. <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/3244/3244fig3.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 3"> Figura 3. Analisi dei frammenti di RNA dopo perossidativi reazione footprinting Fenton. (A) L'RNA è stato esposto ai radicali idrossile e prodotti di dissociazione sono stati risolti mediante elettroforesi su gel denaturante di poliacrilamide (PAGE). L'immagine mostra i prodotti di perossidazione scissione con crescente concentrazione di Mg (II). Corsie di riferimento e di controllo sono etichettati. Questo file immagine è l'ingresso per il programma SAFA che quantitates il volume di ciascuna banda. (B) La trama 'termica' generato da SAFA. (C) Un foglio di calcolo dei valori relativi densità integrata banda all'uscita numero nucleotide da SAFA è analizzato da un modello di associazione come la equati Hillsu (1). Aree di protezione sono stati scelti in base all'aumento della densità di banda integrale in funzione di Mg (II) la concentrazione. D K è la (II), Mg concentrazione alla quale è piegato metà del RNA nel sito monitorato. Il coefficiente di Hill, n H, è una misura della pendenza della curva che fornisce informazioni sulla cooperatività vincolante e fornisce una stima più bassa per il numero di ioni magnesio coinvolti nel ripiegamento di questo particolare sito. <img alt="Tabella 1" src="/files/ftp_upload/3244/3244table1.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Tabella 1"> Tabella 1. Volumi Rappresentante per la generazione di campioni di RNA contenenti differenti Mg (II) le concentrazioni.

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Nessun conflitto di interessi dichiarati.

Footprinting radicale ossidrile è uno strumento prezioso per valutare l'area solvente superficie accessibile di acidi nucleici. Formazione qualitativa e quantitativa della struttura terziaria 14 può essere seguita in funzione di parametri quali il tipo e la concentrazione di ioni, pH, temperatura, proteine ​​di legame o pieghevoli co-fattori. La combinazione vincente di un protocollo di dritto in avanti ed economico e l'accessibilità conseguente solvente e le informazioni su un pieghevole a singolo nucleotide...

<table><tbody><tr><td>Nome</td><td>Azienda</td><td>Cat#</td><td></td></tr><tr><td>Cacodilato di sodio (Attenzione! Tossico)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C4945-25g</td><td></td></tr><tr><td>EDTA (0,5 M)</td><td>Ambion</td><td>AM9260G</td><td></td></tr><tr><td>Acqua trattata con DEPC</td><td>Ambion</td><td>AM9915G</td><td></td></tr><tr><td>Acetato di sodio (3 M)</td><td>Ambion</td><td>AM9740</td><td></td></tr><tr><td>MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; (1 M)</td><td>Ambion</td><td>AM9530G</td><td></td></tr><tr><td>Urea</td><td>Ambion</td><td>AM9902</td><td></td></tr><tr><td>Citrato di sodio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>W302600</td><td></td></tr><tr><td>tRNA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R-7876</td><td></td></tr><tr><td>Sodio-L-ascorbato</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A7631-25g</td><td></td></tr><tr><td>Fe(NH&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;)&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;(SO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;)&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; · 6 H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F1543-500g</td><td></td></tr><tr><td>RNasi T1</td><td>Fermentas</td><td>EN0541</td><td></td></tr><tr><td>Perossido di idrogeno (30%)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>349887</td><td></td></tr></tbody></table>

cambiamenti di equilibrio nella struttura di monitoraggio rna da &#39;perossidativi&#39; e &#39;ossidativo&#39; footprinting radicale ossidrile

Monitoring Equilibrium Changes in RNA Structure by 'Peroxidative' and 'Oxidative' Hydroxyl Radical Footprinting

Molecole di RNA svolgono un ruolo essenziale in biologia. Oltre alla trasmissione di informazioni genetiche, l&#39;RNA può piegare in unico strutture terziarie che compie un ruolo biologico specifico come regolatore, legante o catalizzatore. Informazioni sulla formazione terziaria contatto è essenziale per capire la funzione di molecole di RNA. I radicali idrossile (OH •) sono le sonde della struttura degli acidi nucleici a causa della loro elevata reattività e piccole dimensioni. 1 Quando utilizzato come sonda footprinting, i radicali idrossili mappare la superficie solvente accessibile della dorsale fosfodiestereo di DNA 1 e 2 con RNA sottile come singolo nucleotide risoluzione. Idrossile footprinting radicale può essere utilizzato per identificare i nucleotidi all&#39;interno di una superficie di contatto intermolecolari, ad esempio nel DNA-proteina 1 e RNA-proteina complessi. Equilibrio 3 e 4 transizioni cinetica può essere determinato da condurre footprinting radicale ossidrile in funzione di una soluzione moltoil variabile o il tempo, rispettivamente. Una caratteristica fondamentale di footprinting è che l&#39;esposizione limitata alla sonda (per esempio, &#39;single-hit cinetica&#39;) i risultati nel campionamento uniforme di ogni nucleotide del polimero 5. In questo articolo il video, si usa il P4-P6 dominio del ribozima Tetrahymena per illustrare la preparazione dei campioni di RNA e la determinazione di un (II)-mediata isoterme Mg pieghevole. Descriviamo l&#39;uso del noto protocollo di idrossile footprinting radicale che richiede H 2 O 2 (chiamiamo questo il protocollo &#39;perossidativi&#39;) e un valore, ma poco noto, alternativa che utilizza naturalmente disciolto O 2 (lo chiamiamo la &#39; ossidativo &#39;protocollo). Una panoramica della riduzione dei dati, la trasformazione e procedure di analisi è presentato.

Questo protocollo descrive come quantificare il Mg (II)-dipendente formazione della struttura terziaria dell&#39;RNA con due metodi di footprinting radicali idrossili.

Cambiamenti di equilibrio nella struttura di monitoraggio RNA da &#39;perossidativi&#39; e &#39;ossidativo&#39; Footprinting radicale ossidrile

Le molecole di RNA svolgono un ruolo essenziale nella biologia. Oltre a trasmettere l'informazione genetica, l'RNA può ripiegarsi in strutture terziarie uniche che assolvono...

L'obiettivo generale del seguente esperimento è determinare come si piegano le molecole di RNA utilizzando l'impronta dei radicali idrossilici. Questo viene ottenuto mediante marcatura terminale, purificazione su gel e pre-piegamento dell'RNA, passaggi che garantiscono l'integrità conformazionale dell'RNA prima del successivo piegamento mediato dal magnesio. Successivamente, i reagenti di Fenton vengono mescolati per generare radicali idrossilici, in grado di scindere il filamento dell'RNA in base alla sua accessibilità al solvente. In seguito, i prodotti di scissione dell'RNA vengono separati mediante elettroforesi su gel di poliacrilamide denaturante e visualizzati mediante autoradiografia.Gli integrali delle bande vengono quantificati mediante un software di analisi semi-automatica basato sul footprinting. L'obiettivo finale è generare isoterme di ripiegamento che riflettano la formazione della struttura terziaria dell'RNA. Questo viene ottenuto scalando gli integrali delle bande normalizzati alla saturazione frazionaria.Le isoterme possono successivamente essere adattate all'equazione di Hill. Il vantaggio principale dell'idrossi footprinting è che si ottiene informazione sulla struttura terziaria dell'RNA utilizzando sostanze chimiche poco costose, poiché a causa della maggiore attività, i radicali idrossilici di piccole dimensioni sono sonde ideali per distinguere tra nucleotidi accessibili al solvente e quelli sepolti. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande fondamentali nel campo della biologia strutturale dell'RNA.Ad esempio, in che modo i ribosomi utilizzano gli ioni metallici per raggiungere la loro conformazione attiva? L'analisi mediante impronta del radicale idrossile può essere impiegata per comprendere i fondamenti della specificità e del riconoscimento dell'RNA. Oltre a rivelare informazioni sulla struttura terziaria dell'RNA, questo metodo può essere utilizzato per determinare i siti di legame precisi delle proteine su molecole di RNA o di DNA.I principali ostacoli di questo metodo consistono nel prevenire il degrado del campione da parte delle ribonucleasi e nell'ottimizzare la concentrazione di ferro al fine di ottenere la quantità corretta di scissione dell'RNA. Inoltre, l'analisi dettagliata degli intervalli delle bande può risultare piuttosto complessa. Il principale vantaggio di questo video è aiutare il pubblico a comprendere le fasi di pianificazione e l'esecuzione corretta dell'esperimento di footprinting con radicali idrossilici. Prima di iniziare questo protocollo, preparare tutti i reagenti per il footprinting come descritto nel protocollo scritto.In associazione a questo video, l'RNA può essere prodotto come DFO etichettati in posizione terminale e correlati, come descritto. Purificare l'RNA marcatto radioattivamente mediante elettroforesi su gel denaturante. Recuperare l'RNA purificato mediante due estrazioni consecutive del gel utilizzando acetato di sodio 0,3 molare.Quindi precipitare l'RNA mescolando 0,5 millilitri della soluzione acquosa con un millilitro di etanolo. Incubare la miscela per un minuto su ghiaccio secco. Dopo aver centrifugato il campione, eliminare il soprannatante. Lavare il pellet di RNA con etanolo al 70%.Rimuovere il soprannatante dopo un'ulteriore centrifugazione ed essiccare il pellet in vuoto. Successivamente, sciogliere i campioni di RNA purificati marcati con P 32. In 330 microlitri di buffer di reazione una volta, pipettare 30 microlitri della soluzione di RNA in un nuovo tubo di reazione.Precipitare l'RNA con etanolo, quindi essiccare il pellet in vuoto; una volta essiccato, questo pellet può essere utilizzato per generare la scala di riferimento come descritto nella procedura scritta per denaturare la soluzione di RNA rimanente mediante riscaldamento a 95 gradi Celsius per due minuti. Portare i campioni a temperatura ambiente per 15 minuti e procedere con una breve centrifugazione per riportare il condensato in soluzione. Per iniziare l'esperimento di footprinting, preparare 27 provette per reazione, in numero sufficiente a riempire un gel elettroforetico da 30 pozzetti.Dopo aver incluso i marcatori e il controllo digerito, determinare le concentrazioni finali di ioni magnesio e ferro in modo che siano equidistanti su una scala logaritmica, coprendo diversi ordini di grandezza intorno al punto medio della titolazione. La preparazione degli ioni magnesio in un buffer di reazione 1x è descritta separatamente nel testo. Incubare la soluzione di RNA e la soluzione di ioni magnesio a 50 gradi Celsius per cinque minuti. Successivamente, mescolare 10 microlitri della soluzione di RNA con 90 microlitri della corrispondente quantità di soluzione di ioni magnesio e ferro.Per raggiungere un volume finale di 100 microlitri, incubare ogni miscela per 30 minuti a 50 gradi Celsius. Successivamente, lasciare equilibrare le soluzioni a 25 gradi Celsius per un'ora mentre avviene il ripiegamento dell'RNA. Nel frattempo, immediatamente prima di avviare la reazione del footprinting con radicali idrossilici, preparare la miscela di reazione fantasma come descritto nel protocollo scritto.Preparare la reazione di perossidazione pipettando due gocce di due microlitri ciascuna di ferro EDTA, sodio ascorbato e perossido di idrogeno nella parte superiore interna del tubo da reazione contenente la soluzione di RNA, in modo che le gocce non si tocchino. Avviare la reazione di footprinting mediante miscelazione vigorosa. Dopo 15 secondi, arrestare la reazione aggiungendo 300 microlitri di etanolo puro e freddo.Ruotare le provette da tre a cinque volte. Infine, precipitare, lavare ed essiccare il pellet come eseguito in precedenza; in alternativa alla reazione ossidativa perossidativa, la reazione ossidativa di idrossilazione verrebbe eseguita aggiungendo cinque microlitri della miscela di reazione di Fenton appena preparata ai campioni. Incubare la reazione ossidativa per 30 minuti a 25 gradi Celsius.Quindi aggiungere 300 microlitri di etanolo puro e freddo per arrestare la reazione e mescolare capovolgendo i tubi. Precipitare nuovamente. Lavare e asciugare il pellet al termine della reazione perossidativa o ossidativa.Sciogliere i pellet di RNA essiccati in otto microlitri di colorante di carico per gel due. Verificare che l'RNA marcato con P 32 sia stato risospeso utilizzando un contatore Geiger; preparare un gel di sequenziamento denaturante all'8% di poliacrilamide seguendo protocolli standard. Utilizzando una pettina a 30 pozzetti, caricare i campioni, inclusi due campioni di riferimento e un controllo digerito.Separare i frammenti di RNA a 60-75 watt per due ore e mezza. Esporre il gel essiccato a una schermata fosforica per tutta la notte. Scansionare la schermata fosforica con un sistema di imaging per autoradiografia senza pellicola.Quindi trasferire il file dell'immagine del gel sul computer per l'analisi. Per iniziare l'analisi dei dati, aprire Safa, un software open source per l'adattamento e la quantificazione di singole bande. Caricare la sequenza di RNA come file di testo con estensione .txt, seguito dall'immagine del gel come file con estensione .gel.Definire le corsie e regolare le intensità delle bande. Quindi scegliere una corsia di ancoraggio ed eseguire un allineamento del gel assegnando le bande ai nucleotidi in riferimento alla scala di digestione dell'RNA T uno. Quantificare le intensità delle bande e utilizzare la funzione di normalizzazione/divisione tramite grafico a colori per normalizzare e assegnare i residui potenzialmente invarianti.Salvare l'output come file di testo. SFA genera un foglio di calcolo contenente colonne, che rappresentano le corsie del gel, e righe che rappresentano i singoli integrali delle bande corrispondenti al frammento di RNA. Innanzitutto, i siti di protezione che mostrano un cambiamento evidente nella accessibilità al solvente devono essere identificati confrontando il profilo di protezione derivato dal campione senza ioni magnesio con il profilo relativo alla concentrazione finale di ioni magnesio.Più basso è il valore, maggiore è la protezione del nucleotide dall'attacco dei radicali idrossilici e viceversa. Successivamente, creare curve di transizione dell'intensità delle bande, di singoli nucleotidi o gruppi di nucleotidi in funzione della concentrazione di ione magnesio, utilizzando un formato foglio elettronico; scalare individualmente queste transizioni alla funzione di saturazione frazionaria come descritto nella parte testuale del presente protocollo. Come passaggio finale, adattare i dati all'equazione di Hill.Questa analisi scala la transizione alla saturazione frazionaria, determina il punto medio della transizione e fornisce una verifica fenomenologica della presenza di un andamento sigmoideo. Di seguito sono riportati risultati rappresentativi di esperimenti di impronta con radicali idrossilici su RNA P quattro P sei. Le isoterme sono state derivate da gel di sequenziamento analizzati mediante Safa e successivamente adattate come descritto nella sezione di analisi.L'immagine del gel indica che il taglio di fondo è minimo e che è possibile l'assegnazione di un singolo nucleotide grazie a bande ben definite nella corsia T. La frammentazione dell'RNA indotta dai radicali idrossilici è nettamente superiore al livello di fondo. La transizione da ioni magnesio bassi ad alti è selettivamente associata a una diminuzione dell'intensità di bande singole e di gruppi di bande, indicando la formazione dell'RNA.La protezione della struttura terziaria si riferisce a singoli nucleotidi o gruppi di nucleotidi contigui il cui taglio modifica contemporaneamente le intensità delle bande, quantificate e normalizzate mediante analisi saffer. Il risultato è un grafico termico che visualizza il grado di protezione nei confronti dei radicali idrossilici. La transizione cromatica descrive la variazione di accessibilità in seguito all'aggiunta di ferro magnesiaco: dal bianco al rosso si indicano nucleotidi più accessibili, mentre dal bianco al blu si indicano nucleotidi più protetti.Ogni grado di ombreggiatura è associato a un valore numerico, che può essere rappresentato come una curva di protezione e analizzato mediante un modello di legame come l'equazione di Hill. In questo esempio, la costante di dissociazione all'equilibrio associata alla protezione da 1 5 3 a 1 5 5 è approssimativamente il doppio del valore corrispondente della protezione da 1 6 3 a 1 6 4. Questo esperimento di impronta con radicali idrossilici può essere eseguito in un giorno e mezzo se effettuato correttamente.Quando si esegue questa procedura, è importante ricordare di indossare guanti e camice da laboratorio per evitare contaminazioni da RNA. Inoltre, la concentrazione finale di ferro dipende dal sistema sperimentale. Pertanto, si raccomanda di eseguire un esperimento di risposta alla dose prima della footprinting, seguendo questa procedura.Altri metodi, come l'impronta del radicale idrossile risolta nel tempo, possono essere eseguiti per rispondere a ulteriori domande. Ad esempio, in quale momento critico le molecole di RNA raggiungono una conformazione mal ripiegata o attiva dopo il loro sviluppo? Questa tecnica ha aperto la strada ai ricercatori nel campo della biologia strutturale per esplorare interazioni terziarie intermolecolari e anche intermedie degli acidi nucleici.Dopo aver visionato questo video, dovresti avere una buona comprensione di come determinare la formazione della struttura terziaria delle molecole di RNA. Non dimenticare che caate e lo stadio di fosforo sono pericolosi; sono raccomandate precauzioni come l'uso di guanti e occhiali protettivi, oltre all'utilizzo di schermi in plexiglass durante l'esecuzione di questa procedura.

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L'ossidazione fotochimica veloce in vivo delle proteine (IV-FPOP) è una tecnica di impronta proteica radicale idrossile che consente di mappare la struttura delle proteine nel loro ambiente nativo. Questo protocollo descrive l'assemblaggio e l'impostazione del sistema di flusso microfluidico IV-FPOP.

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Monitoraggio delle dinamiche di interazione proteina-RNA in vivo ad alta risoluzione temporale utilizzando χCRAC

L'ossidazione fotochimica rapida delle proteine è una tecnica emergente per la caratterizzazione strutturale delle proteine. Diversi additivi solventi e ligand hanno varie proprietà di scavenging radicale idrossile. Per confrontare la struttura della proteina in diverse condizioni, è necessaria una compensazione in tempo reale dei radicali idrossili generati nella reazione per normalizzare le condizioni di reazione.

Abilitazione della compensazione in tempo reale nelle ossidazioni fotochimiche veloci delle proteine per la determinazione dei cambiamenti della topografia proteica

Questo protocollo presenta un metodo per utilizzare la dosimetria radicale in linea e una sorgente di luce plasmatica per eseguire l'impronta proteica di ossidazione flash. Questo metodo sostituisce il pericoloso laser UV per semplificare e migliorare la riproducibilità dell'ossidazione fotochimica veloce degli studi sulle proteine.

Impronta proteica radicale idrossile senza laser per eseguire analisi strutturali di ordine superiore delle proteine

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Identificazione di frammenti di RNA risultanti dalla degradazione enzimatica mediante spettrometria di massa MALDI-TOF

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Scopri come quantificare la formazione della struttura terziaria dell'RNA mediante footprinting con radicali idrossile. Questo metodo biochimico utilizza reagenti di Fenton e elettroforesi su gel per analizzare l'accessibilità al solvente.

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