Bloccare Registrazioni patch da neuroni della retina del mouse in un Dark-adattato Preparazione Slice

La nostra esperienza visiva inizia quando il pigmento visivo nei nostri fotorecettori retinici assorbe fotoni di energia luminosa, portando infine alla chiusura dei canali ciclici nucleotidici nella membrana cellulare. Questo sopprime il rilascio del neurotrasmettitore glutammato sia dai bastoncelli che dai coni. Il glutammato rilasciato viene rilevato dalle cellule retiniche a valle per studiare i segnali a valle.

Gli occhi vengono rimossi da un topo soppresso. Gli S vengono isolati, incorporati in un blocco di agar e affettati utilizzando un microtomo vibrante. Successivamente, le fette di retina vengono poste al microscopio e stimolate con illuminazione a LED.

Mentre le registrazioni del patch clamp vengono effettuate per misurare le correnti sinaptiche o i potenziali generati. In generale, le persone che non conoscono questo metodo avranno difficoltà a causa delle complessità aggiuntive del lavoro al buio. Quindi, essere in grado di visualizzare l'intero processo fornirà una sensazione altrimenti difficile da descrivere.

Iniziare questa procedura rivestendo gli elettrodi a filo di registrazione e di riferimento che verranno utilizzati con uno strato di cloruro d'argento. Immergere gli elettrodi in un molare di cloruro di sodio. Quindi, utilizzando una fonte di alimentazione a 15 volt con un'onda sinusoidale da un hertz, 15 volt tra di loro per circa 20 secondi.

Utilizzando un micro estrattore per pipette, preparare le pipette per cerotti in vetro di silice BO lucidato a fuoco, scegliendo una resistenza della punta della pipetta in base alle dimensioni delle cellule bersaglio per corpi cellulari di circa 20 micron di diametro. Utilizzare un tubo in PET con una resistenza della punta da cinque a 10 mega ohm per i corpi delle celle. Dopo circa cinque micron di diametro, utilizzare una resistenza della punta da 12 a 15 mega ohm.

Per preparare gli elettrodi di riferimento rettificati, utilizzare una siringa per riempire il tubo di polietilene con una soluzione di agar al 3,5% preparata in un millimolare di cloruro di sodio. Successivamente, preparare le seguenti soluzioni secondo le istruzioni nel protocollo scritto allegato. Soluzione per affettare la soluzione del bagno esterno, la soluzione interna della pipetta con aspartato di potassio e il backstop dell'agar.

Conservare tutte le soluzioni a quattro gradi Celsius fino a quando non sono necessarie. Il giorno dell'esperimento, Thor circa 1,5 millilitri di soluzione interna di aspartato di potassio. Quindi aggiungere il Fluor diluito.

Versare circa 50 millilitri di terreno di coltura contenente bicarbonato di sodio nel contenitore a tenuta stagna. Collegare il tubo di plastica a un serbatoio del gas contenente il 5% di anidride carbonica e il 95% di ossigeno per bilanciare il mezzo di mira con il gas, quindi posizionare il contenitore in un bagno d'acqua a 30-32 gradi Celsius. Successivamente, riempi una bottiglia con 110 millilitri di mira, media contenente i piselli e mettila sul ghiaccio.

Equiparare il mezzo facendo gorgogliare la soluzione con ossigeno gassoso al 100%. Posizionare il terreno di coltura rimanente contenente bicarbonato di sodio in un serbatoio riscaldato sopra la gabbia di Faraday. Avvolgere il paraform attorno al tubo e al tappo della bottiglia per intrappolare il gas nello spazio sopra la soluzione ed equilibrare con il 5% di anidride carbonica e il 95% di ossigeno gassoso.

Utilizzando un tubo di dispersione dell'aria in vetro, preparare il 3% di bassa temperatura di gelificazione aggiungendo 0,75 grammi a 25 millilitri di mezzo di mira con cumuli di calore. La soluzione è di circa 115 gradi Celsius mescolando. Quando la soluzione diventa limpida senza bolle, mettere la soluzione di agar fusa in un bagnomaria a 42 gradi Celsius.

Impostare la camera di registrazione sul microscopio invertito. Far scorrere un ponte di agar di cinque centimetri sull'elettrodo di riferimento in argento e cloruro d'argento e posizionarlo nella camera di registrazione. La resistenza della punta della pipetta può essere misurata riempiendo una pipetta con una soluzione interna, posizionandola sul supporto della pipetta, inserendo il supporto della pipetta nello stadio della testa dell'amplificatore e abbassando la pipetta in soluzione per preservare il pigmento visivo per le registrazioni fisiologiche, tutte le procedure devono essere eseguite sotto la luce infrarossa utilizzando occhiali a infrarossi, ma tutte le procedure verranno mostrate qui alla luce della stanza.

Dopo che il topo è stato soppresso, usa le forbici curve per rimuovere rapidamente gli occhi. Posiziona gli occhi su un pezzo di carta da filtro per evitare che rotolino. Quindi tieni un occhio in posizione con una pinza e usa una lama sottile a doppia faccia per fare una fessura nella cornea.

Non appena il bulbo oculare viene perforato. Trasferire l'occhio in una capsula di Petri da 60 millimetri riempita con il mezzo di mira. Usando la fessura nella cornea come punto di ingresso, usa piccole forbici per tagliare via le parti rimanenti della cornea.

Quindi rimuovere il cristallino e l'umor vitreo, assicurandosi che la retina rimanga attaccata alla conchiglia oculare. Mettilo in un contenitore leggero e ermetico pieno di obiettivi. Mezzo equilibrato con il 5% di anidride carbonica e il 95% di ossigeno a 32 gradi Celsius.

Successivo hemis sec. Una delle conchiglie oculari utilizzando una lama di bisturi numero 10. Separare la retina dall'epitelio pigmentato retinico.

Rimuovi i bordi della retina per consentire al tessuto di rimanere piatto. Usa una piccola pipetta di vetro per la pasta con un bulbo di lattice per riempire una piastra di Petri da 35 millimetri con agar fuso a bassa temperatura di gelificazione e trascina le pinze attraverso l'agar per testarne la consistenza. Una volta che l'agar inizia a solidificarsi, trasferisci la retina nella parte superiore dell'agar.

Quindi, senza toccare la retina, usa un pezzo attorcigliato di salvietta Kim per assorbire la soluzione in eccesso attorno ad essa. Metti altre due o tre gocce di agar direttamente sulla retina e posiziona rapidamente un cilindro di plastica per formare una parete attorno ad esso mantenendo la retina vicino al centro del cilindro, gocciola in ulteriore agar fuso, trasferisci la capsula di Petri in un bagno di acqua ghiacciata per raffreddarla. Dopo 30 secondi, rimuovere il tessuto e utilizzare uno stantuffo per estrudere il blocco di agar, spingendo dal lato più lontano dalla retina.

Utilizzare una lama di rasoio unilaterale per ritagliare un piccolo blocco di agar contenente la retina e incollare il blocco in posizione contro il backstop dell'agar sul disco del campione. Trasferire il disco del campione sull'albero del microtomo vibrante e versare cumuli di punte ghiacciate nell'albero, consentendo al blocco con la retina di essere completamente sommerso. Tagliare fette di retina con uno spessore di circa 200 micron utilizzando la massima velocità di vibrazione della lama con una velocità della lama in avanti impostata in modo tale che occorrano dai quattro ai cinque secondi per tagliare la retina. Una volta.

Usa una lama di bisturi numero 11 per tagliare ogni fetta utilizzabile dal blocco una alla volta. Posizionare le fette contenenti la retina nelle camere di registrazione e tenerle premute. Utilizzando gli ancoraggi a fette, i fili di nylon che attraversano l'ancoraggio a fette.

Tieni premuto l'agar che circonda la retina, lasciando la retina libera. Per le registrazioni. Trasferire la camera di registrazione sul tavolino del microscopio verticale.

Chiudere la tenda e accendere la fonte di luce a infrarossi per visualizzare la fetta su una telecamera sensibile agli infrarossi. Al microscopio, identificare una fetta di retina con fotorecettori intatti all'angolo di taglio appropriato. Alcuni danni alla superficie possono essere evidenti a causa del processo di affettatura.

Utilizzando una pipetta con la punta rotta, aspirare delicatamente i corpi cellulari morti Per rimuovere questo sottile strato di cellule, una volta rivelato uno strato sano di cellule vive, identificare un corpo cellulare la cui posizione si trova negli strati di interesse. Spostare la punta della pipetta in modo che increspata la membrana cellulare e applicare una pressione delicata, negativa o verso l'interno per ottenere una tenuta ad alta resistenza. La modalità cella intera può essere ottenuta applicando una pressione negativa all'elettrodo per entrare nella cella.

Successivamente, stimola il tessuto retinico con la luce utilizzando i LED per evocare le risposte. Al termine della registrazione, acquisire un'immagine utilizzando la luce di eccitazione appropriata per il Fluor che si è dializzato nella cellula dalla soluzione interna della pipetta. Qui, vengono mostrati i potenziali evocati dalla luce di un neurone retinico scuro adattato a lampi di luce di forza crescente.

Questa figura è un'immagine a fluorescenza presa da una fetta di retina in cui le cellule sono state riempite con la fluorescenza evocata gialla Fluor Lucifer mostra la morfologia delle cellule da cui sono state effettuate le registrazioni dei patch. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una migliore comprensione di alcune delle complessità della realizzazione di registrazioni patch clamp da fette di retina adattate al buio. L'obiettivo di questa procedura è misurare le risposte evocate dalla luce in condizioni di illuminazione controllata.

Per fare ciò, dobbiamo prima isolare la retina, incorporarla nella coclea e quindi preparare fette di retina da cui possiamo effettuare registrazioni di singole cellule.