Name: Imaging ad alta risoluzione dal vivo del comportamento delle cellule in via di sviluppo neuroepitelio (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-04-12T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 59 s
Description: Scopri un metodo di imaging ad alta risoluzione per studiare il comportamento cellulare nel neuroepitelio in via di sviluppo utilizzando embrioni di pollo. Questa tecnica consente l'osservazione a lungo termine con risoluzione spaziale e temporale elevata.

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1. Dish Preparazione <ol><li> I piatti utilizzati per la cultura slice sono il fondo di vetro (con un coprioggetto come base) (piatti WillCo). Questi sono posizionati sul tessuto lente in un piatto tessuto 6 centimetri cultura per mantenere il fondo di vetro pulito. </li><li> Il giorno prima dell&#39;esperimento, si aggiungono 2 ml 0,1% di poli-L-lisina soluzione al fondo piatto di vetro e incubare per 5 min a temperatura ambiente per permettere la poli-L-lisina per rivestire il fondo di vetro. </li><li> Rimuovere poli-L-lisina soluzione e sciacquare tre volte in acqua deionizzata, e poi una volta in 70% etanolo. </li><li> Lasciare asciugare per una notte. I piatti possono anche essere asciugati con blando riscaldamento in un forno a microonde a bassa potenza per 30-45 secondi. </li></ol> 2. Embryo Elettroporazione <ol><li> Incubare le uova a 37 ° C a Hamburger-Hamilton (HH) stage 10 (circa 36 ore) (o altro livello a scelta). </li><li> Prima di iniziare la preparazione aghi di vetro (usiamo un Flaming / modello di Brown p87 puller microcapillare) e rompere la punta del needle utilizzando una pinza sottile sotto un microscopio da dissezione. La fine dell&#39;ago dovrebbe essere abbastanza sottili da perforare l&#39;embrione, pur non essendo così stretta che impedisce l&#39;iniezione della soluzione di DNA. </li><li> Uova finestra ed elettrodi (5mm posto a parte) su entrambi i lati dell&#39;embrione </li><li> Iniettare DNA (~ 0,025-0,5 pg / pl in acqua deionizzata colorato con una piccola quantità di verde veloce) nel tubo neurale. </li><li> Applicare corrente - 12-17 V tre volte, lunghezza di impulso 50ms con 950 ms tra gli impulsi. </li><li> Usiamo basse concentrazioni di DNA e delle tensioni di elettroporazione basse per ottenere l&#39;espressione del mosaico in modo da poter seguire le singole celle. </li><li> Coprire finestra nel guscio con cellotape e assicurarsi che sia sigillato. </li><li> Lasciare embrioni di recuperare per 3-4 ore o durante la notte a 37 ° C. </li></ol> 3. Il collagene e Cultura Preparazione Slice Media <ol><li> Preparare mix collagene e terreno di coltura fetta circa un&#39;ora prima di affettarlo. </li><li> A 300 t plipo 1 collagene aggiungere 100 microlitri soluzione 0,1% di acido acetico e 100 pl 5 x L15 mezzo. Vortex accuratamente dopo ogni aggiunta. La soluzione dovrebbe diventare gialla. </li><li> Ora aggiungere bicarbonato di 15-20 microlitri di sodio 7,5% e completamente vortice. La soluzione dovrebbe diventare leggermente rosa, e il volume di bicarbonato di sodio richiesti per questo può variare. Tenere su ghiaccio e portare fresca ogni volta. </li><li> Per aggiungere 10 ml di terreno neurobasal B-27 e integratore Glutamax, ad una concentrazione finale di 1 x soluzione di Gentamicina e 10 pl. </li><li> Luogo in media a 37 ° C incubatore tamponata con il 5% di CO 2. Lasciare la parte superiore del contenitore allentata per consentire equilibrare con la CO 2. </li></ol> 4. Slice Cultura <ol><li> Rimuovere gli embrioni da uovo e lavare in media L15. </li><li> In un piatto di coltura tissutale con uno strato di Sylgard sul fondo e perno fuori attraverso i circostanti extra-embrionali membrane in modo che siano ben teso. </li><li> Utilizzo di un microfonoroknife, embrione fetta più diritta possibile attraverso la regione di interesse. Per il midollo spinale, fette dovrebbe essere compreso tra 1-2 somiti spessore. Lasciare collegati a fette embrione mentre si affettare altri embrioni in modo da non perderli. </li><li> Preparare una punta di 200 microlitri micropipetta tagliando ~ 1 mm della punta e allegando ad un p2 o p10. Questa punta verrà utilizzato per trasferire le fette midollo spinale al fondo piatto di vetro. A 10 microlitri punta non è sufficientemente ampio per raccogliere fette. </li><li> Rivestire l&#39;interno della punta con il collagene pipettando 1 mix ul collagene preparato in precedenza. Lasciare agire per 1-2 minuti e poi risciacquare con L15 media. Ciò impedirà il tessuto si attacchi all&#39;interno della punta. </li><li> Staccare fetta dall&#39;embrione utilizzando una microknife e togliere dal piatto con un p2 p10 o munito di una punta 200 pl e impostare a 1 microlitri. Prova di prendere come mezzo meno possibile. </li><li> Il collagene mix e goccia Vortex 5-8 pl di questa al poli-L-lisina piatto rivestito. </li><li> Immediatamente messo fetta embrione in collagene e la posizione in posizione con un paio di pinze sottili. Fette devono essere posizionati in modo che il lato di essere ripreso è a filo con il coprioggetto. Il tessuto deve aderire al poli-L-lisina rivestimento sul vetrino. </li><li> Ripetere questa operazione finché non avrete fette più sul vetrino. Di solito possiamo mettere 6-9 fette su un piatto. </li><li> Una volta che tutte le fette sono in posizione, coprire il piatto e permettono di impostare il collagene per 20 minuti. Alcuni dei primi collagene posto potrebbe essere già iniziato ad asciugarsi. Per evitare questo aggiungere una piccola quantità di L15 a questi prima copertura. </li><li> Una volta impostata, aggiungere cautamente 2ml terreno di coltura fetta che è stata equilibrata in 5% CO 2 a 37 ° C per almeno un&#39;ora. Bisogna fare attenzione a non staccare il collagene dal vetrino. </li><li> Posto a 37 ° / 5% CO 2 incubatore e consentire fette di recuperare per almeno 3 ore prima di imaging. Se non c&#39;è, piatto di umidità posto in uno spirito box perspexha bit di carta velina umida in un angolo. </li></ol> 5. Imaging embrioni Slices <ol><li> Usiamo un Core DeltaVision ampio campo ottico dotato di una camera Weatherstation ambientale fette di immagine. La camera è mantenuta costantemente a 37 ° C, con CO 2 apparato perfusione di mantenere la fase microscopio al 5% CO 2/95% aria. </li><li> Imaging viene normalmente eseguita con un 40 x / NA 1,30 Olio per lenti ad immersione e le immagini vengono catturate con un HQ2 CoolSnap raffreddato camera CCD. </li><li> Z sezioni vengono catturati ogni 1,5 um a 45 um tessuto. Il tempo di esposizione deve essere mantenuto il più basso possibile. Di solito esporre per 5-50 ms per ogni Z-sezione. Le immagini vengono catturate ogni 7 minuti e fino a 9 sezioni può essere visitata utilizzando il punto preciso del sistema DeltaVision di visita funzione. </li></ol> 6. Risultati rappresentativi Un time-lapse sequenza di esempio di una cellula progenitrice midollo spinale èmostrato nella fig. 2a e Movie corrispondente 1. Imaging è stato avviato su una fetta del midollo spinale da una due-giorni di età (HH stage 12) dell&#39;embrione. Questa cella è stata transfettata con un costrutto che esprime GFP-αTubulin. Durante questa prima fase, le cellule progenitrici neurali subiscono prevalentemente progenitrice progenitrici divisioni-mode durante il quale le cellule si dividono per generare due cellule progenitrici ulteriori ciclismo. Fig. Film 2b e corrispondente 2 mostra una cellula trasfettata con GFP-GPI (ancorata a GPI GFP), segna la membrana cellulare. Questa cellula subisce una divisione durante il quale il processo basale si divide in due ed è ugualmente ereditato dalle cellule figlie. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/3920/3920fig1.jpg" /> Figura 1. Slice protocollo di cultura per time-lapse imaging. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/3920/3920fig2.jpg" /> Figura 2. Cellule Behavior durante il normale sviluppo del midollo spinale. (a) i fotogrammi selezionati da Movie 1. Cellulari esprimenti GFP-tubulina divide con un piano di clivaggio che è perpendicolare alla superficie apicale (2 h 20 min), generando due cellule figlie che dividono ancora una volta (24 h 23 min e 25 h 54 min). (B) i fotogrammi selezionati da Movie 2. Cellule trasfettate con GFP-GPI subisce divisione cellulare in cui è suddiviso il processo basale (frecce bianche) e ugualmente ereditato dalle cellule figlie. Movie 1. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/3920/3920movie1.mov" target="_blank">Clicca qui per vedere il film</a> . Movie 2. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/3920/3920movie1.mov" target="_blank">Clicca qui per vedere il film</a> .

<ol><li>Ulloa, F., Briscoe, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Morphogens+and+the+Control+of+Cell+Proliferation+and+Patterning+in+the+Spinal+Cord%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Cycle%22%5BJournal%5D)">Morphogens and the Control of Cell Proliferation and Patterning in the Spinal Cord.</a> Cell Cycle. 6, 2640-2649 (2007).</li>
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<li>Chalfie, M., Tu, Y., Euskirchen, G., Ward, W., Prasher, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Green+fluorescent+protein+as+a+marker+for+gene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Green fluorescent protein as a marker for gene expression.</a> Science. 263, 802-805 (1994).</li>
<li>Wiedenmann, J., Oswald, F., Nienhaus, G. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescent+proteins+for+live+cell+imaging%3A+Opportunities%2C+limitations%2C+and+challenges%5BTitle%5D)+AND+%22IUBMB+Life%22%5BJournal%5D)">Fluorescent proteins for live cell imaging: Opportunities, limitations, and challenges.</a> IUBMB Life. 61, 1029-1042 (2009).</li>
</ol>

Non ci sono conflitti di interesse dichiarati.

Vi presentiamo qui un nuovo time-lapse test di imaging per monitorare il comportamento delle cellule in coltura fetta di pollo embrionale. Questo test permette l&#39;imaging ad alta risoluzione di tessuti viventi per un massimo di 70 ore, anche se le scadenze tra 24-48 ore sono più facili da catturare. L&#39;uso di un olio ad alta obiettivo NA e intervalli relativamente brevi tra i punti temporali consente l&#39;acquisizione di immagini ad alta risoluzione, oltre a permettere di monitorare il comportamento cellulare che si verifica spesso rapidamente, e può essere facilmente perso durante convenzionale time-lapse imaging mediante confocale microscopia. Il vantaggio principale di questo saggio è la capacità di celle di immagine per lunghi periodi di tempo. L&#39;uso di ampio campo 6 invece di scansione laser confocale 7 microscopia è critico per questo. Microscopia confocale ha tradizionalmente offerto numerosi vantaggi rispetto ad ampio campo di microscopia, compresa la capacità di prendere sezioni ottiche ed eliminare di informazioni messa a fuoco direttamente <sup&gt; 7, ma l&#39;uso di un foro porta ad una perdita di luce al rivelatore 8, escludendo una quantità significativa di informazioni, e che richiede tempi di esposizione più lunghi. Wide-microscopia a campo, invece, utilizza illuminazione pieno campo e tutta la luce che passa attraverso l&#39;obiettivo viene inviato al rivelatore. Questa accoppiata con uno ad alta efficienza quantica raffreddato Coupled Device (CCD) telecamera garantisce immagini con un elevato rapporto segnale-rumore rispetto alla microscopia confocale 9, con tempi di esposizione molto veloci. Nella nostra applicazione, dobbiamo immagine per lunghi periodi, record stack 3D e in ultima analisi, risolvere piccoli-vicino-diffrazione di strutture limitate. Sebbene microscopia confocale impedisce fuori-fuoco luce raggiunga il rivelatore e quindi riduce significativamente fondo in spessore, densamente-etichettati campioni 7, 8, si realizza solo utilizzabile segnale-rumore di ingresso luce molto più grande di ampio microscopia a campo 10. Per sparsel molto sensibile alla lucecampioni y-etichettati come i nostri fette elettroporate del midollo spinale, quindi, ampio microscopia a campo si comporta meglio di microscopia confocale. In combinazione con il ripristino dell&#39;immagine deconvoluzione, che rimuove le informazioni fuoco e migliora il contrasto, a grande campo è quindi particolarmente indicato per il rilevamento di oggetti piccoli, dim 11. Anche se non è appropriato per ogni esperimento imaging dei tessuti, questo approccio è stato molto efficace per la nostra applicazione dal vivo imaging cellulare. La scelta della proteina fluorescente è un importante fattore che può influenzare la sopravvivenza cellulare. Abbiamo trovato che i migliori risultati sono ottenuti dai costrutti che utilizzano la proteina fluorescente verde (GFP) 12 come marcatore. Stiamo valutando una serie di rossi proteine ​​fluorescenti che possono essere efficacemente impiegati in combinazione con GFP per doppio canale time-decade. Ci sono una varietà di tali proteine ​​disponibile 13. Sebbene molte proteine ​​sono stabili come fusioni con una proteina fluorescente, Alcune proteine ​​possono essere reso instabile per fusione, con conseguente riduzione della vitalità cellulare. In tali casi, l&#39;uso di costrutti contenenti un sito interno di entrata del ribosoma (IRES) è utile per separare la proteina di interesse dalla proteina fluorescente. Quando le fette di imaging del midollo spinale, la cura deve essere adottate per minimizzare l&#39;esposizione alla luce fluorescente. Gli oculari del microscopio deve essere utilizzato solo a luce trasmessa (campo chiaro) per individuare e posizionare le fette. Immagini fluorescenti devono sempre essere acquisito utilizzando il software microscopio usando tempi di esposizione minimi. Questi dovrebbero essere mantenuto nella gamma di 5-50 ms e l&#39;uso di filtri di densità neutri deve essere sperimentato. Anche se i tempi di esposizione più lunghi può inizialmente produrre immagini più nitide, gli effetti fototossiche di esposizione alla luce fluorescente può portare alla morte cellulare. I primi 5-10 um di tessuto che è più vicino al vetrino non deve essere immaginato come questa regione contiene tessuto che potrebbero essere danneggiati duranteaffettare. Sebbene gli esempi presentati qui sono di embrioni in stadio elettroporata HH 10 e ripreso 6-7 ore dopo, questo metodo può essere usato per embrioni fino a SS stadio 18. Nelle fasi successive, il tessuto del midollo spinale è molto più grande ed è così difficile da tagliare a mano. In questi casi, gli embrioni incorporamento in agarosio a basso punto di fusione e sezionamento con un vibratomo possono ottenere risultati migliori. Anche se presentiamo questo test come metodo di imaging per le cellule del midollo spinale di sviluppo, questo approccio è stato modificato ad altri tessuti embrionali di immagini, compreso il sensoriale placodes 3.

<table border="1"><tbody><tr><td> Reagente </td><td> Azienda </td><td> Numero di catalogo </td><td> Comments </td></tr><tr><td> WillCo Dish </td><td> WillCo Wells </td><td> GWst-3522 </td><td></td></tr><tr><td> poli-L-lisina </td><td> Sigma </td><td> P8970 </td><td> 0,1% in Tris </td></tr><tr><td> Vetro borosilicato capillari </td><td> Harvard Instruments </td><td> GC100-10 </td><td> 1,0 millimetri di diametro esterno, 0,58 millimetri di diametro interno </td></tr><tr><td> Elettrodi (Genetrodes, in ovo, a forma di L </td><td> BTX </td><td> 10-001850-01 </td><td> 5 millimetri placcato in oro </td></tr><tr><td> ECM 830 quadrato generatore di impulsi </td><td> BTX </td><td> 45-0002 </td><td> per l&#39;ovo in electroopration </td></tr><tr><td> Fast Green </td><td> Sigma </td><td> F7258 </td><td></td></tr><tr><td> Collagene di tipo I ratti </td><td> Sigma </td><td> C3857 </td><td></td></tr><tr><td> L-15 (polvere) </td><td> Sigma </td><td></td><td> 2,76 g / L in acqua distillata per soluzione 5x </td></tr><tr><td> Bicarbonato di sodio </td><td> Sigma </td><td> S8761 </td><td> 7,5% soluzione </td></tr><tr><td> Media Neurobasal </td><td> Invitrogen </td><td> 12348-017 </td><td> senza rosso fenolo </td></tr><tr><td> Glutamax </td><td> Invitrogen </td><td> A1286001 </td><td> Soluzione 100x </td></tr><tr><td> B-27 supplemento </td><td> Invitrogen </td><td> 17504-044 </td><td></td></tr><tr><td> Gentamicina </td><td> Invitrogen </td><td> 15710049 </td><td> 10 mg / ml </td></tr><tr><td> L15 media (liquido 1x) </td><td> Invitrogen </td><td> 11415-049 </td><td></td></tr><tr><td> Microknife </td><td> Altomed </td><td> A10102 </td&gt; <td> 15 gradi di pendenza </td></tr><tr><td> Perni in acciaio inox senza testa </td><td> Watkins e Doncaster </td><td> E6871 </td><td> Formato A1 </td></tr><tr><td> Sylgard 184 elastomero </td><td> VWR </td><td> 634165S </td><td></td></tr><tr><td> DeltaVision cuore del sistema microscopio </td><td> Applied Precision </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Coolsnap HQ2 telecamera CCD </td><td> Fotometrici </td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

imaging ad alta risoluzione dal vivo del comportamento delle cellule in via di sviluppo neuroepitelio

High-resolution Live Imaging of Cell Behavior in the Developing Neuroepithelium

Il midollo spinale embrionale consiste di bicicletta cellule progenitrici neurali che danno luogo ad una grande percentuale delle cellule neuronali e gliali del sistema nervoso centrale (CNS). Anche se si sa molto sui meccanismi molecolari che motivo il midollo spinale e provocano la differenziazione neuronale 1, 2, ci manca una profonda conoscenza di questi eventi precoci a livello di comportamento cellulare. E &#39;quindi fondamentale per studiare il comportamento dei progenitori neurali in tempo reale in quanto sottoposti a neurogenesi. In passato, imaging in tempo reale del primo tessuto embrionale è stato limitato da cellule / tessuti vitalità nella cultura nonché gli effetti fototossici di imaging fluorescente. Qui presentare un nuovo metodo di analisi per immagini come tessuto per lunghi periodi di tempo, utilizzando un romanzo ex vivo protocollo fetta cultura e ampio campo di microscopia a fluorescenza (Fig. 1). Questo approccio realizza lungo termine time-lapse monitoraggio della chick embrionale sPinal cellule progenitrici del midollo con elevata risoluzione spaziale e temporale. Il test può essere modificato per l&#39;immagine di una vasta gamma di tessuti embrionali 3, 4 Oltre all&#39;osservazione dei comportamenti cellulari e sub-cellulare, lo sviluppo del romanzo e giornalisti molto sensibili per l&#39;attività dei geni (ad esempio, di segnalazione Notch 5) rende questo test un potente strumento con il quale per capire come segnalazione regola il comportamento delle cellule durante lo sviluppo embrionale.

Imaging del tessuto embrionale in real-time è una sfida per lunghi periodi di tempo. Qui vi presentiamo un test per monitorare i cambiamenti cellulari e sub-cellulare del midollo spinale pulcino per lunghi periodi con elevata risoluzione spaziale e temporale. Questa tecnica può essere adattato ad altre regioni del sistema nervoso e sviluppo embrionale.

Imaging ad alta risoluzione dal vivo del comportamento delle cellule in via di sviluppo neuroepitelio

Il midollo spinale embrionale è costituito da cellule progenitrici neurali in ciclo che danno origine a un'elevata percentuale di cellule neuronali e gliali del sistema nervoso centrale...

L'obiettivo generale di questa procedura è quello di ottenere immagini del comportamento cellulare all'interno del tubo neurale embrionale con elevata risoluzione per lunghi periodi di tempo. Questo risultato si ottiene innanzitutto sezionando il tubo neurale precoce mediante un costrutto che induce l'espressione di una proteina fluorescente scelta per marcare singole cellule. Il passo successivo consiste nel preparare sezioni dell'embrione precoce e montarle su piatti con fondo in vetro.Dopo il recupero in un incubatore, le sezioni di embrione vengono analizzate al microscopio a campo ampio a intervalli regolari. In definitiva, questa tecnica può essere utilizzata per studiare il comportamento cellulare all'interno dell'epitelio neuro in via di sviluppo per lunghi periodi di tempo con elevata risoluzione spaziale e temporale. Il principale vantaggio di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti per l'analisi di tessuti vivi è che consente di osservare il comportamento individuale delle cellule per lunghi periodi di tempo con elevata risoluzione spaziale e temporale.Questo metodo consente di affrontare questioni fondamentali nel campo della neurobiologia dello sviluppo, come il ruolo dell'orientamento del fuso mitotico nella scelta del solfato, o come la dinamica dei segnali possa regolare il comportamento cellulare prima dell'elettroporazione di plasmidi nel tubo neurale. Gli aghi di vetro vengono preparati utilizzando un estrattore di microcapillari sotto un microscopio stereoscopico. Usare pinzette fini per rompere la punta dell'ago.La punta dell'ago deve essere abbastanza affilata da perforare il tubo neurale, senza essere troppo stretta da ostacolare l'iniezione della soluzione di DNA. I X per questo esperimento sono stati incubati a 37 gradi Celsius per circa 36 ore fino allo stadio di hamburger Hamilton 10.Per iniziare questa procedura, effettuare una finestra nell'uovo e posizionare gli elettrodi a cinque millimetri di distanza su entrambi i lati dell'embrione, quindi iniettare il DNA nel tubo neurale. Il DNA è colorato con una piccola quantità di verde brillante per la visualizzazione. Applicare una corrente di 12-17 volt e una durata dell'impulso di 50 millisecondi, ripetuta tre volte con un intervallo di 950 millisecondi tra un impulso e l'altro.Si utilizzano basse concentrazioni di DNA e basse tensioni di elettroporazione per ottenere un'espressione a mosaico in modo da poter seguire singole cellule. Infine, coprire la finestra nel guscio dell'uovo con nastro da cantina, assicurandosi che sia ben sigillata. Lasciare che gli embrioni si riprendano per tre o quattro ore oppure per tutta la notte a 37 gradi Celsius.La miscela di collagene e il mezzo per colture di feti in sezioni sottili devono essere preparati circa un'ora prima di sezionare gli embrioni. Per preparare la miscela di collagene, aggiungere 100 microlitri di soluzione di acido acetico 0,1% a 300 microlitri di collagene di tipo I ed emulsionare accuratamente; quindi aggiungere 100 microlitri di mezzo L 15 cinque volte concentrato ed emulsionare accuratamente. Ancora una volta, la soluzione dovrebbe diventare gialla.Successivamente, aggiungere da 15 a 20 microlitri di bicarbonato di sodio al 7,5% e vortexare accuratamente. La soluzione dovrebbe diventare leggermente rosa. Mantenere sul ghiaccio.Questa miscela di collagene deve essere preparata fresca ogni volta. Per preparare il mezzo di coltura per fette, aggiungere al seguente mezzo basale per neuroni: supplemento B27, GlutaMAX e soluzione di gentamicina, quindi collocare il mezzo in un incubatore a 37 gradi Celsius, tamponato con il 5% di anidride carbonica. Lasciare il coperchio del contenitore leggermente allentato per consentire l'equilibrazione con l'anidride carbonica per almeno un'ora.Per iniziare questa procedura, utilizzare un paio di piccole forbici per asportare l'embrione. Rimuovere l'embrione dall'uovo con pinzette, lavandolo con mezzo L 15. Posizionare l'embrione in una piastra per colture cellulari con uno strato di Sylgard sul fondo.Fissare l'embrione attraverso le membrane extraembrionali circostanti in modo che queste ultime risultino ben tese. Utilizzando un microbisturi, tagliare l'embrione nel modo più rettilineo possibile attraverso la regione di interesse. Per sezioni del midollo spinale, lo spessore deve essere compreso tra uno e due somiti; le sezioni devono rimanere attaccate al tessuto laterale dell'embrione per evitare di perderle mentre si eseguono i tagli su altri embrioni.È necessaria una punta micro personalizzata per il trasferimento delle sezioni del midollo spinale nella piastra con fondo in vetro. Per prepararla, applicare una punta da 200 microlitri su una pipetta P2 o P10 e tagliare circa un millimetro dall'estremità della punta. Rivestire l'interno della punta con collagene preparando un microlitro della miscela di collagene precedentemente ottenuta.Lasciare agire per uno o due minuti, quindi risciacquare con mezzo L 15. Questo impedirà al tessuto di aderire all'interno della punta. A questo punto, staccare una sezione dall'embrione utilizzando un microbisturi ed estrarre la sezione dalla piastra utilizzando la P2 o la P10 dotata di punta da 200 microlitri.Cercare di utilizzare la minima quantità possibile di mezzo. Vortexare la miscela di collagene e depositare da cinque a otto microlitri di questa su una piastra con fondo in vetro rivestito di poliolisina e con un'ampolla come base; inserire immediatamente la sezione dell'embrione nel collagene e posizionarla con una pinzetta fine. Le LIC devono essere posizionate in modo che il lato da osservare risulti allineato con l'ampolla.Il tessuto dovrebbe aderire al rivestimento di poliolisina sul coprivetrino. Ripetere questa operazione fino ad avere diverse sezioni sul coprivetrino. Di solito si posizionano da sei a nove sezioni in una singola piastra.Quando tutte le fette sono posizionate, aggiungere da due a tre microlitri di mezzo L 15 alla matrice di collagene appena formata e ricoprire la piastra. Lasciare solidificare il collagene per 20 minuti. Una volta che il collagene si è solidificato, aggiungere con attenzione due millilitri di mezzo per colture di fette, precedentemente equilibrato per almeno un'ora a 5% di anidride carbonica e 37 gradi Celsius.È necessario fare attenzione a non staccare il collagene dal vetrino, posizionarlo in un'incubatrice a 37 gradi Celsius e 5% di anidride carbonica e lasciare che le sezioni si ripristinino per almeno tre ore prima dell'acquisizione delle immagini. L'acquisizione dell'attività cellulare all'interno del tessuto per lunghi periodi di tempo con elevata risoluzione temporale e spaziale è una procedura complessa. Una combinazione di condizioni di coltura ottimali e l'utilizzo della microscopia a campo chiaro è essenziale per ottenere buoni risultati.Si utilizza un microscopio a campo luminoso Delta Vision Core dotato di una camera ambientale con stazione meteorologica per acquisire immagini delle sezioni. La camera viene mantenuta costantemente a 37 gradi Celsius mediante un apparato di perfusione di anidride carbonica, in modo da garantire sul palco del microscopio un’atmosfera al 5% di anidride carbonica e al 95% di aria. L’acquisizione delle immagini viene normalmente effettuata utilizzando un obiettivo ad immersione in olio da 40 volte con apertura numerica 1,30 NA, e le immagini sono catturate con una fotocamera CCD Core Snap HQ2. Le sezioni Z vengono acquisite ogni 1,5 micron per un totale di 45 micron di tessuto. Il tempo di esposizione deve essere mantenuto il più basso possibile, ad esempio tra 5 e 50 millisecondi.Per ogni sezione descritta, le immagini vengono acquisite ogni sette minuti. Utilizzando i sistemi Delta Vision, è possibile visitare fino a nove sezioni. La funzione di visita in un punto preciso mostrata qui è un esempio di sequenza a intervalli di tempo di una cellula progenitrice del midollo spinale trasfettata con un costrutto che esprime GFP alfa-tubulina; l'acquisizione delle immagini è stata avviata su una sezione del midollo spinale proveniente da un embrione di due giorni allo stadio HH 12.In questa fase iniziale, le cellule progenitrici neurali subiscono principalmente divisioni in modalità progenitore-progenitore, durante le quali le cellule si dividono generando altre due cellule progenitrici in ciclo. Questa figura mostra alcuni fotogrammi selezionati dalla sequenza a intervalli di tempo appena mostrata. A due ore e 20 minuti, la cellula si divide con un piano di scissione perpendicolare alla superficie apicale, generando due cellule figlie.Queste due cellule si dividono nuovamente a 24 ore e 23 minuti e a 25 ore e 54 minuti. Questa successiva sequenza a intervalli è di una cellula trasfettata con G-F-P-G-P-I che marca la membrana cellulare. La cellula subisce una divisione durante la quale il processo basale si divide in due, indicato dalle frecce bianche, e viene ereditato equamente dalle cellule figlie.Alcuni fotogrammi selezionati da questa sequenza a intervalli mostrano che la divisione cellulare avviene a zero ore e 49 minuti. Dopo aver visto questo video, dovresti avere un'idea chiara di come preparare e acquisire immagini di sezioni del midollo spinale. Ricorda, se sei nuovo a questa tecnica, potresti incontrare inizialmente delle difficoltà, poiché vi sono diversi passaggi tecnici complessi che devono essere eseguiti correttamente affinché il metodo funzioni.

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