Test clinici e la rimozione del midollo spinale in un modello murino di sclerosi laterale amiotrofica (SLA)

Ciao, mi chiamo Lar Turner. Sono un ricercatore post-dottorato presso il Dipartimento di Neurologia dell'Università di Ingham, in Germania. Ciao, mi chiamo Lin Gunda.

Sono uno studente di medicina e sto svolgendo il lavoro della mia tesi in questo laboratorio. Oggi vi mostreremo il test clinico del modello SODG93A di sclerosi laterale amiotrofica. Inoltre, illustreremo un test della funzione motoria mediante il cosiddetto test del rotarod e, in aggiunta, un altro test della funzione motoria con la prova della presa sul filo sospeso, al fine di eseguire un'analisi immunologica.

Dopo il test funzionale dei topi a s, una procedura necessaria consiste nella rimozione del midollo spinale, del nervo STIC e del muscolo gastrocnemio. Vogliamo mostrare in dettaglio questa procedura chirurgica e presentare alla fine alcuni esempi di risultati immunologici. Bene, ma ora iniziamo innanzitutto con i test clinici.

Questo è un MOE di tipo selvatico a movimento libero che non mostra alcun sintomo clinico come tremore muscolare o Parsis nel nostro sistema di classificazione clinica. Questo corrisponderebbe al punteggio quattro. Questo è un MOE transgenico di A LS.

In una fase precoce della malattia, presenta un grave tremore dell'arto posteriore destro che lo classifica come punteggio tre E. Le gravi alterazioni della deambulazione classificano questo animale come punteggio due. Il trascinamento di almeno un arto posteriore viene classificato come punteggio clinico uno nel test del filo sospeso, in cui viene valutata la forza muscolare degli arti posteriori. Ogni topo viene posizionato su un filo su misura e ruotato con attenzione a testa in giù sopra un cestino coperto di paglia.

Dopo aver effettuato l'addestramento per tre volte consecutive per almeno 180 secondi, viene misurata la latenza alla caduta. A ciascun topo vengono concessi fino a tre tentativi per aggrapparsi al coperchio capovolto per un massimo di 180 secondi, e viene registrato il periodo più lungo in confronto al topo di tipo filo bianco sul lato destro. Il topo transgenico con placche sul lato sinistro è molto debole e cade dal coperchio prima di raggiungere il massimo.

L'apparato del cilindro rotante viene utilizzato per misurare la coordinazione motoria, l'equilibrio e la capacità di apprendimento motorio. Un buon risultato richiede un elevato grado di coordinazione sensoriomotoria. Esso è costituito da un mandrino rotante azionato da un motore e controllato da computer, e da cinque corsie per cinque m.

I difetti nei topi vengono rilevati automaticamente attraverso la pressione esercitata sulla piastra di plastica inferiore. Dopo un addestramento di almeno 180 secondi ripetuto per tre volte consecutive a una velocità costante di 15 giri al minuto, si misura il tempo per cui un animale riesce a rimanere sul rotarod in rotazione. A ciascun animale vengono somministrati tre tentativi e viene registrata la latenza più lunga senza cadere.

Il mos di tipo selvatico sano sulla sinistra corre senza difficoltà sul cilindro rotante. Al contrario, il mos transgenico a s sulla destra ha gravi problemi a rimanere anche solo sul cilindro rotante e dopo un po' scivola via, come osservato da dietro. Si notano le gravi difficoltà di corsa del topo retre sinistro.

Rispetto al topo sano del test sul filo, non è in grado di mantenere il ritmo di rotazione della sbarretta né di spingere verso l'alto con gli arti HIN. Per eseguire un'analisi immunoistochimica del midollo spinale, gli animali devono essere sacrificati. È molto importante seguire sempre rigorosamente le linee guida locali per la corretta conduzione degli esperimenti sugli animali.

In questo contesto, in questa panoramica molto semplificata della colonna vertebrale e dei tessuti circostanti, sono rappresenturate le principali strutture anatomiche. Porremo l'animale sul suo lato ventrale e inizieremo a preparare i muscoli dal sacco dorsale. Dopo aver rimosso il tessuto muscolare, accederemo alla colonna vertebrale che racchiude il midollo spinale.

Dopo che l'animale è stato sacrificato e perfuso con una soluzione contenente paraformaldeide, può essere rimossa la colonna vertebrale. L'animale viene posizionato su un tavolo operatorio e gli arti vengono fissati lateralmente al fine di esporre la parte dorsale del topo. L'animale viene inumidito per appiattire il manto peloso e facilitare l'incisione cutanea successiva.

Per questo, si utilizza un bisturi affilato. Prestare attenzione a stirare la pelle verso entrambi i lati. Per facilitare il taglio, il muscolo della gamba deve essere preparato.

Anche la loro pelle deve essere incisa. Una volta completata l'incisione cutanea, viene delicatamente tirata da un lato. Con una pinzetta, dopo aver rimosso i muscoli della gamba e il nervo sciatico, si prosegue verso il midollo spinale e si posiziona l'animale su un nuovo tavolo operatorio.

Ora è facile identificare il collo del cranio, i muscoli e la colonna vertebrale. Dopo aver identificato tutte queste strutture, è semplice procedere al passaggio successivo. I muscoli del collo e il legamento nu devono essere rimossi.

Attenzione a non incidere troppo in profondità e a non danneggiare la colonna vertebrale. Nel passaggio successivo, i muscoli paravertebrali vengono rimossi completamente per esporre la colonna vertebrale. Per accedere alla colonna spinale, è necessario eseguire diverse osteotomie.

Partiamo dalla parte cervicale della colonna vertebrale, inclusa l'articolazione occipitoatlantoidea. Per eseguire la laminectomia, dobbiamo tagliare l'arco vertebrale per poter rimuovere tutti i processi vertebrali dal corpo vertebrale. Come spiegato in precedenza, la laminectomia inizia con il taglio degli archi vertebrali.

Quindi la dura madre può essere rimossa. Ancora una volta, prestare attenzione a non lesione il midollo spinale, poiché devono essere rimossi molti altri archi vertebrali. È molto utile utilizzare forbici angolate ed effettuare incisioni su diversi archi vertebrali di entrambi i lati contemporaneamente.

Quindi tirare sui processi dorsali per rimuovere completamente le lamine vertebrali e l'ingrandimento. Si osserva che la coppia di forbici deve essere inserita con attenzione nella posizione più laterale lungo il lato del canale spinale. Le parti laterali residue della colonna vertebrale devono essere rimosse per facilitare la successiva rimozione completa del midollo spinale.

Un punto di riferimento anatomico del midollo spinale sono le cosiddette intumescenze cervicale e lombare. Dopo aver completato le ectomie dell'intero midollo spinale, assicurarsi di aver sezionato anche tutte le radici ventrali del midollo spinale e di averlo rilasciato dalla dura madre delle meningi. Successivamente, si taglia il midollo spinale cervicale.

Verso cranialmente e la rimozione viene ripresa nuovamente. Toccare il midollo spinale con estrema cautela per non danneggiare questo tessuto, poiché ciò potrebbe causare gravi limitazioni per successive analisi immunoistochimiche. La rimozione del midollo spinale prosegue a livello toracico e viene quindi portata avanti nella regione lombare.

Infine, viene nuovamente tagliato, questa volta lateralmente rispetto al cauda equina. Ora siamo in grado di rilasciarlo completamente. Qui si osserva il midollo spinale posizionato esattamente accanto alla sua sede originaria nella colonna vertebrale.

Infine, viene posto in una soluzione fissativa a base di paraformaldeide. Come esempio classico di analisi immunohistochimica del midollo spinale, è possibile utilizzare un anticorpo specifico per la colina acetiltransferasi al fine di identificare i neuroni motori nel corno anteriore del midollo spinale. Qui si osserva un elevato numero di neuroni motori in un animale di tipo selvatico sano.

Al contrario, l'animale transgenico con SLA allo stadio terminale mostra un numero molto ridotto di neuroni motori nel corno anteriore. Dopo aver visto questo articolo video, si dovrebbe aver appreso le basi dell'esame clinico del modello murino SODG93.A di sclerosi laterale amiotrofica.

Sono stati dimostrati due test comportamentali motori: il test sul rotarod e il test del filo sospeso. Questi offrono una buona possibilità di valutare la funzione motoria di base. Sono facili da eseguire, sensibili nel rilevare deficit motori ed efficienti in termini di tempo.

La parte principale di questo video consiste nella dimostrazione della tecnica di preparazione del midollo spinale. Questa procedura può ovviamente essere applicata a qualsiasi altro modello murino di malattia ed è un passaggio essenziale per l'analisi immunochemica successiva della patologia della malattia nel midollo spinale. Grazie per aver guardato.

Speriamo che questo articolo video sarà utile per i tuoi futuri esperimenti.