Imaging del due-fotone calcio nei dendriti neuronali nelle fette del cervello

L'obiettivo generale di questo esperimento è studiare l'aumento del calcio nei dendriti neuronali in risposta a diversi paradigmi di stimolazione utilizzando registrazioni di patch-clamp a cellula intera nel soma neuronale in parallelo con l'imaging del calcio a due fotoni nei dendriti. Questo metodo può essere impiegato per monitorare la segnalazione del calcio in piccoli compartimenti dendritici, consentendo un'osservazione ravvicinata dei processi che si verificano nei rami dendritici durante l'integrazione degli input sinaptici. Il vantaggio principale di questa tecnica è che consente di osservare i pattern di segnalazione del calcio con un'elevata risoluzione spazio-temporale e specificità.

Posizionare il cervello del topo su una capsula di Petri contenente ACSF-saccarosio freddo e continuamente ossigenato. Per preparare fette di ippocampo dal cervello estratto, lascia raffreddare il cervello per circa due minuti. Successivamente, posiziona un pezzo di carta da filtro su una capsula di Petri ghiacciata e trasferisci il cervello sulla carta da filtro.

Quindi, seziona il cervello in due emisferi. Incollare gli emisferi sezionati su una piattaforma di sezionamento a vibratomo e immergerla nel vassoio di sezionamento riempito con ACSF-saccarosio ossigenato ghiacciato. Successivamente, sezionare fette spesse 300 micrometri a un grado Celsius utilizzando un raffreddatore a vibratomo o posizionando il ghiaccio attorno al vassoio del vibratomo.

Usando un pennello, trasferisci le fette contenenti l'ippocampo in un bagno di recupero ACSF ossigenato riscaldato a 37 gradi Celsius. In questa fase, trasferire una fetta di ippocampo in un bagno sotto l'obiettivo di un microscopio a scansione laser a due fotoni. Perfondere continuamente il bagno con ACSF-normale ossigenato.

Quindi, utilizzare la microscopia a contrasto di interferenza differenziale a infrarossi per individuare una cellula di interesse utilizzandone le dimensioni, la forma e la posizione. Successivamente, riempire una pipetta stimolante con una soluzione normale ACSF contenente il fluoroforo rosso. Abbassalo sopra la fetta in modo che la punta si trovi nella stessa regione della cella di interesse.

Successivamente, riempire la pipetta per cerotti con la soluzione per cerotti e fissarla allo stadio per la testa. Posizionalo sopra la fetta in modo che la sua punta sia direttamente sopra la cella di interesse. Successivamente, inserire una siringa nel rubinetto a tre vie e collegarla alla pipetta per cerotti attraverso un tubo di plastica.

Iniettare una pressione positiva costante nella pipetta per cerotti e mantenere il rubinetto in posizione chiusa. Quindi, apri il modulo software di controllo dell'amplificatore MultiClamp e passa alla modalità Voltage Clamp facendo clic sul pulsante VC. Aprire il software di acquisizione dati Clampex per l'elettrofisiologia per la registrazione dei segnali elettrofisiologici e fare clic sull'icona Test della membrana per inviare un impulso di tensione quadra costante per monitorare le variazioni della resistenza della pipetta.

A questo punto, abbassare la pipetta per cerotti fino a quando non si trova proprio sopra la cellula di destinazione. Al contatto con la membrana cellulare, rimuovere la pressione ruotando il rubinetto in posizione aperta. Quindi, applicare una leggera pressione negativa alla pipetta patch utilizzando una siringa vuota inserita nel rubinetto fino a quando la resistenza della pipetta raggiunge un gigaohm.

Nella finestra Test della membrana del software di acquisizione dati, bloccare la cella a 60 millivolt negativi. Continuare ad applicare una pressione negativa fino a quando la resistenza della pipetta non diminuisce e si ottiene la configurazione dell'intera cella. Nel modulo software di controllo dell'amplificatore MultiClamp, impostare la configurazione della patch su pinza amperometrica facendo clic sul pulsante IC e registrare le proprietà della membrana in risposta alle iniezioni somatiche di correnti iperpolarizzanti e depolarizzanti.

Attendere almeno 30 minuti affinché la cella si riempia con gli indicatori presenti nella soluzione di cerotto. Per acquisire le immagini, individuare un dendrite di interesse utilizzando il segnale di fluorescenza rosso. Garantire una risposta visibile scegliendo un dendrite prossimale più corto di 50 micrometri, poiché l'efficienza della retropropagazione AP può diminuire significativamente con la distanza negli interneuroni GABAergici e passare alla modalità xt.

Con i regolatori di intensità laser, impostare il laser a due fotoni a un livello di potenza minimo in cui la fluorescenza verde di base sia appena visibile, per evitare la fototossicità. Successivamente, nel software di acquisizione dati per elettrofisiologia Clampex, nella finestra di protocollo e nel software di acquisizione delle immagini, creare una prova di registrazione della durata desiderata contenente un'iniezione di corrente somatica dell'ampiezza desiderata. Successivamente, fai clic sul pulsante Avvia registrazione e acquisisci la fluorescenza continuamente per uno o due secondi.

Ripetere l'acquisizione dell'immagine da tre a 10 volte. Attendi almeno 30 secondi tra le singole scansioni per evitare fotodanni. Per registrare i transitori dendritici di calcio indotti dalla stimolazione elettrica, individuare un dendrite di interesse utilizzando il segnale di fluorescenza rossa.

Posizionare la pipetta stimolante sulla superficie della fetta sopra il dendrite di interesse. Abbassare lentamente la pipetta di stimolazione da 10 a 15 micrometri dal dendrite, riducendo al minimo il movimento per evitare di disturbare la configurazione dell'intera cellula. Per visualizzare la posizione dei microdomini sinaptici nei neuroni aspiny, nel software di acquisizione delle immagini, passare alla modalità xt e posizionare la linea lungo il ramo dendritico di interesse.

Nella finestra Protocollo, creare una prova di registrazione che attiva la stimolazione. Utilizzando il software di acquisizione, eseguire la scansione continua lungo il dendrite per uno o due secondi. Ripeti l'acquisizione da tre a cinque volte, aspettando 30 secondi tra le scansioni per evitare fotodanni.

Per ottenere informazioni preliminari sulla morfologia della cellula e tenere traccia della posizione della pipetta di stimolazione, acquisire una pila Z della cellula nel canale rosso. Utilizzando il software di acquisizione in modalità xyz, impostare i limiti superiore e inferiore dello stack per visualizzare l'intera cella con tutti i processi inclusi. Quindi, impostare la dimensione del passo a un micrometro e avviare l'acquisizione della pila utilizzando il pulsante Avvia registrazione.

Al termine dell'acquisizione dello stack Z, utilizzare l'opzione Proiezione massima nel software per sovrapporre tutti i piani focali dello stack e verificare la qualità dell'acquisizione. Quindi, ritrarre lentamente la pipetta del cerotto dalla fetta. Per fissare la fetta per l'identificazione morfologica post hoc, rimuovere rapidamente la fetta dal bagno usando un pennello e posizionarla tra due carte da filtro in una capsula di Petri riempita di ACSF.

Sostituire l'ACSF con una soluzione di paraformaldeide al 4% e lasciare il piatto a una temperatura di quattro gradi Celsius per una notte. In questa figura, la proiezione massima di uno stack Z a due fotoni mostra un interneurone patchato riempito con Alexa-594. Le punte di freccia bianche indicano la posizione dei terminali assonali all'interno dello strato piramidale, suggerendo che l'interneurone è una cellula cesto.

Questa figura mostra il ramo dendritico vicino al quale era posizionato l'elettrodo stimolante. La linea tratteggiata mostra la posizione della scansione della linea. Le immagini qui riportate illustrano il risultato di una scansione lineare nei canali rosso e verde.

L'aumento della fluorescenza verde al momento della stimolazione indica un aumento della concentrazione di calcio in quell'area. Le immagini possono essere raggruppate in segmenti più piccoli, consentendo l'analisi della diffusione della risposta. Le tracce qui viste mostrano i transitori di calcio suscitati in diversi segmenti in risposta alla stimolazione elettrica registrata a livello somatico durante la prova di imaging.

L'ampiezza dei transitori di calcio diminuisce con la distanza dall'hotspot centrale, indicando che la risposta è localizzata spazialmente. Seguendo questa procedura, è possibile eseguire altri metodi come l'imaging dei coloranti sensibile alla tensione o l'optogenetica per rispondere a ulteriori domande, come i cambiamenti locali nel potenziale di memoria all'interno dei rami dendritici o l'integrazione di input specifici. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come monitorare le fluttuazioni del calcio dipendenti dall'attività nei dendriti neuronali utilizzando una combinazione di tecniche optofisiologiche, che saranno utili per esplorare le complessità dell'integrazione e della plasticità degli input dendritici.