Name: Metodi per la registrazioni Morsetto capacità patch dal Calyx (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2007-07-29T00:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 58 s
Description: Impara le tecniche di registrazione patch clamp presinaptica al calice di Held nel sistema nervoso centrale dei mammiferi. Questo metodo consente di studiare i meccanismi di rilascio dei neurotrasmettitori con precisione elettrofisiologica.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Patch Morsetto di installazione: Ottica: Le ottiche sono molto importanti per trovare un buon cellulare, e di stabilire la posizione di esso. Cercare di ottenere un&#39;immagine chiara delle cellule: spigoli vivi, morbida dall&#39;aspetto delle cellule. Scansione tutto il campo per cercare una buona cellule MNTB principale con calice allegato. Ruotare piatto per cercare calici da diverse angolazioni. In un primo momento, va bene la pratica sul palloncino a forma di terminale. Scegli cellule sulla superficie della fetta, o nello strato 2 ° cell. Obiettivo il primo 1 / 3 ° di cellulare con pipetta Identificare calici: Cercare una doppia membrana (vedi Figura 1), e ruotare il piatto fetta di vederlo da diverse angolazioni per aiutare a confermare che si tratta di un calice. <img src="/files/ftp_upload/old/244_2008_8_22_2/244_Figure-01.png" alt="Figura 1" width="298" height="159" /> Figura 1 Profondità di calice: calice dovrebbe essere sulla superficie o il più vicino alla superficie possibile. Superficie disponibile per l&#39;applicazione di patch: Utilizzare messa a fuoco manopola sul microscopio per determinare come &quot;larghezza / profondità&quot; il calice è. Per esempio, ~ 10% di un giro completo sulla messa a fuoco fine vi darà più di una superficie sufficiente per cerotto sulla. Di tenuta su una cellula presinaptica: Per arrivare alla cella collegata, cercare una deformazione &quot;piccolo&quot; sulla superficie delle cellule a causa della pressione pos (~ 0.15psi) nella pipetta, usare manipolatore per eseguire pipetta su, giù e su, e anche in la superficie del terminale presyn per ottenere una deformazione buona, poi rilasciare la pressione di aspirazione e di applicare, se e quando necessario. PULSE, acquisizione dati del programma: Necessità di aumentare la dimensione del buffer prima del primo utilizzo, e ad ogni richiesta la capacità di campionamento. Bisogno di caricare le macro modificato ogni volta. Potenziale di giunzione liquida: soluzione di registrazione Presyn è-11mV (11mV negativo). Presyn: Cslow = ~ 15 pF Rs comp per presyn: 10 msec, il 65% (più l&#39;indennità possibile w / out oscillazioni) Prima di capacità di registrazione: relax Corrente di prova (10 mV, 10 msec salto) per vedere se il relax è monoesponenziale, cioè se presyn termine può essere modellato da un unico vano. Filtri: Situato a 30 kHz e 10 kHz (filtro di Bessel 1 e 2) durante la misurazione di rilassamento, per assicurarsi un componente veloce non è lasciato sfuggire. Durante le registrazioni mini, Xinsheng usato 10 kHz e 5 kHz. LGW mi ha chiesto di utilizzare solo filtro 1 fissato a 30 kHz per assicurarsi che possiamo misurare tempo di salita di mini. I file di denominazione: 7 cifre 000mmxx, dove mm è il mese (o mese e anno) e xx è il numero delle cellule. Pulizia Linee Soluzione: Linee pulite a fine esperimento con 20 ml di HCl 0,1 M seguita da 200 ml ddH2O. Soluzioni per esterni vengono riciclati, velocità della pompa è di 20-30 giri al minuto. (Soluzione di ritorno dalla camera bagno rifluisce nel cilindro graduato). Istituito 3 linee in uscita per garantire la sufficiente aspirazione. Aggiunta della soluzione di Presinaptico di registrazione: ~ 310 millisecondi osmolare Soluzione Presyn deve essere ~ 310 mOsm per impedire l&#39;accesso R-aumentare nel corso dell&#39;esperimento. Presyn soluzione pipetta è diverso da postsyn pipetta soluzione (Presyn è ATP e GTP ad es.). TTX-TEA Solution (per isolare le correnti Ca): <ul><li> Tenta di applicare dopo la chiusura, o anche patch, sul cellulare, come TEA in blocchi soluzione K-canali e depolarizza la cellula. Questo non è buono per la cellula. Per lo stesso motivo, potrebbe non essere possibile riutilizzare la fetta dopo TTX è applicato. </li><li> Confrontare la risposta prima e l&#39;ultima della cellula, o slice per verificare eventuali effetti di depolarizzazione prolungata. </li><li> TTX viene utilizzato a 1 micron invece di 0,5 mM quindi l&#39;effetto è più veloce. Bisogno di aspettare meno tempo dopo aver cambiato le soluzioni. </li></ul> Fette di taglio Vibratome impostazioni: <ul><li> 70Hz vibrazioni laterali </li><li> Ampiezza: 1,0 mm </li><li> Velocità di avanzamento 0,01-0,02 mm / sec, mentre il taglio fette con calice, 0,1 altrimenti spessore: 180 micron (~ 150micron di animali più vecchi) </li></ul> Fette di incubare a 37 ° C per 1 ora (include il tempo di taglio), cioè, lasciare a bagno 15-20 minuti dopo il taglio. Pipette: Presyn: 3,5-4,5 MΩ in un primo momento, 3,0-3,5 MΩ quando si sentono più sicuri Uso manuale estrattore per impostare le impostazioni. Utilizzare la funzione di ritardo perché il vetro è di spessore (ritardo di 200 o 1 lavoro) Tipo di vetro: borosilicato, parete standard, nessun filamento Diametro esterno: 2,0 mm Diametro interno 1,16 millimetri Lunghezza: 7,5 cm

metodi per la registrazioni morsetto capacità patch dal calyx

Methods for Patch Clamp Capacitance Recordings from the Calyx

Dimostriamo le tecniche di base per la registrazione presinaptico patch clamp al calice di Held, un mammifero terminali nervosi del sistema nervoso centrale. Registrazioni elettrico dal terminale presinaptico consentire la misurazione dei potenziali d&#39;azione, correnti dei canali del calcio, fusione delle vescicole (esocitosi) e l&#39;assorbimento della membrana successivi (endocitosi). La fusione di vescicole contenenti neurotrasmettitori provoca la membrana delle vescicole da aggiungere alla membrana cellulare del calice. Questo aumento della quantità di membrana cellulare è misurato come un aumento della capacità. La conseguente riduzione di capacità indica endocitosi, il processo di assorbimento della membrana o la rimozione dalla membrana calice. Endocitosi, è necessario mantenere la struttura del calice ed è anche necessario formare vescicole che verrà riempito di neurotrasmettitore per esocitosi eventi futuri. Registrazioni capacità al calice di Held hanno permesso di misurare direttamente e rapidamente rilascio vescicolare e endocitosi successivo in un nervo terminale nervoso centrale dei mammiferi. Inoltre, la corrispondente attività postsinaptica possono essere contemporaneamente misurata utilizzando le registrazioni appaiati. Così un quadro completo dell&#39;attività presinaptica e postsinaptica elettrica presso una sinapsi del sistema nervoso centrale è realizzabile utilizzando questa preparazione. Qui, i metodi di preparazione fetta, caratteristiche morfologiche per l&#39;identificazione dei calici di Held, tecniche di patch di base di fissaggio, ed esempi di registrazioni capacità di misurare esocitosi e endocitosi sono presentati.

Metodi per la registrazioni Morsetto capacità patch dal Calyx

Dimostriamo le tecniche di base per la registrazione patch-clamp presinaptica nel calice di Held, un terminale nervoso del sistema nervoso centrale di un mammifero. ...

Ciao, mi chiamo Ken Paradiso. Lavoro per Ling Gang Wu presso il programma intramurale dell'Istituto Nazionale dei Disturbi Neurologici e dell'Accidenti Cerebrovascolari, situato presso il NIH nel campus di Bethesda. Vi mostrerò le tecniche per la registrazione presinaptica con blocco del potenziale d'azione mediante patch-clamp.Per preparare il tessuto cerebrale, rimuoviamo il cervello dal ratto. Poniamo il cervello all'interno di questa soluzione, che deve essere fredda con ghiaccio e a basso contenuto di calcio, e la saturiamo con carbogeno per garantire un costante apporto di ossigeno al cervello. Inoltre, la soluzione deve essere mantenuta fredda con ghiaccio per minimizzare il DA, riducendo al minimo il danno subito.Il cervello si troverebbe ora in questa soluzione. Lo si estrae, lo si taglia in modo appropriato in modo da poterlo posizionare sul blocco, fissandolo al blocco con Sano correlate o colla istantanea, quindi si riempie la camera con una soluzione fredda di ghiaccio a basso contenuto di calcio, la si ossigena, la si posiziona sul vibratome e successivamente si tagliano sezioni di spessore compreso tra 180 e 190 micron, con una frequenza della lama di 70 hertz e una

methods-for-patch-clamp-capacitance-recordings-from-the-calyx

Research

Ricerca

JoVE Journal

Biology

Biologia

Questo è inteso come una introduzione alla registrazione di patch clamp da ovociti di Xenopus laevis. Esso copre la rimozione della membrana vitellina, la formazione di un sigillo gigaohm (gigaseal), e la conversione facoltativa delle patch al di fuori-out topologia.

Patch di registrazione pinza dei canali ionici Espressa in ovociti di Xenopus

Corrente ionica dei canali BK è registrato utilizzando tecniche di patch clamp. Canali BK sono espressi...

Patch clamp e Tecniche di perfusione per la valutazione dei canali ioni Espresso in Xenopus Ovociti

Forniamo un passo-passo protocollo per la cellula intera registrazione patch clamp di calcio Release-Activated di calcio (CRAC) correnti in cellule mononucleate del sangue periferico derivati ​​linfociti T umani.

Whole-Cell Registrazione del calcio Release-Activated di calcio (CRAC) Correnti in Human Linfociti T

Qui descriviamo un protocollo per la preparazione di agar-embedded fette della retina che sono adatti per elettrofisiologia e Ca2 + imaging. Questo metodo permette di studiare nastro di tipo sinapsi in microcircuiti della retina mediante diretta patch-clamp registrazioni dei singoli terminali nervosi presinaptici.

Patch-clamp Misure di capacità e Ca 2 + Imaging terminazioni nervose della retina singola in Fette

Questo protocollo descrive una tecnica chiamata elettrofisiologia del patch clamp a cellula intera, che è un metodo per studiare le proprietà elettriche dei neuroni di Mauthner e di altre cellule reticolospinali negli embrioni di zebrafish.

Elettrofisiologia del Patch Clamp a cellula intera: un metodo per studiare le proprietà elettriche dei neuroni

Abbiamo sviluppato una preparazione intatto midollo cerebrale-spinale per registrare e monitorare l'attività elettrica tramite registrazione patch clamp da neuroni e altre cellule Mauthner reticulospinal in embrioni di zebrafish. Quindi, siamo in grado di registrare le correnti sinaptiche eccitatorie e inibitorie, attività del canale voltaggio-dipendente e potenziali d'azione dai neuroni chiave in un embrione in via di sviluppo.

Bloccare Registrazioni patch da cellule embrionali Zebrafish Mauthner

Qui viene descritta una procedura per ottenere lunghi tratti di registrazione corrente da un canale ionico con la tecnica patch-clamp cell-attached. Questo metodo permette di osservare, in tempo reale, il modello di apertura-chiusura conformazioni di canale che stanno alla base del segnale biologico. Questi dati informano sulle proprietà dei canali nelle membrane biologiche inalterate.

Un canale Cell-allegato patch-clamp registrazione

Dopo l'esocitosi, la membrana plasmatica fusa viene recuperata attraverso un processo noto come endocitosi. Questo meccanismo riforma le nuove vescicole sinaptiche per il successivo ciclo di rilascio. I singoli eventi endocitici vengono catturati e analizzati attraverso l'uso delle registrazioni della capacità attaccata alle cellule nelle cellule cromaffini surrenaliche di topo.

Metodi per cellulari-attached Misure di capacità in mouse surrenale cromaffini cellulare

Il presente protocollo descrive un metodo efficiente per l'acquisizione dinamica e in tempo reale delle correnti del canale del potassio voltaggio-dipendente (Kv) nei cardiomiociti H9c2 utilizzando la tecnica patch-clamp dell'intera cellula.

Registrazione della corrente di potassio voltaggio-dipendente su cardiomiociti H9C2 tramite la tecnica del patch-clamp a cellule intere

Questa è una guida per modificare la forma di micropipette di vetro. In particolare, utilizzando il calore e la pressione dell'aria la conicità è allargato senza aumentare l'apertura punta, con conseguente minore resistenza pipetta. Questo è fondamentale per ottenere registrazioni a basso rumore di piccole cellule, ma è utile in molte applicazioni.

Pressione lucidatura Pipette per una migliore patch-clamp di registrazione

Impara le tecniche di registrazione patch clamp presinaptica al calice di Held nel sistema nervoso centrale dei mammiferi. Questo metodo consente di studiare i meccanismi di rilascio dei neurotrasmettitori con precisione elettrofisiologica.

Metodi per la registrazioni Morsetto capacità patch dal Calyx

Esplora altri video