Imaging ad alta risoluzione dal vivo del comportamento delle cellule in via di sviluppo neuroepitelio

L'obiettivo generale di questa procedura è quello di visualizzare il comportamento delle cellule all'interno del tubo neurale embrionale ad alta risoluzione per lunghi periodi di tempo. Ciò si ottiene sezionando prima il tubo neurale precoce con un costrutto che guida l'espressione di una proteina fluorescente di scelta per marcare singole cellule. Il passo successivo è quello di fare delle fette dell'embrione precoce e montarle su piatti con fondo di vetro.

Dopo il recupero in un'incubatrice, le fette di embrione vengono visualizzate su un microscopio a campo largo a intervalli regolari. In definitiva, questa tecnica può essere utilizzata per studiare il comportamento cellulare all'interno del neuroepitelio in via di sviluppo per lunghi periodi di tempo con un'elevata risoluzione spaziale e temporale. Il vantaggio principale di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti per l'imaging dei tessuti viventi è che ci consente di osservare il comportamento delle singole cellule per lunghi periodi di tempo ad alta risoluzione spaziale e temporale.

Questo metodo consente di affrontare questioni chiave nel campo della neurobiologia dello sviluppo, come il ruolo dell'orientamento del fuso mitotico nella scelta del solfato, o come la dinamica di segnalazione potrebbe regolare il comportamento cellulare prima dell'elettroporazione dei plasmidi nel tubo neurale. Gli aghi di vetro vengono preparati utilizzando un estrattore microcapillare al microscopio da dissezione. Usa una pinza sottile per rompere la punta dell'ago.

L'estremità dell'ago deve essere abbastanza affilata da perforare il tubo neurale senza essere così stretta da impedire l'iniezione della soluzione di DNA. Gli X per questo esperimento sono stati incubati a 37 gradi Celsius per circa 36 ore per hamburger Hamilton. Fase 10.

Per iniziare questa procedura, la finestra e l'uovo e posizionare gli elettrodi a cinque millimetri di distanza su entrambi i lati dell'embrione, iniettare il DNA nel tubo neurale. Il DNA è colorato con una piccola quantità di verde veloce per la visualizzazione. Applicare una corrente da 12 a 17 volt e una lunghezza dell'impulso di 50 millisecondi tre volte con 950 millisecondi tra gli impulsi.

Basse concentrazioni di DNA e basse tensioni di elettroporazione vengono utilizzate per ottenere l'espressione a mosaico in modo che le singole cellule possano essere seguite. Infine, copri la finestra nel guscio d'uovo con del nastro adesivo da cantina, assicurandoti che sia sigillata. Lasciare che gli embrioni si riprendano per tre o quattro ore o durante la notte a 37 gradi Celsius.

La miscela di collagene e il terreno di coltura a fette devono essere preparati circa un'ora prima di affettare gli embrioni. Per preparare la miscela di collagene a 100 microlitri di soluzione di acido acetico allo 0,1% a 300 microlitri di collagene di tipo uno e vorticare accuratamente, aggiungere 100 microlitri di cinque volte L 15, medio e vorticare accuratamente. Ancora una volta, la soluzione dovrebbe ingiallire.

Quindi, aggiungi da 15 a 20 microlitri di bicarbonato di sodio al 7,5% e agita accuratamente. La soluzione dovrebbe diventare leggermente rosa. Mantenere il ghiaccio.

Questo mix di collagene deve essere preparato fresco ogni volta. Per preparare il terreno di coltura a fette a seguito di 10 millilitri di terreno neurobasale, integratore B 27 glut max e soluzione di gentamicina, porre il terreno in un incubatore a 37 gradi Celsius, tamponato con il 5% di anidride carbonica. Lasciare la parte superiore del contenitore libera per permettergli di equilibrarsi con l'anidride carbonica per almeno un'ora.

Per iniziare questa procedura, usa un paio di piccole forbici per ritagliare l'embrione. Rimuovere l'embrione dall'uovo con una pinzetta lavando L 15 medio. Posizionare l'embrione in una piastra di coltura tissutale con uno strato di protezione siltica sul fondo.

Fissare l'embrione attraverso le membrane extra embrionali circostanti in modo che le membrane siano tese. Usando un micro coltello, affetta l'embrione il più dritto possibile attraverso la regione di interesse. Per quanto riguarda il midollo spinale, le fette di foglie spesse dovrebbero essere comprese tra uno o due somiti, fette di foglie spesse attaccate al tessuto laterale dell'embrione in modo che non vadano perse durante il taglio di altri embrioni.

Per trasferire le fette di midollo spinale sul piatto con fondo in vetro è necessaria una punta di micro perpet personalizzata. Per prepararlo, attacca una punta da 200 microlitri a una P due o P 10 perman e taglia circa un millimetro dall'estremità della punta. Codificare l'interno della punta con il collagene preparando un microlitro della miscela di collagene preparata in precedenza.

Lasciare agire per uno o due minuti e poi risciacquare con L 15 medio. Ciò eviterà che il tessuto si attacchi all'interno della punta. Ora staccate una fetta dall'embrione usando un micro coltello e rimuovete la fetta dal piatto usando il P due o P 10 dotato della punta da 200 microlitri.

Cerca di occupare il minor numero possibile di mezzi. Agitare la miscela di collagene e lasciarne cadere da cinque a otto microlitri su un piatto di vetro rivestito di poliolo lisina con un vetrino coprioggetti come base, inserire immediatamente la fetta di embrione nel collagene e posizionarla con un paio di pinze sottili. I LIC devono essere posizionati in modo che il lato da riprendere sia a filo con il vetrino coprioggetti.

Il tessuto deve aderire al rivestimento in poliolo lisina sul vetrino coprioggetto. Ripeti l'operazione fino ad avere diverse fette sul vetrino coprioggetto. Di solito da sei a nove fette vengono poste su un piatto.

Quando tutte le fette sono a posto, aggiungere due o tre microlitri di L 15, collagene medio e precoce e coprire il piatto. Lasciare riposare il collagene per 20 minuti. Una volta che il collagene è stato impostato con cura, aggiungere due millilitri di terreno di coltura a fette che è stato bilanciato per almeno un'ora in anidride carbonica al 5% e 37 gradi Celsius.

Bisogna fare attenzione a non rimuovere il collagene dal vetrino coprioggetti, metterlo in un incubatore a 37 gradi Celsius al 5% di anidride carbonica e lasciare che le fette si riprendano per almeno tre ore prima dell'imaging. L'imaging del comportamento delle cellule all'interno dei tessuti per lunghi periodi di tempo ad alta risoluzione temporale e spaziale è una sfida. Una combinazione di condizioni di coltura ottimali e l'uso della microscopia in campo bianco è essenziale per ottenere buoni risultati.

Per l'imaging delle fette viene utilizzato un microscopio a campo largo con nucleo a visione delta dotato di una camera climatica per stazioni meteorologiche. La camera viene costantemente mantenuta a 37 gradi Celsius con un apparato di perfusione di anidride carbonica per mantenere lo stadio del microscopio al 5% di anidride carbonica e al 95% L'imaging dell'aria viene normalmente eseguito utilizzando una lente a immersione in olio 40 volte 1,30 NA e le immagini vengono catturate con un nucleo a scatto HQ due chiamate CCD camera Le sezioni Z vengono catturate ogni 1,5 micron attraverso 45 micron di esposizione tissutale. Il tempo dovrebbe essere mantenuto il più basso possibile, ad esempio da cinque a 50 millisecondi.

Per ogni sezione vengono catturate immagini ogni sette minuti. Con i sistemi di visione Delta è possibile visitare fino a nove sezioni. La funzione di visita precisa del punto mostrata qui è un esempio di sequenza time-lapse di una cellula progenitrice del midollo spinale trasfettata con un costrutto che esprime GFP alfa L'imaging della tubulina è stato avviato su una fetta di midollo spinale da un embrione HH di due giorni allo stadio 12

Durante questa fase iniziale, le cellule progenitrici neurali subiscono prevalentemente divisioni in modalità progenitore progenitore durante le quali le cellule si dividono per generare due ulteriori cellule progenitrici cicliche. Questa figura mostra i fotogrammi selezionati dalla sequenza time-lapse appena mostrata. A due ore e 20 minuti, la cellula si divide con un piano di scissione perpendicolare alla superficie apicale generando due cellule figlie.

Queste due cellule si dividono ancora una volta a 24 ore e 23 minuti e 25 ore e 54 minuti. La successiva sequenza time-lapse è di una cellula trasfettata con G-F-P-G-P-I che segna la membrana cellulare. Questa cellula subisce una divisione durante la quale il processo basale si divide in due indicato dalle frecce bianche ed è ugualmente ereditato dalle cellule figlie.

I fotogrammi selezionati da questa sequenza time-lapse mostrano che la divisione cellulare avviene a zero ore e 49 minuti. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona idea di come preparare e immaginare le fette di midollo spinale. Ricorda, se sei nuovo a questa tecnica, potresti avere difficoltà all'inizio poiché ci sono una serie di passaggi tecnicamente impegnativi che devono essere tutti uniti affinché funzioni.