Visualizzazione neuroblasti Citocinesi Durante C. elegans Embriogenesi

Questo protocollo descrive come immagine divisione delle cellule all'interno di un tessuto in Caenorhabditis elegans embrioni. Mentre diversi protocolli descrivono come la divisione cellulare l'immagine in embrione precoce, questo protocollo viene descritto come immagine divisione cellulare all'interno di un tessuto in via di sviluppo durante la metà tarda embriogenesi.

L'obiettivo generale del seguente esperimento è quello di osservare le cellule in divisione all'interno di un tessuto in via di sviluppo durante l'embriogenesi in stile C. Al fine di studiare i geni che controllano la divisione cellulare, ciò si ottiene creando o ottenendo un ceppo di Celgan che esprime stabilmente marcatori transgenici che marcano le cellule di interesse. In una seconda fase, abbattere selettivamente un gene di interesse somministrando D-S-R-N-A a L quattro larve per 24-48 ore.

Gli embrioni RNAI vengono raccolti da ermafroditi grafici e trasferiti su un tappetino aros per l'imaging dal vivo. Successivamente, utilizzando la microscopia ad ampio campo o confocale, gli embrioni vengono visualizzati per visualizzare i fenotipi della divisione cellulare. I risultati mostreranno come i neuroblasti si dividono durante l'embriogenesi dell'elgin marino e il ruolo dei geni necessari per la loro divisione.

Questo metodo può aiutare a rivelare domande chiave nel campo della biologia cellulare e dello sviluppo. Ad esempio, questo metodo potrebbe rivelare geni e meccanismi coinvolti nella regolazione della mitosi durante lo sviluppo dei tessuti, la comunicazione cellulare, la migrazione cellulare o la polarità cellulare. Utilizzare vermi transgenici che esprimano i marcatori appropriati conservati su piastre di controllo o RNAI per 24-48 ore.

Raccogli da quattro a sei adulti gravi e trasferiscili in 20-30 microlitri di tampone M nine in un vetrino a depressione Per rilasciare gli embrioni, usa un bisturi sterile, taglia i vermi su entrambi i lati della spermateca o della vulva. Successivamente, raccogli gli embrioni utilizzando un capillare tirato, che è attaccato a un bulbo di pipetta ed è abbastanza largo da far passare gli embrioni. Trasferisci gli embrioni su un tampone aros appena preparato usando una ciglia incollata a uno stuzzicadenti.

Crea gruppi da cinque a 10 embrioni spingendo gli embrioni uno accanto all'altro. Coprire il vetrino con un vetrino coprioggetti e aggiungere altro tampone M nine se necessario, quindi sigillare il vetrino coprioggetti con valvola liquida preriscaldata. Utilizzare un microscopio epi fluorescente ad ampio campo che include filtri automatici.

Obiettivi, una telecamera CCD ad alta risoluzione e un palco altamente motorizzato. Il tutto controllato con software. Sebbene questo sistema non li abbia utilizzando LED e un E-M-C-C-D limiterà la fototossicità all'embrione con un basso ingrandimento.

Mettere a fuoco manualmente gli embrioni per visualizzare il neuroblasto. Aumentare l'ingrandimento e scegliere embrioni sottoposti a intercollazione dorsale o o precoce la chiusura ventrale al microscopio a campo largo. Scegli i filtri rossi GFP e Texas e determina i piani Z ottimali sul sistema widefield.

L'utilizzo di meno Zack e meno punti temporali ridurrà la fototossicità chiudendo anche l'apertura al 30% e, se possibile, diminuendo l'intensità della luce si ridurrà ulteriormente la fototossicità. In alternativa, è possibile utilizzare un microscopio confocale a scansione dal vivo a campo spazzato o a disco rotante con software che controlla gli obiettivi dei laser a scansione, la fotocamera E-M-C-C-D e un tavolino altamente motorizzato. Ora che le impostazioni di acquisizione sono state ottimizzate, è possibile visualizzare gli embrioni al microscopio a campo largo.

Si consiglia di filmare gli embrioni di controllo prima degli embrioni RNAI. Con il sistema di campo spazzato. Impostare i laser 4 88 e 5 61 da 100 milliwatt al 40% di potenza con una fessura di 50 e un tempo di esposizione di 300 millisecondi.

È importante notare che queste impostazioni saranno diverse per altri microscopi. Posizionare il vetrino sul tavolino del microscopio, quindi utilizzare un obiettivo a basso ingrandimento per trovare gli embrioni. Quindi passa all'obiettivo a immersione in olio 60 o 100 x.

Una volta messo a fuoco, raccogli 20 pile Z a 0,2 micron ogni due minuti per un totale di 10 minuti. Il tempo di esposizione richiederà probabilmente una modifica. La fototossicità deve essere presa in considerazione quando si esegue l'imaging di embrioni vivi tramite microscopia fluorescente chiudendo l'apertura, scegliendo meno Zack o punti temporali.

Ridurre il tempo di esposizione può limitare la fototossicità, se possibile. L'uso di un campo SW o di un microscopio confocale a disco rotante può aiutare a migliorare questo problema. Determina il tuo tempo, i punti e i piani Z di interesse utilizzando il software di acquisizione.

Esporta le immagini desiderate come più tiff. Apri i piani Z desiderati per ogni punto temporale e canale di interesse nel software di elaborazione come l'immagine J e crea uno stack di neuroblasti che spesso si estende solo su pochi piani. Impilare i piani Z per ogni punto temporale e creare proiezioni di stack Z.

Ripetere l'operazione per altri canali. Una volta completate tutte le proiezioni di Zack per i punti temporali desiderati, aprire le proiezioni per creare una sequenza temporale. Fallo per ogni canale separatamente.

Per ogni canale, regolare la luminosità e il contrasto in base alle esigenze. Ruota le immagini se necessario. Quindi seleziona una regione di interesse e ritaglia le immagini.

Ora crea un'immagine unita usando la funzione dei canali uniti. Selezione di un colore diverso per ogni canale. Salva l'immagine unita come file RGB per visualizzare le immagini in modo più chiaro.

Usa le immagini TIFF a 16 bit e seleziona la funzione di inversione in modifica per creare immagini in scala di grigio per ogni canale. Per determinare la dimensione di un oggetto di interesse per i micron, tracciare una linea e moltiplicare la sua lunghezza per la dimensione dei pixel, che è determinata dai parametri di imaging. Ora, crea una barra di scala che rappresenti una proporzione della lunghezza calcolata in micron.

Infine, salva le immagini finali come tiff a otto bit. Se lo si desidera, convertire i tiff in film utilizzando l'immagine J epidermal. La morfogenesi di C elegance si verifica a causa di una combinazione di cambiamenti di forma delle cellule epidermiche, migrazione e adesione con l'aiuto dei neuroblasti proliferativi sottostanti.

Le cellule epidermiche migrano verso la linea mediana ventrale e formano un singolo strato di cellule per studiare gli embrioni di divisione dei neuroblasti, l'espressione stabile del coex e il marcatore specifico dei neuroblasti marcati con GFP e un marcatore di membrana guidato dalla madre marcato con m cherry sono stati ripresi durante la recinzione ventrale a un ingrandimento maggiore. I nuclei dei neuroblasti sono mostrati in verde e le membrane circostanti sono mostrate in rosso Le immagini time-lapse del neuroblasto in divisione delineate con la sonda della membrana mCherry in un embrione di controllo sono state catturate utilizzando un microscopio ad ampio campo per visualizzare meglio il neuroblasto in divisione negli embrioni di controllo. Ogni canale è stato mantenuto in scala di grigi e le immagini sono state invertite utilizzando embrioni di controllo al microscopio confocale a campo spazzato.

Coex che esprime ham, una GFP e il pH della ciliegia M sono stati visualizzati in una regione con neuroblasto in divisione. Gli stessi embrioni trattati con RNAI per abbattere un'espressione malata sono stati visualizzati utilizzando la microscopia ad ampio campo. A differenza degli embrioni di controllo, molti neuroblasti si sono fermati o regrediti durante la divisione e sono diventati multinucleati utilizzando la microscopia a campo spazzato.

Era anche chiaro che molti neuroblasti si bloccavano o regredivano durante la divisione e diventavano multinucleati. Questa tecnica può essere utilizzata anche per visualizzare le cellule in migrazione durante la formazione dei tessuti. Inoltre, se i tuoi Zack vengono utilizzati per consentire un imaging più veloce, è possibile ottenere maggiori informazioni sulla dinamica subcellulare.

Inoltre, con l'attrezzatura appropriata, questa tecnica potrebbe essere utilizzata per l'attivazione di sonde foto-sintonizzabili per eseguire optogenetica. Inoltre, le tecniche di microscopia come fret o fret possono essere applicate per studiare le proteine, le interazioni proteiche o la dinamica delle proteine.