Imaging ad alta risoluzione dal vivo del comportamento delle cellule in via di sviluppo neuroepitelio

L'obiettivo generale di questa procedura è quello di ottenere immagini del comportamento cellulare all'interno del tubo neurale embrionale con elevata risoluzione per lunghi periodi di tempo. Questo risultato si ottiene innanzitutto sezionando il tubo neurale precoce mediante un costrutto che induce l'espressione di una proteina fluorescente scelta per marcare singole cellule. Il passo successivo consiste nel preparare sezioni dell'embrione precoce e montarle su piatti con fondo in vetro.

Dopo il recupero in un incubatore, le sezioni di embrione vengono analizzate al microscopio a campo ampio a intervalli regolari. In definitiva, questa tecnica può essere utilizzata per studiare il comportamento cellulare all'interno dell'epitelio neuro in via di sviluppo per lunghi periodi di tempo con elevata risoluzione spaziale e temporale. Il principale vantaggio di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti per l'analisi di tessuti vivi è che consente di osservare il comportamento individuale delle cellule per lunghi periodi di tempo con elevata risoluzione spaziale e temporale.

Questo metodo consente di affrontare questioni fondamentali nel campo della neurobiologia dello sviluppo, come il ruolo dell'orientamento del fuso mitotico nella scelta del solfato, o come la dinamica dei segnali possa regolare il comportamento cellulare prima dell'elettroporazione di plasmidi nel tubo neurale. Gli aghi di vetro vengono preparati utilizzando un estrattore di microcapillari sotto un microscopio stereoscopico. Usare pinzette fini per rompere la punta dell'ago.

La punta dell'ago deve essere abbastanza affilata da perforare il tubo neurale, senza essere troppo stretta da ostacolare l'iniezione della soluzione di DNA. I X per questo esperimento sono stati incubati a 37 gradi Celsius per circa 36 ore fino allo stadio di hamburger Hamilton 10.

Per iniziare questa procedura, effettuare una finestra nell'uovo e posizionare gli elettrodi a cinque millimetri di distanza su entrambi i lati dell'embrione, quindi iniettare il DNA nel tubo neurale. Il DNA è colorato con una piccola quantità di verde brillante per la visualizzazione. Applicare una corrente di 12-17 volt e una durata dell'impulso di 50 millisecondi, ripetuta tre volte con un intervallo di 950 millisecondi tra un impulso e l'altro.

Si utilizzano basse concentrazioni di DNA e basse tensioni di elettroporazione per ottenere un'espressione a mosaico in modo da poter seguire singole cellule. Infine, coprire la finestra nel guscio dell'uovo con nastro da cantina, assicurandosi che sia ben sigillata. Lasciare che gli embrioni si riprendano per tre o quattro ore oppure per tutta la notte a 37 gradi Celsius.

La miscela di collagene e il mezzo per colture di feti in sezioni sottili devono essere preparati circa un'ora prima di sezionare gli embrioni. Per preparare la miscela di collagene, aggiungere 100 microlitri di soluzione di acido acetico 0,1% a 300 microlitri di collagene di tipo I ed emulsionare accuratamente; quindi aggiungere 100 microlitri di mezzo L 15 cinque volte concentrato ed emulsionare accuratamente. Ancora una volta, la soluzione dovrebbe diventare gialla.

Successivamente, aggiungere da 15 a 20 microlitri di bicarbonato di sodio al 7,5% e vortexare accuratamente. La soluzione dovrebbe diventare leggermente rosa. Mantenere sul ghiaccio.

Questa miscela di collagene deve essere preparata fresca ogni volta. Per preparare il mezzo di coltura per fette, aggiungere al seguente mezzo basale per neuroni: supplemento B27, GlutaMAX e soluzione di gentamicina, quindi collocare il mezzo in un incubatore a 37 gradi Celsius, tamponato con il 5% di anidride carbonica. Lasciare il coperchio del contenitore leggermente allentato per consentire l'equilibrazione con l'anidride carbonica per almeno un'ora.

Per iniziare questa procedura, utilizzare un paio di piccole forbici per asportare l'embrione. Rimuovere l'embrione dall'uovo con pinzette, lavandolo con mezzo L 15. Posizionare l'embrione in una piastra per colture cellulari con uno strato di Sylgard sul fondo.

Fissare l'embrione attraverso le membrane extraembrionali circostanti in modo che queste ultime risultino ben tese. Utilizzando un microbisturi, tagliare l'embrione nel modo più rettilineo possibile attraverso la regione di interesse. Per sezioni del midollo spinale, lo spessore deve essere compreso tra uno e due somiti; le sezioni devono rimanere attaccate al tessuto laterale dell'embrione per evitare di perderle mentre si eseguono i tagli su altri embrioni.

È necessaria una punta micro personalizzata per il trasferimento delle sezioni del midollo spinale nella piastra con fondo in vetro. Per prepararla, applicare una punta da 200 microlitri su una pipetta P2 o P10 e tagliare circa un millimetro dall'estremità della punta. Rivestire l'interno della punta con collagene preparando un microlitro della miscela di collagene precedentemente ottenuta.

Lasciare agire per uno o due minuti, quindi risciacquare con mezzo L 15. Questo impedirà al tessuto di aderire all'interno della punta. A questo punto, staccare una sezione dall'embrione utilizzando un microbisturi ed estrarre la sezione dalla piastra utilizzando la P2 o la P10 dotata di punta da 200 microlitri.

Cercare di utilizzare la minima quantità possibile di mezzo. Vortexare la miscela di collagene e depositare da cinque a otto microlitri di questa su una piastra con fondo in vetro rivestito di poliolisina e con un'ampolla come base; inserire immediatamente la sezione dell'embrione nel collagene e posizionarla con una pinzetta fine. Le LIC devono essere posizionate in modo che il lato da osservare risulti allineato con l'ampolla.

Il tessuto dovrebbe aderire al rivestimento di poliolisina sul coprivetrino. Ripetere questa operazione fino ad avere diverse sezioni sul coprivetrino. Di solito si posizionano da sei a nove sezioni in una singola piastra.

Quando tutte le fette sono posizionate, aggiungere da due a tre microlitri di mezzo L 15 alla matrice di collagene appena formata e ricoprire la piastra. Lasciare solidificare il collagene per 20 minuti. Una volta che il collagene si è solidificato, aggiungere con attenzione due millilitri di mezzo per colture di fette, precedentemente equilibrato per almeno un'ora a 5% di anidride carbonica e 37 gradi Celsius.

È necessario fare attenzione a non staccare il collagene dal vetrino, posizionarlo in un'incubatrice a 37 gradi Celsius e 5% di anidride carbonica e lasciare che le sezioni si ripristinino per almeno tre ore prima dell'acquisizione delle immagini. L'acquisizione dell'attività cellulare all'interno del tessuto per lunghi periodi di tempo con elevata risoluzione temporale e spaziale è una procedura complessa. Una combinazione di condizioni di coltura ottimali e l'utilizzo della microscopia a campo chiaro è essenziale per ottenere buoni risultati.

Si utilizza un microscopio a campo luminoso Delta Vision Core dotato di una camera ambientale con stazione meteorologica per acquisire immagini delle sezioni. La camera viene mantenuta costantemente a 37 gradi Celsius mediante un apparato di perfusione di anidride carbonica, in modo da garantire sul palco del microscopio un’atmosfera al 5% di anidride carbonica e al 95% di aria. L’acquisizione delle immagini viene normalmente effettuata utilizzando un obiettivo ad immersione in olio da 40 volte con apertura numerica 1,30 NA, e le immagini sono catturate con una fotocamera CCD Core Snap HQ2. Le sezioni Z vengono acquisite ogni 1,5 micron per un totale di 45 micron di tessuto. Il tempo di esposizione deve essere mantenuto il più basso possibile, ad esempio tra 5 e 50 millisecondi.

Per ogni sezione descritta, le immagini vengono acquisite ogni sette minuti. Utilizzando i sistemi Delta Vision, è possibile visitare fino a nove sezioni. La funzione di visita in un punto preciso mostrata qui è un esempio di sequenza a intervalli di tempo di una cellula progenitrice del midollo spinale trasfettata con un costrutto che esprime GFP alfa-tubulina; l'acquisizione delle immagini è stata avviata su una sezione del midollo spinale proveniente da un embrione di due giorni allo stadio HH 12.

In questa fase iniziale, le cellule progenitrici neurali subiscono principalmente divisioni in modalità progenitore-progenitore, durante le quali le cellule si dividono generando altre due cellule progenitrici in ciclo. Questa figura mostra alcuni fotogrammi selezionati dalla sequenza a intervalli di tempo appena mostrata. A due ore e 20 minuti, la cellula si divide con un piano di scissione perpendicolare alla superficie apicale, generando due cellule figlie.

Queste due cellule si dividono nuovamente a 24 ore e 23 minuti e a 25 ore e 54 minuti. Questa successiva sequenza a intervalli è di una cellula trasfettata con G-F-P-G-P-I che marca la membrana cellulare. La cellula subisce una divisione durante la quale il processo basale si divide in due, indicato dalle frecce bianche, e viene ereditato equamente dalle cellule figlie.

Alcuni fotogrammi selezionati da questa sequenza a intervalli mostrano che la divisione cellulare avviene a zero ore e 49 minuti. Dopo aver visto questo video, dovresti avere un'idea chiara di come preparare e acquisire immagini di sezioni del midollo spinale. Ricorda, se sei nuovo a questa tecnica, potresti incontrare inizialmente delle difficoltà, poiché vi sono diversi passaggi tecnici complessi che devono essere eseguiti correttamente affinché il metodo funzioni.