Metodi per la registrazioni Morsetto capacità patch dal Calyx

Ciao, mi chiamo Ken Paradiso. Lavoro per Ling Gang Wu presso il National Institute of Neurological Disorders and Stroke Intramural program, che si trova presso il NIH nel campus di Bethesda. Sto per mostrarvi le tecniche per il caly hanno tenuto la registrazione presinaptica Patch clamping.

Quindi, per preparare il tessuto cerebrale, rimuoviamo il cervello dal ratto. Mettiamo il cervello all'interno di questa soluzione, che sarebbe ghiacciata, a basso contenuto di calcio, e gorgoglierebbe con carbogeno per assicurarci che ci sia un rifornimento di ossigeno al cervello in ogni momento. E deve anche essere ghiacciato per ridurre al minimo la DA, per ridurre al minimo la quantità di danni.

Quindi il cervello si troverebbe ora in questa soluzione. Lo estrarremo, lo taglieremmo in modo appropriato in modo che possa essere messo sul blocco, montato sul blocco con Sano correlate o colla pazza, ma riempiremo la camera con una soluzione ghiacciata a basso contenuto di calcio, la bollicineremo, la posizioneremo sul vibratore e poi taglieremo le fette a 180-190 micron di spessore a una frequenza della lama di 70 hertz e una velocità avanzata in avanti da 0,01 a 0,02 millimetri per secondo. Quindi sarebbero da 10 a 20 micron al secondo.

Una volta preparata ogni fetta, trasferiamo le fette dalla soluzione salina ghiacciata a questa camera, che contiene una normale soluzione di calcio. Questa è la stessa soluzione con cui registriamo ed è a 37 gradi di temperatura fisiologica. Quindi mettiamo le fette qui per il recupero.

Rimane qui per mezz'ora o un'ora prima che vengano eseguiti gli esperimenti di fisiologia. Quindi qui ho il cervello e lo tirerò fuori dalla soluzione. Quindi questo è un cervello più grande a scopo dimostrativo.

Questo è di un ratto P 20. Lo gireremo. È il tronco cerebrale che ci interessa.

Quindi quest'area qui sotto e il calice hanno tenuto è proprio in quell'area proprio lì. Quindi quello che faremo è tagliare il resto del cervello, isolare il tronco encefalico e quindi preparare il tronco encefalico per la camera di affettatura. Ok, quindi taglieremo il resto del cervello isolando il tronco encefalico.

Lo girerò per dimostrare a che punto siamo. Normalmente non lo faremmo in questo modo e, ancora una volta, possiamo semplicemente sbarazzarci di tutta quella porzione. Rigirandolo, abbiamo isolato il tronco encefalico e stiamo semplicemente facendo un altro taglio proprio lì.

Ok, questo è tutto. Questo è il tronco cerebrale. Il calice di held è proprio lì e lì.

Questo è il tronco encefalico. Ancora una volta, lo sposteremo un po'. Taglieremo un lato del cervelletto e questo permetterà al tronco encefalico di sedersi lateralmente in questo modo.

Abbiamo messo un po' di colla acrilica Sano e, tenendola posata lateralmente, la riempiamo rapidamente con ghiaccio freddo, soluzione fredda a basso contenuto di calcio. Metti la linea dell'ossigeno lì il prima possibile. Ora lo prendiamo e lo portiamo al vibrato.

Lo portiamo velocemente per arrivare all'inizio del cervello, e poi, una volta arrivati all'inizio del cervello, abbassiamo la velocità a 0,01 millimetri al secondo. Quindi sono 10 micro al secondo. Quindi si sta muovendo a un ritmo incredibilmente lento.

La prima parte del cervello è, è la parte che ha la mtb, che è il Nilo mediale del corpo trapezoidale. E questa è la parte che contiene il, ok, quindi una volta che l'ho nella pipetta di trasferimento, cerco di portarla il più vicino possibile alla punta della pipetta. E c'è la fetta del cervello e la trasferisco piuttosto rapidamente in questa camera, che contiene una soluzione di registrazione standard che è livelli normali di calcio e anche una temperatura più alta.

E questo permetterà alle fette di riprendersi dopo le procedure di affettatura che sono pronte dagli esperimenti di fisiologia. Ok, quindi da qui in poi, sarà la stessa cosa più e più volte. La seguente attrezzatura è ciò che utilizzerò per eseguire il bloccaggio dei patch.

Abbiamo un microscopio verticale a tavolino fisso. Il tavolino è fisso, come ho detto, quindi il microscopio si muove sotto di esso da un manipolatore. Usiamo una parrucca e un micro manipolatore Newman per tenere il palco, lo stadio principale dell'amplificatore, usiamo un amplificatore patch clamp EPC 10 di heca.

E quello che avrei dovuto menzionare è che usiamo DIC con la luce infrarossa. Quindi abbiamo una telecamera IR qui, e quindi tutto ciò che vediamo sarà visto sullo schermo quando cercheremo i CAE. L'amplificatore patch clamp è controllato da questo software, che si chiama Pulse, che è anche, che è anche di Heca, e controllerà l'amplificatore e tutto l'esperimento di fisiologia.

I risultati verranno visualizzati in questa schermata. Il caly have held è un grande terminale presinaptico e, poiché è grande, ci permette di applicare fisicamente il patch al terminale. Quindi possiamo fare registrazioni presinaptiche e questa è una cosa unica, specialmente nel SNC.

Questo ci permette quindi di misurare i canali del calcio attivati presinapticamente. Inoltre, possiamo anche misurare l'attività del potenziale d'azione se volessimo stimolare il nervo che porta al calice. Quello che facciamo in questo laboratorio è misurare un processo chiamato esocitosi, che è la fusione di vescicole che contengono neurotrasmettitore con la membrana.

Ora, in quelle vescicole si fondono con la membrana nel processo chiamato esocitosi, aggiungono membrana al terminale sinaptico, e possiamo misurarlo come un cambiamento nella capacità. Otterremo un aumento della capacità man mano che la membrana viene aggiunta al terminale in modo che, quindi gli esperimenti che mostrerò oggi sono misure di capacità, presinapticamente quando la membrana viene rimossa. Quindi non puoi semplicemente continuare ad aggiungere membrana, ovviamente devi rimuoverne un po'.

Questo processo è chiamato endocitosi o captazione della membrana. Possiamo anche misurarlo e questo sarà misurato come una diminuzione del livello di capacità e mostreremo esempi di ciò in seguito. Ora, ciò che questo ci permette di fare è monitorare l'attività dei canali del calcio e anche monitorare alcune delle proteine coinvolte nell'esocitosi e nell'endocitosi e studiarle.

Possiamo inserire cose come i peptidi per bloccare le proteine coinvolte nell'esoo o nell'endocitosi. Possiamo anche usare tossine che fanno la stessa cosa. Possiamo anche regolare la quantità di calcio che entra nel terminale, in modo da poter davvero studiare il processo di esocitosi, il rilascio di neurotrasmettitore e l'assorbimento della membrana che segue quell'evento.

Questo è il tubo che contiene la nostra soluzione di registrazione intracellulare. Lo prepariamo in anticipo e poi lo congeliamo e di solito possiamo usarlo per diverse settimane o un mese prima di dover creare una nuova soluzione. Ancora una volta, abbiamo pensato subito prima di fare le nostre registrazioni, e ci sarà sempre una certa quantità di particelle di polvere o altri tipi di detriti che entreranno nel tuo tubo.

Puoi fare una delle due cose. Puoi estrarre la soluzione e filtrarla, oppure puoi farla girare per un minuto o due e poi estrarre la soluzione, lasciando una parte inferiore che conterrebbe detriti e altro materiale al suo interno. Quindi preferisco girarlo e lo farò subito.

Quindi questo è il tubo che contiene la nostra soluzione intracellulare. È scongelato. Lo faremo girare per circa due o tre minuti in una piccola centrifuga, e questo dovrebbe essere sufficiente per estrarre eventuali particelle di polvere di grandi dimensioni dalla soluzione.

Quindi ora tolgo la parte superiore, la soluzione che abbiamo appena filato, facendo attenzione a non agitarla, trasferendola in un tubo pulito, e ne tolgo circa il 90%. Cerco di non farlo di nuovo, di ottenere quell'ultimo pezzetto. Quindi mi fermerò qui.

Questo lo metto subito sul ghiaccio in modo che rimanga bello freddo durante l'esperimento. Questo è molto importante. Questa è la, questa è una delle nostre pipette.

Lo usiamo per le registrazioni intracellulari. È un vetro di silice a pareti spesse, diametro esterno di due millimetri, diametro interno di 1,16 millimetri. Innanzitutto, quello che facciamo è riempire la pipetta.

Quindi applichiamo l'aspirazione, mettiamo la pipetta nella soluzione di registrazione e applichiamo l'aspirazione per cercare di riempire la punta molto, molto della pipetta, che altrimenti non si riempirà in nessun altro modo. Una volta fatto ciò, prendiamo un tubo capillare e riempiamo il resto dell'elettrodo semplicemente prendendo la parte posteriore della pipetta. Questa è una tecnica di fisiologia standard e letteralmente la sfiora.

Si corre il pericolo di rompere l'estremità della pipetta, ma si avrà anche, se non lo si fa, si avranno spesso bolle d'aria. Ok, ora lo mettiamo sul nostro portapipette, che è collegato al nostro stadio principale dell'amplificatore per patch plant. C'è un filo di cloruro d'argento lì.

Il filo di cloruro d'argento entra in contatto con la soluzione intracellulare, e questo ci permette di misurare l'attività elettrica nel terminale presinaptico. Quindi quello che facciamo è trovare la fetta che contiene molti CAE. Vogliamo un'alta densità di CAE.

Stiamo cercando il nucleo mediale del corpo trapezoidale, che è l'MNTB, ed è lì che si trova il terminale, che forma il caly, o che è l'app del calice. E quindi quello che facciamo è iniziare a scansionare la fetta. Quindi, per esempio, lì abbiamo un calice che è un po' profondo rispetto alla superficie e non c'è molto su cui attaccare, quindi continuiamo a scansionare su di noi.

Quindi questo è un calice qui che stiamo cercando. Quello che ho fatto sono due segni sullo schermo, che è il punto in cui andrà la pipetta. E potete vedere che c'è il pezzo di calice che sto per andare dopo che la pipetta sta per scendere.

Applicherò una pressione positiva in modo che spinga contro il calice, e poi allevierò la pressione positiva. Il calice sta quindi per spingere contro la pipetta, e a quel punto applico un'aspirazione molto delicata e cerco di aspirare e spingere la membrana o di far sigillare la membrana sul puntale della pipetta. Va bene, ha alleviato la pressione positiva.

E ora applicherò l'aspirazione. Quindi qui siamo pro, stiamo applicando un impulso di cinque millivolt, o in realtà un impulso di quattro millivolt. Ok, questo è tutto. Ok.

Ora abbassiamo il potenziale di membrana a meno 80, annulliamo il boom transitorio veloce. Ora andremo a cella intera. Applicherò un'aspirazione delicata e cercherò di andare all'ingrosso.

Quei transitori di carica indicano che lui è, che la pipetta e la cella sono ora continue che ha un, una registrazione all'ingrosso. Questo è un altro bellissimo scatto. Quindi il rosso più chiaro era la traccia di capacità, e si può vedere che c'è un salto improvviso e poi è diminuito.

Ok, vi ho appena mostrato le tecniche di base per ottenere registrazioni da un terminale presinaptico sostenuto da un calice. Ti ho mostrato come produrre le fette che contengono il nucleo mediale del corpo trapezoidale. È lì che troverai che i calici hanno tenuto.

E vi ho mostrato le tecniche per guardare attraverso le fette. Esaminerai ciascuna delle fette, cercando la fetta che ha il maggior numero di caly che si trovano in superficie. Cercherai quindi la membrana di caly più grande che riesci a trovare e registrerai il patch clamp su di essa.

E vi ho anche mostrato le tecniche per la registrazione con patch clamp, e quelle sono tecniche standard di registrazione con patch clamp.