Name: Imaging del due-fotone calcio nei dendriti neuronali nelle fette del cervello (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-03-15T13:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 35 s
Description: Impara l'imaging del calcio a due fotoni nei dendriti neuronali nelle fette acute di ippocampo di topo. Questa tecnica combina patch-clamp e imaging per studiare l'integrazione sinaptica con alta risoluzione spaziotemporale.

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Questo lavoro è stato supportato dal Consiglio canadese istituti di ricerca sulla salute, scienze naturali e ingegneria ricerca (NSERC Discovery Grant) e la Fondazione di Savoia. OC è stato sostenuto da una borsa di studio di dottorato di ricerca da NSERC.

Tutti gli esperimenti sono stati eseguiti conformemente agli orientamenti del Comitato di protezione animale Université Laval e del Consiglio canadese su Animal Care sul benessere degli animali.
1. preparazione preliminare (opzionale: preparare 1 giorno in anticipo)
<ol><li>Preparare tre tipi di liquido cerebrospinale artificiale (ACSF) soluzione (normale, saccarosio e soluzioni di recupero, 1L; si veda tabella 1). Regolare l'osmolalità delle soluzioni a 300 ± 10 mOsm25 e raffreddare il saccarosio ACSF giù un punto vicino allo zero (0-4 ° C). Nota: L'uso di una soluzione di taglio basso-sodio (ACSF-saccarosio) aiuta a preservare la vitalità dei neuroni negli strati superficiali di fettine acute26.</li>
	<li>Preparare 0,75 mL di soluzione di patch contenente un fluoroforo rosso (ad es., Alexa-594) e un indicatore verde sintetico calcio (ad es., Oregon Green BAPTA-1; si veda tabella 1). Includono biocitina (Vedi tabella 1) nella soluzione di patch se post hoc, identificazione morfologica delle cellule registrate è necessario.</li>
	<li>Regolare l'osmolarità della soluzione a 280 ± 5 mOsm e pH a 7,35 ± 0,5. Conservare la soluzione in frigorifero o su ghiaccio in ogni momento. Nota: Scelta dell'indicatore del calcio dovrebbe essere basata sulla sua gamma dinamica e la natura degli esaminatori Ca2 + eventi.</li>
	<li>Utilizzando un estrattore micropipetta, preparare pipette patch dai vasi capillari di vetro borosilicato (Vedi Tabella materiali) con una punta di 2 µm ≈ (pipetta resistenza di 3-5 MΩ) e stimolazione pipette da capillari di teta-vetro borosilicato (Vedi tabella di Materiali) con una punta di 2-5 µm. Nota: Le impostazioni di estrattore per rendere pipette di un determinato diametro e la forma saranno determinate dal tipo di filamento di estrattore e i risultati del test di rampa per un determinato tipo di vetro.</li>
</ol>2. hippocampal fetta preparazione
<ol><li>Anestetizzare il mouse (P13-20; il ceppo e sesso del mouse è determinata dalla questione sperimentale affrontata) con 1 mL di isoflurane collocata su un tovagliolo di carta all'interno di una camera di narcosi per inalazione. Quando l'animale è anestetizzato, come evidenziato da una mancanza di movimento e respirazione lenta, rimuoverlo dalla camera di narcosi e decapitare utilizzando una ghigliottina.</li>
	<li>Esporre il cranio tagliando la pelle con un piccolo paio di forbici dalla parte posteriore del cranio al naso. Utilizzare un piccolo paio di Pinze ossivore mini osso per fare un buco a livello di bregma. Quindi utilizzare le forbici per fare un taglio caudale--rostrale lungo la sutura sagittale. Con le Pinze ossivore afferrare sul retro di ogni lembo di cranio e ascensore verso l'alto e verso l'esterno per rimuovere il teschio che coprono ogni emisfero.</li>
	<li>Dopo che il cervello è completamente esposto, inferiori a quelli dei nervi ottici con una spatolina. Rimuovere il cervello dal cranio e metterlo in una capsula di Petri contenente continuamente ossigenato, freddo ACSF-saccarosio (Vedi tabella 1 per la concentrazione di saccarosio).<ol>
<li>Se il tessuto da più vecchi topi è richiesto, eseguire una perfusione intracardiaca usando una siringa (25G) riempita con 20 mL di gelida ACSF-saccarosio prima dell'estrazione del cervello per ottenere fette di buona qualità.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Preparare fette hippocampal del cervello animale estratti.<ol>
<li>Posizionare un pezzo di carta da filtro su una piastra di Petri ricco di ghiaccio, trasferire il cervello sulla carta da filtro, lasciare che il freddo di cervello per circa 2 min. Sezionare i due emisferi.</li>
		<li>Incollare gli emisferi dissecati (l'orientamento è determinato dallo scopo sperimentale per ottenere fette di coronale, trasversale o orizzontale) su una tabella del vibratome e immergetelo nel vassoio vibratome riempito con gelida ossigenato ACSF-saccarosio. Fare 300 µm fette spesse ad una temperatura di circa 1 ° C utilizzando un dispositivo di raffreddamento del vibratome o mettendo il ghiaccio intorno il vassoio del vibratome.</li>
		<li>Utilizzando un pennello piatto, si accumulano le fette contenente l'ippocampo (fino a 6 fette per emisfero) in un bagno contenente ossigenato ACSF-recupero riscaldato a 37 ° C.</li>
		<li>Lasciare le fette nel bagno ACSF-recupero per almeno 45 min.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. cellule intere Patch-clamp registrazioni
<ol><li>Impostare una fetta hippocampal in posto in un bagno posizionato sotto l'obiettivo (ingrandimento: 40x, apertura numerica: 0.8) di un microscopio a due fotoni scansione laser. Irrorare continuamente il bagno con ossigenato ACSF-normale riscaldata a 30-32 ° C a una velocità di 2,5-3 mL/min.</li>
	<li>Utilizzare contrasto differenziale di interferenza a infrarossi (IR-DIC) o microscopia Dodt-SGC per individuare una cella di interesse utilizzando la dimensione, la forma e la posizione. Nota: A seconda della popolazione mirata del neurone, un modello di topo transgenico può essere utilizzato per individuare facilmente le celle di interesse. In questo caso, questo passaggio può essere sostituito con l'uso di una fonte di luce fluorescente.</li>
	<li>Riempire una pipetta di stimolazione con una soluzione di ACSF-normale che contiene il fluoroforo rosso (ad es., Alexa-594).</li>
	<li>Impostare la pipetta di stimolazione (collegata a un'unità di stimolazione elettrica) sopra la fetta in modo che la punta è nella stessa regione come la cellula di interesse.</li>
	<li>Dopo aver compilato la pipetta patch con soluzione di patch e allegarlo ad una fase di testa, impostarlo sulla fetta in modo che la sua punta è direttamente sopra la cella di interesse.</li>
	<li>Inserire una siringa un rubinetto a tre vie e collegarlo al patch-pipetta attraverso il tubo di plastica. Iniettare una pressione positiva costante nella pipetta patch (≈ 0,1 mL) usando la siringa. Tenere il rubinetto in posizione "close".</li>
	<li>Attivare il modulo di software di controllo amplificatore e passare alla modalità tensione-morsetto cliccando sul pulsante "VC". Aprire il software di acquisizione dati di elettrofisiologia (ad esempio, clampex) per l'acquisizione di segnali elettrofisiologici e cliccare sull'icona "Membrana Test" di averlo continuamente invia un impulso di tensione quadrati (5 mV, 10 ms), che è necessario monitorare cambiamenti nella resistenza pipetta.</li>
	<li>Abbassare la pipetta patch fino a quando non è proprio sulla cima della cella mirata. Al momento di fare contatto con la membrana cellulare, rimuovere la pressione ruotando il rubinetto nella posizione "aperta". Nota: Il contatto con la membrana cellulare viene rilevato quando un piccolo aumento nella resistenza pipetta (≈ 0.2 MΩ) è visto e una piccola rientranza sulla cella è causata da pressione positiva.</li>
	<li>Esercitare una leggera pressione negativa per la pipetta patch usando una siringa vuota nel rubinetto fino a quando la resistenza di pipetta fornita dal software raggiunge 1 GΩ. Nella finestra 'Membrana Test' dei software di acquisizione dati, fissare la cella a -60 mV.</li>
	<li>Continuare ad applicare pressione negativa fino a quando la cella viene aperta e la configurazione di cellule intere è raggiunto. Rilevamento di questo stato della cellula si basa sull'improvviso cambiamento nella resistenza pipetta (da 1 GΩ a MΩ 70-500 a seconda del tipo di Interneurone) e la comparsa di grandi capacitivi transitori nella finestra 'Membrana Test'.</li>
</ol>4. due-fotone Ca2 + Imaging
<ol><li>Se ti interessa le risposte postsinaptiche eccitatori, aggiungere il gabazine di blocco del recettore GABAA (10 µM) e il blocco del recettore GABAB CGP55845 (2 µM) nel bagno ACSF.</li>
	<li>Nel modulo amplificatore software di controllo, impostare la configurazione di patch al corrente-morsetto cliccando sul pulsante "CC" e registrare schema di attivazione della cellula in risposta alle iniezioni somatiche di depolarizzanti corrente (0.8-1.0 nA, 1 s). Aspettare almeno 30 minuti per la cella per essere riempito con gli indicatori presenti nella soluzione patch. Nota: Schema di attivazione della cellula e la proprietà attive possono essere utilizzate per identificare il sottotipo della cella; per esempio, cellule fast-chiodare. È importante per la concentrazione di indicatore stabilizzare attraverso diffusione prima di avviare la registrazione gatti (Vedi tabella 2 per la risoluzione dei problemi).</li>
	<li>AP-evocato gatti<ol>
<li>Utilizzando il software di acquisizione immagini, avviare l'acquisizione delle immagini. Individuare un dendrite di interesse utilizzando il segnale di fluorescenza rossa. Per garantire una risposta visibile, in primo luogo, scegliere un dendrite prossimale (≤ 50 µm) come l'efficienza di AP backpropagation può diminuire in modo significativo con distanza di interneuroni GABAergici22.</li>
		<li>Utilizzando lo strumento rettangolare nel software di acquisizione immagini, ingrandire la regione di destinazione e passare per il "xt" (linescan) modalità. Posizionare la scansione attraverso il ramo dendritico di interesse. Con i controllori di intensità laser del software di acquisizione, è necessario impostare il laser del due-fotone ad un livello di potenza minimo cui fluorescenza verde della linea di base è solo leggermente visibile, per evitare di fototossicità.</li>
		<li>Nel software di elettrofisiologia per la acquisizione di dati software di acquisizione di finestra e l'immagine di «Protocollo», creare una registrazione di prova della durata desiderata contenente un'iniezione di corrente somatica dell'ampiezza desiderata.<ol>
<li>Utilizzando il software di acquisizione immagini, fare clic sul pulsante "Start record" e acquisire la fluorescenza continuamente per 1-2 s. Ripetere l'acquisizione dell'immagine 3 - 10 volte. Attendere almeno 30 s tra singole scansioni per evitare photodamage. Se l'acquisizione di scansioni in più punti lungo un dendrite, portarli in ordine casuale per evitare effetti di ordine.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
	<li>Sinapticamente-evocato gatti<ol>
<li>Individuare un dendrite di interesse utilizzando il segnale di fluorescenza rossa.</li>
		<li>Impostare la pipetta di stimolazione sulla superficie della fetta sopra il dendrite di interesse. Abbassare lentamente la pipetta di stimolazione in posizione, riducendo al minimo movimento per evitare di disturbare la configurazione di cellule intere. Posizione la pipetta a 10-15 µm dal dendrite.</li>
		<li>Per visualizzare la posizione di microdomini sinaptici nei dendriti di Soma, il software di acquisizione immagine passare ai 'xt' (linescan) modalità e posizionare la linea lungo il ramo dendritico di interesse.</li>
		<li>Nella finestra 'Protocollo' (di software di acquisizione dati di elettrofisiologia) e software di acquisizione immagini, creare un processo di registrazione che attiva l'unità di stimolazione dopo l'inizio della prova.</li>
		<li>Utilizzando il software di acquisizione, fare clic sul pulsante "Start record" per eseguire la scansione lungo dendrite continuamente per 1-2 s. Repeat acquisizione 3 - 5 volte, in attesa di 30 s tra le scansioni per impedire il photodamage. Nota: La lunghezza di scansione può essere regolata a seconda della cinetica dell'evento evocati, ma deve essere ridotto al minimo per impedire il photodamage (Vedi tabella 2 per la risoluzione dei problemi).</li>
		<li>Ripetere il passaggio 4.5.5 in condizioni diverse (ad esempio, diversa intensità/durata della stimolazione, l'introduzione di un blocco farmacologico, ecc.) a seconda della specifica domanda affrontata.</li>
		<li>Interrompere l'acquisizione quando la cella Mostra segni di deterioramento della salute: depolarizzazione sotto -45 mV, aumento della linea di base livello di Ca2 + , deterioramento morfologico dei dendriti (ad es., blebbing, frammentazione; Vedi tabella 2 per la risoluzione dei problemi).</li>
		<li>Per ottenere informazioni preliminari sulla morfologia della cella e tenere traccia della posizione della pipetta stimolazione, acquisire uno Z -stack della cella nel canale del rosso. Utilizzando il software di acquisizione in 'xyz' modalità, impostare i limiti superiore e inferiore dello stack per l'intera cella di immagine con tutti i processi inclusi. Dimensionare la ' passo ' a 1 µm e avvia l'acquisizione dello stack utilizzando il pulsante "Start record".</li>
		<li>Quando la Z-stack acquisizione è completo, utilizzare l'opzione di "Proiezione massima" nel software per sovrapporre tutti i piani focali dello stack e verificare la qualità di acquisizione. Quindi, ritirare lentamente la pipetta patch fuori la fetta.</li>
		<li>Per correggere la fetta per post hoc, identificazione morfologica, rapidamente rimuovere la fetta dal bagno utilizzando un pennello piatto e posizionarlo tra due fogli di carta filtro, in una capsula di Petri ACSF-riempito. Sostituire il ACSF con una soluzione di paraformaldeide (PFA) di 4% e lasciare il piatto in una camera di 4 ° C o in frigorifero durante la notte.</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. esame immuno-istochimico per Post Hoc identificazione morfologica delle cellule registrate
Nota: Dopo 1 notte della fissazione in PFA, la fetta può essere conservata in tampone fosfato (PB) con sodio azide (0,5%) per fino a 1 mese.
<ol><li>Mettere la fetta in soluzione salina tamponata (TBS) con Triton X-100 (0,3%) ed effettuare 4 lavaggi (5-10 min).</li>
	<li>Mettere la fetta in TBS-Triton 0,3% con 10% siero di capra normale (NGS) per 1 h.</li>
	<li>Mettere la fetta in TBS-Triton 0,3% con 1% NGS ed un fluoroforo streptavidina coniugata (ad es., Alexa Fluor 546-coniugato streptavidina, 1: 200) per incubazione di notte.</li>
	<li>Lavare 4 volte (5-10 min) in TBS.</li>
	<li>Montare fette su vetrini da microscopio e immagine utilizzando un microscopio confocale. Per una ricostruzione completa delle cellule, acquisire un Z-stack (passo dimensioni: 1 µm) utilizzando un obiettivo 20x. Per l'imaging di un'etichetta di Alexa-546-coniugato, utilizzare che un laser a 543 nm e una rilevazione di 515-560 nm filtro impostato.</li>
</ol>6. analisi dei gatti
<ol><li>Estrarre i valori di fluorescenza da regioni di interesse (ROI) nelle immagini linescan dai canali rossi e verde e media dei valori delle ripetizioni multiple per ogni condizione per ridurre il rumore. Nota: Quando acquisizione linescan viene eseguito lungo dendrite, è possibile estrarre dati da ROIs multipli, che possono corrispondere a dendritiche microdomini (2-5 µm), e consentendo così lo studio della compartimentazione di segnale Ca2 + .</li>
	<li>Per ogni ROI, esprimere le variazioni di Ca2 + ampiezza come: <img alt="Equation" src="/files/ftp_upload/56776/56776eq1.jpg"> Nota: Qui G è il valore di fluorescenza dal canale verde; G0 è il valore di fluorescenza di base dal canale verde durante il periodo di pre-stimolazione; R è il valore di fluorescenza dal canale rosso18. Come eccitazione del due-fotone è altamente localizzato e non genera un significativo background, sottrazione di fluorescenza di fondo non è necessario.</li>
</ol>

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<li>Aghajanian, G. K., Rasmussen, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intracellular+studies+in+the+facial+nucleus+illustrating+a+simple+new+method+for+obtaining+viable+motoneurons+in+adult+rat+brain+slices%5BTitle%5D)+AND+%22Synapse%22%5BJournal%5D)">Intracellular studies in the facial nucleus illustrating a simple new method for obtaining viable motoneurons in adult rat brain slices.</a> Synapse. 3, 331-338 (1989).</li>
<li>Pettit, D. L., Wang, S. S., Gee, K. R., Augustine, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemical+two-photon+uncaging%3A+anovel+approach+to+mapping+glutamate+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Chemical two-photon uncaging: anovel approach to mapping glutamate receptors.</a> Neuron. 19, 465-471 (1997).</li>
<li>Salomé, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultrafast+random-access+scanning+in+two-photon+microscopy+usingacousto-optic+deflectors%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Methods%22%5BJournal%5D)">Ultrafast random-access scanning in two-photon microscopy usingacousto-optic deflectors.</a> J Neurosci Methods. 154, 161-174 (2006).</li>
<li>Lechleiter, J. D., Lin, D. T., Sieneart, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multi-photon+laser+scanning+microscopy+using+an+acoustic+optical+deflector%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">Multi-photon laser scanning microscopy using an acoustic optical deflector.</a> Biophys J. 83, 2292-2299 (2002).</li>
</ol>

Gli autori hanno nessun concorrenti interessi finanziari o altri conflitti di interesse.

Il metodo illustrato di seguito viene illustrato l'utilizzo della combinazione del due-fotone Ca2 + imaging ed elettrofisiologia di patch-clamp per lo studio dendritiche Ca2 + segnalazione nei dendriti neuronali nelle fette del cervello acuto. Questo metodo consente per il monitoraggio di entrambi i locali Ca2 + prospetti evocati da AP elettrici di stimolazione o backpropagating in segmenti dendritiche e risposta somatica della cella. Questo lo rende un ottimo strumento per studiare come ...

Il contributo di un neurone per attività di rete è in gran parte determinato dalla natura dinamica degli ingressi sinaptici che riceve. Tradizionalmente, il metodo predominante di caratterizzare l'attività sinaptica nei neuroni è invocata da registrazioni di intero-cellula somatica patch clamp di correnti postsinaptiche evocate da stimolazione elettrica degli assoni di passaggio. Tuttavia, unica attività delle sinapsi prossimalmente trova veritiero è segnalato in questo caso1. Inoltre, per valutare i meccanismi specifici di sinapsi, registrazioni da coppie di neuroni e da dendriti in una posizione specifica sono state utilizzate per indirizzare le sinapsi di interesse e i meccanismi di integrazione dendritiche, rispettivamente. Un importante passo avanti nel campo della fisiologia sinaptica è stato realizzato attraverso un connubio di tecniche ottiche ed elettrofisiologiche. Microscopia (2PLSM) in combinazione con Ca2 + imaging e optogenetica strumenti a scansione laser di eccitazione del due-fotone può rivelare dettagli tremende dell'organizzazione dinamica dell'attività sinaptica alle connessioni neuronali specifiche nelle fette del cervello in vitro ed in vivo.
Parecchi vantaggi chiave ha reso 2PLSM risaltare dalla microscopia convenzionale, uno-fotone eccitazione2: (1) a causa di una natura non lineare del due-fotone eccitazione, la fluorescenza viene generata solo nel volume focale, e rappresentano tutti i fotoni emessi segnali utili (senza bisogno di foro di spillo); (2) lunghezze d'onda, utilizzato in 2PLSM, penetra il tessuto di dispersione in modo più efficiente; Inoltre, sparsi i fotoni sono troppo diluiti per produrre eccitazione del due-fotone e fluorescenza di fondo; (3) photodamage e fototossicità sono limitate al piano focale. Di conseguenza, nonostante l'alto costo dei sistemi di 2 fotoni rispetto ai convenzionali microscopi confocali, il 2PLSM rimane un metodo di scelta per le indagini ad alta risoluzione della struttura neuronale e funzione nel tessuto vivente spessa.
La prima applicazione del 2PLSM nel tessuto di scattering è stato all'immagine della struttura e la funzione delle spine dendritiche3. 2PLSM in combinazione con Ca2 + formazione immagine ha rivelato tale funzione di spine come compartimenti biochimici isolati. Poiché in molti tipi di un neurone c'è una corrispondenza univoca tra spine e singole sinapsi4, due-fotone Ca2 + imaging presto divenne un utile strumento di reporting dell'attività delle singole sinapsi in tessuto intatto5, 6,7,8. Inoltre, 2PLSM-Ca2 + l'imaging basato su è stato usato con successo per monitorare l'attività dei canali del calcio singolo e le interazioni non lineari tra le conduttanze intrinseche e sinaptiche, nonché di valutare lo stato - e attività-dipendente regolamento del Ca2 + segnalazione nei dendriti neuronali5,6,7,8,9,10,11.
Il calcio è un secondo messaggero intracellulare onnipresente, e relativa organizzazione subcellulare spatiotemporal determina la direzione di reazioni fisiologiche, da cambiamenti nella forza sinaptica del regolamento dello ione di canali, crescita dendrite e della colonna vertebrale, come così come la morte delle cellule e la sopravvivenza. Dendritiche Ca2 + quote altimetriche si verificano attraverso l'attivazione di vie multiple. Potenziali di azione (APs), backpropagating per i dendrites, aperto tensione-gated del calcio canali12 e produrre relativamente global Ca2 + transitori (gatti) in dendriti e spine13. Trasmissione sinaptica è associata con l'attivazione di postsinaptica Ca2 +-permeabili recettori (NMDA, Ca2 +-permeabile AMPA e kainato), attivazione sinaptica gatti6,14,15. Infine, gli eventi possono Ca2 + possono essere generati nei dendriti sotto determinate circostanze11,12,13,16.
Si avvale di due fotoni Ca2 + imaging in combinazione con le registrazioni elettrofisiologiche patch clamp sintetico Ca2 +-sensibili indicatori fluorescenti, che in genere sono trasportati attraverso l'elettrodo di patch durante le registrazioni della intero-cellula . Un metodo standard per la quantificazione delle dinamiche2 + Ca è basato sul doppio indicatore metodo17,18. Utilizza due fluorofori con spettri di emissione ben separati (ad esempio, una combinazione di un rosso Ca2 +-insensibile tintura verde Ca2 + indicatori, quali Oregon Green BAPTA-1 o Fluo-4) e ha diversi vantaggi rispetto alla Metodo unico indicatore. Prima di tutto, a Ca2 +-insensibile colorante viene utilizzato per individuare piccole strutture di interesse (rami dentritici e spine) dove verrà eseguita Ca2 + formazione immagine. In secondo luogo, il rapporto tra la variazione di fluorescenza verde e rosso (ΔG/R) viene calcolato come una misura di [Ca2 +], che è in gran parte insensibile ai cambiamenti di fluorescenza della linea di base a causa di fluttuazioni [Ca2 +]017 , 18. Inoltre, i cambiamenti di fluorescenza possono essere calibrati in termini assoluti Ca2 + concentrazioni19.
Una preoccupazione generale durante l'esecuzione di due fotoni Ca2 + imaging esperimenti in fettine acute è la salute delle cellule e la stabilità dell'acquisizione immagine a causa della laser ad alta potenza in genere utilizzata. Inoltre, in esperimenti di Ca2 + imaging, c'è preoccupazione per la perturbazione e sostanza sovrastima del servizio subcellulare2 + dinamiche per Ca dovuta al fatto che fungono da indicatori di Ca2 + altamente mobile esogeno Ca2 + buffer. Così, la scelta dell'indicatore di Ca2 + e la sua concentrazione dipende il tipo di un neurone, l'ampiezza prevista dei gatti e la questione sperimentale.
Abbiamo adattato il metodo di due fotoni Ca2 + imaging per indagine di Ca2 + fluttuazioni nei dendriti dei neuroni GABAergici interneuroni9,10,11,20,21 , 22. mentre la maggior parte del Ca2 + imaging gli studi iniziali sono stati fatti nei neuroni principali, interneuroni inibitori mostrare una varietà grande di Ca2 + meccanismi funzionali che sono distinti da quelli a cellule piramidali20 , 23 , 24. questi meccanismi di Interneurone specifici (ad es., Ca2 + permeabili i recettori AMPA) possono svolgere ruoli specifici nel regolare l'attività delle cellule. Mentre dendritiche Ca2 + segnalazione in interneuroni è un obiettivo allettante per ulteriori indagini, due-fotone Ca2 + imaging nei dendriti di queste cellule presenta sfide aggiuntive, da un diametro più sottile dei dendriti e la mancanza di spine per una particolarmente elevato Ca2 + associazione capacità endogena. Come la nostra ricerca interessi riguardano lo studio di interneuroni hippocampal, il seguente protocollo, mentre applicabili a differenti popolazioni neuronali, è stato adattato per affrontare queste sfide.
Questo protocollo è stato eseguito con un microscopio a due fotoni confocale commerciale, che era dotato di due rivelatori esterni, non descanned (NDDs), modulatore elettro-ottico (EOM) e un Dodt scansione contrasto sfumatura (SGC) e installato su un tavolo ottico. Il microscopio è stato accoppiato con un laser di multiphoton costituita mode-locking a 800 nm (> 3 W, 140 fs legumi, tasso di ripetizione di 80 Hz). Il sistema di imaging è stato dotato di un impianto di perforazione di elettrofisiologia standard, tra cui una camera di aspersione con controllo della temperatura, una piattaforma di traduzione con due micromanipolatori, un amplificatore microelettrodo computerizzato, un digitalizzatore, una stimolazione unità e software di acquisizione dati.

<table><tbody><tr><td>Ceppo animale: Topo CD1</td><td>Charles River</td><td>022</td><td></td></tr><tr><td>Isoflurano</td><td>AbbVie Corporation</td><td>0B506-099</td><td></td></tr><tr><td>CGP 55845 cloridrato</td><td>Abcam</td><td>ab120337</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro di calcio&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C4901</td><td></td></tr><tr><td>D-(+)-Glucosio&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G8270</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3375</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro di magnesio&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M8266</td><td></td></tr><tr><td>Solfato di magnesio eptaidrato</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>230391</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldeide in polvere, 95%</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>158127</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro di potassio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P3911</td><td></td></tr><tr><td>Gluconato di potassio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P1847</td><td></td></tr><tr><td>Sodio azide&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S2002</td><td></td></tr><tr><td>Bicarbonato di sodio&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S8875</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro di sodio&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S5886</td><td></td></tr><tr><td>Saccarosio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S9378</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100&nbsp;</td><td>Base Sigma-Aldrich</td><td>T9284</td><td></td></tr><tr><td>Trizma</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T1503</td><td></td></tr><tr><td>Trizma cloridrato&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T3253</td><td></td></tr><tr><td>Sodio fosfato bibasico diidrato&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>71643</td><td></td></tr><tr><td> Sodio fosfato monobasico monoidrato&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S9638</td><td></td></tr><tr><td>Biocitina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B4261</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 594 Idrazide</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>A10438</td><td></td></tr><tr><td>SR95531 (Gabazina)&nbsp;</td><td>Abcam</td><td>ab120042</td><td></td></tr><tr><td> Adenosina trifosfato (ATP)-Tris</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9062</td><td></td></tr><tr><td> Guanosina (GTP)-Na+</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G8877</td><td></td></tr><tr><td> Oregon Green BAPTA-1</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>O6812</td><td></td></tr><tr><td> Fosfocreatina di(tris) sale</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P1937</td><td></td></tr><tr><td> Coniugato con streptavidina Alexa-546</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>S11225</td><td></td></tr><tr><td> Capillari in vetro borosilicato patch</td><td>World Precision Instruments</td><td>1B100F-4</td><td></td></tr><tr><td> Capillari in vetro borosilicato Theta</td><td>Strumento</td><td>Sutter BT-150-10</td><td></td></tr><tr><td> P-97 Estrattore per micropipette fiammato/marrone</td><td>Strumento Sutter</td><td></td><td></td></tr><tr><td> TCS SP5 Microscopio confocale multifotone</td><td>Leica Microsystems</td><td></td><td></td></tr><tr><td> Chameleon Ultra II Ti:Laser multifotone zaffiro&nbsp;</td>Software <td>di</td><td></td><td></td></tr><tr><td>acquisizione immagini LAS AF coerente Regolatore</td> di temperatura <td>Leica Microsystems</td><td></td><td></td></tr><tr><td> TC-324B</td><td>Warner Instruments</td><td></td><td></td></tr><tr><td> MultiClamp 700B Amplificatore</td><td>Molecular Devices</td><td></td><td></td></tr><tr><td> Digidata 1440A Digitizer</td><td>Molecular Devices</td><td></td><td></td></tr><tr><td> Confocal Traduttore</td><td>Siskiyou</td><td></td><td></td></tr><tr><td> Micromanipolatore</td><td>Siskiyou</td><td></td><td></td></tr><tr><td> pClamp Software di acquisizione dati</td><td>Molecular Devices</td><td></td><td></td></tr><tr><td> A365 Isolatore di stimolo a corrente costante</td><td>World Precision Instruments</td><td></td><td></td></tr><tr><td> Vibraplane Sistemi</td><td>cinetici</td><td></td><td></td> da tavolo ottico</tr></tbody></table>

imaging del due-fotone calcio nei dendriti neuronali nelle fette del cervello

Two-photon Calcium Imaging in Neuronal Dendrites in Brain Slices

La formazione immagine del calcio (Ca2 +) è un potente strumento per studiare la dinamica spazio-temporale di Ca2 + segnali intracellulari nei dendriti neuronali. CA2 + fluttuazioni possono verificarsi attraverso una varietà di meccanismi intracellulari e di membrana e svolgono un ruolo cruciale nell'induzione di plasticità sinaptica e nella regolazione dell'eccitabilità dendritiche. Quindi, la possibilità di registrare diversi tipi di Ca2 + segnali in rami dentritici è preziosa per gruppi studiano come dendriti integrano informazioni. L'avvento della microscopia del due-fotone ha reso tali studi significativamente più facile risolvendo i problemi inerenti all'imaging in tessuto vivo, come ad esempio la dispersione della luce e photodamage. Inoltre, attraverso la combinazione di tecniche elettrofisiologiche convenzionale con due fotoni Ca2 + imaging, è possibile indagare locale Ca2 + le fluttuazioni nei dendriti neuronali in parallelo con le registrazioni di attività sinaptica Soma. Qui, descriviamo come utilizzare questo metodo per studiare la dinamica locale Ca2 + transitori (gatti) nei dendriti di interneuroni inibitori GABAergici. Il metodo può essere applicato anche allo studio dendritiche Ca2 + segnalazione in diversi tipi di un neurone in fettine di cervello acuto.

Utilizzando il protocollo presentato qui, abbiamo ottenuto gatti evocati mediante iniezione di corrente somatica e da stimolazione elettrica nei dendriti di oriens/alveus interneuroni nella zona CA1 dell'ippocampo. Dopo la patch di un neurone, identificato basata sulla sua forma e la posizione, abbiamo acquisito scansioni attraverso un dendrite prossimale in più punti al dato Distanze dal soma (Figura 1A). Abbiamo osservato una diminuzione dell'ampiezza dei g...

Presentiamo un metodo che unisce le registrazioni della intero-cellula patch-clamp e due-fotone imaging per registrare transitori di Ca2 + nei dendriti neuronali nelle fette del cervello acuto.

Imaging del due-fotone calcio nei dendriti neuronali nelle fette del cervello

Calcium (Ca2+) imaging is a powerful tool to investigate the spatiotemporal dynamics of intracellular Ca2+ signals in neuronal dendrites. Ca2+ ...

L'obiettivo generale di questo esperimento è studiare l'aumento del calcio nei dendriti neuronali in risposta a diversi paradigmi di stimolazione utilizzando registrazioni di patch-clamp a cellula intera nel soma neuronale in parallelo con l'imaging del calcio a due fotoni nei dendriti. Questo metodo può essere impiegato per monitorare la segnalazione del calcio in piccoli compartimenti dendritici, consentendo un'osservazione ravvicinata dei processi che si verificano nei rami dendritici durante l'integrazione degli input sinaptici. Il vantaggio principale di questa tecnica è che consente di osservare i pattern di segnalazione del calcio con un'elevata risoluzione spazio-temporale e specificità.Posizionare il cervello del topo su una capsula di Petri contenente ACSF-saccarosio freddo e continuamente ossigenato. Per preparare fette di ippocampo dal cervello estratto, lascia raffreddare il cervello per circa due minuti. Successivamente, posiziona un pezzo di carta da filtro su una capsula di Petri ghiacciata e trasferisci il cervello sulla carta da filtro.Quindi, seziona il cervello in due emisferi. Incollare gli emisferi sezionati su una piattaforma di sezionamento a vibratomo e imm

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Per capire le dinamiche della rete di microcircuiti nella neocorteccia, è essenziale per registrare contemporaneamente l'attività di un gran numero di neuroni. In vivo a due fotoni di imaging del calcio è l'unico metodo che permette di registrare l'attività di una densa popolazione neuronale con cella singola risoluzione.

In Vivo 2-Photon Imaging di calcio a livello 2 / 3 dei topi

Attività spontanea di sviluppare le reti neuronali può essere misurato con AM-estere forme di calcio-sensibili coloranti indicatore. Variazioni di calcio intracellulare, indicando l'attivazione neuronale, vengono rilevati come variazioni transitorie della fluorescenza indicatore con uno o due fotoni di imaging. Questo protocollo può essere adattato per una serie di reti neuronali...

Calcio Imaging funzionale nello sviluppo di reti corticali

In questo protocollo, che aggiorniamo i recenti progressi nel campo dell'imaging...

Calcio Risposte imaging in neuroni GFP-tagged fette di cervello di topo ipotalamici

Una tecnica di imaging per il monitoraggio dei cambiamenti potenziale di membrana con una risoluzione spaziale sub-micrometrica e sub-millisecondo temporale è descritta. La tecnica, sulla base di eccitazione del laser di tensione-sensibili coloranti, consente misure di segnali in assoni e assoni collaterali, rami terminali dendritiche, e singoli spine dendritiche.

Tensione sensibile registrazione Dye da assoni, dendriti e spine dendritiche dei singoli neuroni in fettine di cervello

Questo video dimostra un protocollo per la registrazione di patch-clamp su cellule intere e l'imaging del calcio a due fotoni in fette di ippocampo cerebrale. Questo metodo permette di studiare la dinamica dei transienti locali di Ca2+ (CaT) in dendriti di diversi tipi neuronali in fette cerebrali acute.

Stabilire una configurazione a cellula intera per l'imaging del calcio a due fotoni di fette di cervello

Vengono descritte le procedure per eseguire registrazioni simultanee del potenziale o della corrente di membrana e delle variazioni della concentrazione intracellulare di calcio. I neuroni del nucleo soprachiasmatico vengono riempiti con l'indicatore di calcio bis-fura-2 utilizzando un elettrodo patch clamp nella configurazione patch clamp dell'intera cellula.

Registrazione elettrofisiologica simultanea e imaging del calcio dei neuroni del nucleo soprachiasmatico

L'imaging time-lapse nell'animale vivente fornisce informazioni preziose sulla riorganizzazione strutturale nel cervello intatto. Qui, introduciamo una preparazione di cranio assottigliato che consente l'imaging transcranico di strutture sinaptiche marcate in fluorescenza nella corteccia di topo vivente mediante microscopia a due fotoni.

Two-Photon<em&gt; In vivo</em&gt; Imaging di spine dendritiche nella corteccia mouse Uso un teschio Diluito-Preparazione

Descriviamo la combinazione di focale indotta da UV foto-attivazione di composti neuro-attivi con whole-cell patch-clamp e multi-Photon Imaging di transitori di sodio intracellulari in dendriti e spine di neuroni ippocampali in fettine di tessuto acute del cervello di topo.

Multi-fotone intracellulare di sodio Imaging Combinato con UV-mediata uncaging focale di glutammato in neuroni piramidali CA1

Qui, descriviamo un protocollo che combina l'iniezione di virus adeno-associato con l'impianto di finestre craniche per l'imaging simultaneo delle dinamiche microgliali e dell'attività neuronale nei topi svegli.

Imaging simultaneo delle dinamiche microgliali e dell'attività neuronale in topi svegli

I metodi attuali descrivono un approccio non raziometrico per l'imaging subcompartimentale del calcio ad alta risoluzione in vivo in Caenorhabditis elegans utilizzando indicatori di calcio geneticamente codificati prontamente disponibili.

Imaging subcellulare della manipolazione neuronale del calcio in vivo

Impara l'imaging del calcio a due fotoni nei dendriti neuronali nelle fette acute di ippocampo di topo. Questa tecnica combina patch-clamp e imaging per studiare l'integrazione sinaptica con alta risoluzione spaziotemporale.

Imaging del due-fotone calcio nei dendriti neuronali nelle fette del cervello

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