Name: Il trasferimento genico in embrioni di pollo da anziani Ex ovo Elettroporazione (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-07-27T12:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 10 s
Description: Impara il trasferimento genico in embrioni di pollo avanzati mediante elettroporazione ex ovo. Questa tecnica consente di studiare la funzione e la regolazione genica in stadi successivi dello sviluppo.

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Questo lavoro è stato sostenuto da un finanziamento della Fondazione per la ricerca tedesco (DFG, LU1455/1-1).

1. Cultura Ex ovo <ol><li> Freschi uova fecondate sono stabiliti sul loro lato lungo in un forzata progetto incubatore (BSS160, Ehret, Germania) a 37,5 ° C con 60% di umidità per l&#39;incubazione. Uova conservati a 12 ° C per più di una settimana non dovrebbe essere usato. </li><li> Dopo incubazione per 2,5 giorni (circa fase HH17), estrarre le uova ed etichettare la parte superiore con una matita per indicare la direzione per il cracking. </li><li> Prima di cracking, versare circa 20 ml di acqua distillata sterile in un grande piatto pulito Petri (diametro di 145 mm; Greiner Bio-One GmbH, Germania). </li><li> Posizionare un altro piccolo piastra di Petri sterile (diametro di 94 mm; Greiner Bio-One GmbH) nel grande piatto Petri. </li><li> Rompere le uova sul fondo contro un bordo di metallo affilato, aprire con cautela le uova e trasferire l&#39;intero contenuto di ciascun uovo nella piccola scatola di Petri. </li><li> Coprire il piatto grande Petri con un coperchio e metterlo in un altro incubatore (Binder GmbH, Tuttlinge, Germania)per la cultura ulteriormente a 37,5 ° C con circa il 60% di umidità. Dopo incubazione per il numero desiderato di giorni, gli embrioni possono essere utilizzati per elettroporazione. </li></ol> 2. Preparazione per l&#39;ex ovo Elettroporazione <ol><li> Pull in vetro capillari con un estrattore microelettrodo (PUL-100 Micropipetta Puller, strumenti di precisione del Mondo, Berlino, Germania) utilizzando tubi di vetro di 1,0 mm di diametro (TW100F-4; Strumenti di precisione del Mondo) e rompere la punta dei capillari di vetro in un apposito diametro. </li><li> Impostare i parametri appropriati (ad esempio, tensioni diverse per i diversi tessuti e dimensioni di embrioni) per l&#39;elettroporazione e collegare gli elettrodi a un elettroporatore (CUY21-Edit, Nepa Gene, Chiba, Giappone) in base ai tessuti bersaglio e le dimensioni di embrioni. </li><li> Preparare una soluzione plasmide contenente plasmidi a vettore pCAGGS codificano un gene bersaglio, ad es cadherin7 (Cad7; pCAGGS-Cad7 con una concentrazione di 2,0 pg / pl) e un gene marcatore,ad esempio, proteina verde fluorescente (GFP; pCAGGS-GFP con una concentrazione di 0,25 mg / pl). Poi aggiungere verde veloce con una concentrazione finale di 0,1% (Sigma) per marcare la soluzione plasmide con il colore verde. </li><li> Caricare il capillare di vetro con la soluzione plasmide usando una pipetta a bocca. </li></ol> 3. Il trasferimento genico in Tectum pollo ottica da ex ovo Elettroporazione <ol><li> Dopo coltura ex ovo, ad esempio, di giorno incubazione (E) 6, gli embrioni di pollo sono utilizzati per esempio elettroporazione ovo. </li><li> Attenzione allo strappo le membrane amnios vitellina e il tetto ottico con una pinza sottili e aggiungere 3 gocce di soluzione sterile con sodio cloruro 0,9% sulla superficie del Tectum. </li><li> Iniettare la soluzione plasmide nella cavità del tectum dal capillare di vetro usando la pipetta bocca. </li><li> Posizionare gli elettrodi con un catodo ago di tungsteno e un anodo di piastra rettangolo (Cuy 661-3x7, Nepa Gene) accanto al Tectum eapplicare immediatamente impulsi elettrici (sei impulsi, 25 V, 60 ms lunghezza di impulso, a intervalli di 100 ms in ogni caso) prodotte dalla elettroporatore al Tectum. </li><li> Coprire il piatto Petri grande con il coperchio e restituirla nell&#39;incubatore. Dopo incubazione per giorno appropriate (ad esempio, 2 o 3 giorni dopo l&#39;elettroporazione), il tectum sono raccolti e fissati per immunocolorazione (figura 1) e il rilevamento biologico. </li></ol> 4. Risultati rappresentativi Sovraespressione successo delle proteine ​​esogene di Cad7 e GFP da ex elettroporazione ovo è illustrato nella figura 1 come esempio. Quando Cad7 insieme plasmide con GFP plasmide è stato elettroporata in tectum a E6, due o tre giorni dopo l&#39;elettroporazione gli embrioni sono stati raccolti e fissati. Al E8, la proteina GFP è fortemente espresso nel tetto in intere immagini montaggio (Figura 1A-C). Inoltre, nelle sezioni del tectum a E9,Proteina GFP (verde in figura 1D) e Cad7 proteina (rosso in Figura 1E) sono coespressa (giallo in figura 1F), suggerendo che ex elettroporazione ovo è un metodo efficace per il trasferimento genico in gli embrioni di pollo anziani in vivo. <img src="/files/ftp_upload/4078/4078fig1.jpg" alt="Figura 1"/> Figura 1. Quando il plasmidi codifica GFP e Cad7 sono cotransfected nel tectum pollo a E6, due o tre giorni dopo l&#39;elettroporazione ex ovo, proteina GFP (verde) è fortemente espresso come mostrato in immagini wholemount (AC) a E8. Nelle sezioni del tectum a E9, proteina GFP (green in D) e Cad7 proteine ​​(rosso in E) sono coespressi (giallo in F). BF, immagine campo chiaro. Scale bar: 200 micron in A per AC; 100 micron di D per DF.

<ol><li>Momose, T., Tonegawa, A., Takeuchi, J., Ogawa, H., Umesono, K., Yasuda, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+targeting+of+gene+expression+in+chick+embryos+by+microelectroporation%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Growth+Differ%22%5BJournal%5D)">Efficient targeting of gene expression in chick embryos by microelectroporation.</a> Dev. Growth Differ. 41, 335-344 (1999).</li>
<li>Luo, J., Ju, M. J., Lin, J., Yan, X., Markus, A., Mix, E., Rolfs, A., Redies, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cadherin-20+expression+by+motor+neurons+is+regulated+by+Sonic+hedgehog+during+spinal+cord+development%5BTitle%5D)+AND+%22NeuroReport%22%5BJournal%5D)">Cadherin-20 expression by motor neurons is regulated by Sonic hedgehog during spinal cord development.</a> NeuroReport. 20, 365-370 (2009).</li>
<li>Luo, J., Ju, M. J., Redies, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regionalized+cadherin-7+expression+by+radial+glia+is+regulated+by+Shh+and+Pax7+during+chicken+spinal+cord+development%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Regionalized cadherin-7 expression by radial glia is regulated by Shh and Pax7 during chicken spinal cord development.</a> Neuroscience. 142, 1133-1143 (2006).</li>
<li>Nakamura, H., Katahira, T., Sato, T., Watanabe, Y., Funahashi, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gain-+and+loss-of-function+in+chick+embryos+by+electroporation%5BTitle%5D)+AND+%22Mech.+Dev%22%5BJournal%5D)">Gain- and loss-of-function in chick embryos by electroporation.</a> Mech. Dev. 121, 1137-1143 (2004).</li>
<li>Dai, F., Yusuf, F., Farjah, G. H., Brand-Saberi, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNAi-induced+targeted+silencing+of+developmental+control+genes+during+chicken+embryogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">RNAi-induced targeted silencing of developmental control genes during chicken embryogenesis.</a> Dev. Biol. 258, 80-90 (2005).</li>
<li>Rao, M., Baraban, J. H., Rajaii, F., Sockanathan, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+comparative+study+of+RNAi+methodologies+by+in+ovo+electroporation+in+the+chick+embryo%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Dyn%22%5BJournal%5D)">In vivo comparative study of RNAi methodologies by in ovo electroporation in the chick embryo.</a> Dev. Dyn. 231, 592-600 (2004).</li>
<li>Kos, R., Tucker, R. P., Hall, R., Duong, T. D., Erickson, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methods+for+introducing+morpholinos+into+the+chicken+embryo%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Dyn%22%5BJournal%5D)">Methods for introducing morpholinos into the chicken embryo.</a> Dev. Dyn. 226, 470-477 (2003).</li>
<li>Hamburger, V., Hamilton, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+series+of+normal+stages+in+the+development+of+the+chick+embryo%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Morphol%22%5BJournal%5D)">A series of normal stages in the development of the chick embryo.</a> J. Morphol. 88, 49-92 (1951).</li>
<li>Auerbach, R., Kubai, L., Knighton, D., Folkman, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+procedure+for+the+long-term+cultivation+of+chicken+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">A simple procedure for the long-term cultivation of chicken embryos.</a> Dev. Biol. 10, 391-394 (1974).</li>
<li>Luo, J., Treubert-Zimmermann, U., Redies, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cadherins+guide+migrating+Purkinje+cells+to+specific+parasagittal+domains+during+cerebellar+development%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Cadherins guide migrating Purkinje cells to specific parasagittal domains during cerebellar development.</a> Mol. Cell. Neurosci. 25, 138-152 (2004).</li>
<li>Luo, J., Redies, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ex+ovo+electroporation+for+gene+transfer+into+older+chicken+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Dyn%22%5BJournal%5D)">Ex ovo electroporation for gene transfer into older chicken embryos.</a> Dev. Dyn. 233, 1470-1477 (2005).</li>
<li>Treubert-Zimmermann, U., Heyers, D., Redies, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+axons+to+specific+fiber+tracts+in+vivo+by+altering+cadherin+expression%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Targeting axons to specific fiber tracts in vivo by altering cadherin expression.</a> J. Neurosci. 22, 7617-7626 (2002).</li>
</ol>

Non ci sono conflitti di interesse dichiarati.

Questo protocollo fornisce una guida per il trasferimento del gene in embrioni di pollo grandi (ad esempio, nel tetto ottico a E6) di elettroporazione ex ovo. Questo metodo estende l&#39;utilizzo di elettroporazione di embrioni di pollo anziani e può essere facilmente applicato a molti laboratori per lo studio della funzione genica in vivo in fasi successive. Gli embrioni da E4 ad almeno E7 può essere successo elettroporate con questo metodo e gli embrioni possono essere elettroporate sopravvivenza fin...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome </td><td> Azienda </td><td> Numero di catalogo </td></tr><tr><td> Elettroporatore </td><td> Nepa Gene, Giappone </td><td> CUY21-Edit </td></tr><tr><td> Elettrodi </td><td> Nepa Gene, Giappone </td><td> CUY661-3x7 </td></tr><tr><td> Egg incubatore </td><td> Ehret, Germania </td><td> BSS160 </td></tr><tr><td> Embryo incubatore </td><td> BINDER GmbH, Germany </td><td></td></tr><tr><td> Microscopio a fluorescenza </td><td> Keyence, Deutschland GmbH </td><td> BZ-8000 </td></tr><tr><td> Petri </td><td> Greiner Bio-One GmbH, Germania </td><td></td></tr><tr><td> Microelettrodo puller </td><td> Mondiale strumenti di precisione, Germania </td><td> PUL-100 </td></tr></tbody></table>

il trasferimento genico in embrioni di pollo da anziani<em&gt; ex ovo</em&gt; elettroporazione

Gene Transfer into Older Chicken Embryos by ex ovo Electroporation

L&#39;embrione di pollo fornisce un ottimo sistema modello per studiare la funzione del gene e la regolazione durante lo sviluppo embrionale. In elettroporazione ovo è un metodo efficace per geni esogeni over-espressa o down-regolare i geni endogeni in vivo in embrioni di pollo 1. Di strutture diverse come i geni codificanti del DNA plasmidi 2-4, piccoli RNA interferenti (siRNA) 5 plasmidi, piccoli RNA sintetico oligos 6 e 7 morpholino oligonucleotidi antisenso può essere facilmente trasfettati in embrioni di pollo mediante elettroporazione. Tuttavia, l&#39;applicazione di elettroporazione in ovo è limitata a embrioni nelle fasi iniziali di incubazione (meno di stage HH20 - in base ad Amburgo e Hamilton) 8 e ci sono alcuni svantaggi per la sua applicazione in embrioni in fasi successive (più vecchio di stage HH22 - circa 3,5 giorni di sviluppo). Ad esempio, la membrana vitellina in fasi successive è solitamentealleato attaccato alla membrana deve e aprendo una finestra nel guscio provoca la rottura dei vasi, con conseguente morte degli embrioni; vecchi embrioni sono coperti da navi vitellina e allantoico, dove è difficile accedere e manipolare gli embrioni; vecchi embrioni spostare vigorosamente ed è difficile controllare l&#39;orientamento attraverso una finestra relativamente piccola nel guscio. In questo protocollo si dimostra un metodo di elettroporazione ex ovo per il trasferimento del gene in embrioni di pollo nelle fasi tardive (di età superiore a stage HH22). Per elettroporazione ex ovo, gli embrioni vengono coltivati ​​in piastre di Petri 9 e il vitellino e vasi allantoide sono ampiamente diffuse. In queste condizioni, gli embrioni di pollo anziani sono facilmente accessibili e manipolati. Pertanto, questo metodo supera gli svantaggi della elettroporazione in ovo applicata ai vecchi embrioni di pollo. Utilizzando questo metodo, plasmidi possono essere facilmente trasfettato in parti differentidegli embrioni di pollo anziani 10-12.

Un metodo di trasferimento genico in embrioni di pollo in fasi successive di incubazione (più di Hamburger e Hamilton stadio (HH) 22) è descritto. Questo metodo supera inconvenienti<em&gt; In ovo</emElettroporazione&gt; applicata a embrioni di pollo anziani ed è una tecnica utile per studiare la funzione regolazione dei geni e alle vecchie stadi di sviluppo.

Il trasferimento genico in embrioni di pollo da anziani<em&gt; Ex ovo</em&gt; Elettroporazione

L'embrione di pollo rappresenta un eccellente modello sperimentale per studiare la funzione e la regolazione genica durante lo sviluppo embrionale. L'elettroporazione in ovo è...

L'obiettivo generale di questa procedura è eseguire il trasferimento genico in embrioni di pollo più sviluppati in vivo, al fine di studiare la funzione e la regolazione genica in stadi avanzati dello sviluppo. Questo risultato si ottiene innanzitutto rompendo un uovo dopo circa 2,5 giorni di incubazione e trasferendo l'intero embrione in un sistema di piastra di Petri. Il secondo passaggio consiste nell'iniettare il plasmide, che codifica per il gene di interesse, nella parte appropriata dell'embrione.Dopo l'iniezione del plasmide, posizionare gli elettrodi accanto all'embrione ed eseguire l'elettroporazione X ovo; l'ultimo passaggio consiste nel raccogliere gli embrioni elettroporati per l'analisi. In definitiva, l'immunohistochimica viene utilizzata per rilevare l'espressione dei geni trasferiti nell'embrione. Oggi vi mostreremo come eseguire l'elettroporazione X oval utilizzando BULs di pollo.Il vantaggio principale di questa tecnica è che X sull'elettroporazione può superare i problemi di in sull'elettroporazione utilizzati per il trasferimento genico in embrioni di pollo più sviluppati. Una coltura X in ovo di embrioni di pollo di successo richiede l'utilizzo di uova fecondate fresche. Non utilizzare uova conservate a 12 gradi Celsius per più di una settimana.Posizionare le uova su un lato lungo in un incubatore a circolazione forzata a 37,5 gradi Celsius con un'umidità del 60% dopo un'incubazione di 2,5 giorni. Quando gli embrioni raggiungono circa lo stadio di Hamburger e Hamilton 17, rimuovere le uova dall'incubatore.Etichettare la parte superiore di ogni uovo con una matita per indicare la direzione in cui aprirlo. Versare circa 20 millilitri di acqua distillata sterile in una piastra di Petri pulita e grande con un diametro di 145 millimetri. Posizionare una piccola piastra di Petri sterile con un diametro di 94 millimetri all'interno della piastra di Petri grande.Successivamente, rompere ogni uovo battendo la parte inferiore contro un bordo metallico affilato. Aprire con attenzione l'uovo e trasferirne l'intero contenuto nella piccola capsula di Petri. Per garantire una buona qualità dell'embrione, l'intero contenuto dell'uovo deve essere mantenuto in una forma normalmente rotonda all'interno del sistema di capsule di Petri, senza arrecare alcun danno alla membrana vilinica.Dopo aver trasferito il contenuto di ogni uovo nella piccola piastra, coprire la piastra grande con un coperchio. Posizionare i sistemi di piastre di Petri in un secondo incubatore per la coltura successiva a 37,5 gradi Celsius con circa il 60% di umidità prima dell'elettroporazione ex ovo. Utilizzare un polarizzatore microelettrico per tirare le capillari di vetro da tubi di vetro con diametro di 1,0 millimetro.Rompere la punta delle capillari di vetro fino a ottenere un diametro appropriato. Successivamente, impostare i parametri adeguati per l'elettroporazione, come diverse tensioni per tessuti diversi e in base alla dimensione degli embrioni. Collegare gli elettrodi appropriati all'elettroporatore in base al tessuto bersaglio e alla dimensione degli embrioni.Preparare una soluzione di plasmidi contenente plasmidi che codificano per un gene bersaglio e un gene marcatore. In questa dimostrazione, la cadherina sette o CAD sette è il gene bersaglio e la proteina verde fluorescente o GFP è il marcatore. Aggiungere il fast green fino a raggiungere una concentrazione finale dello 0,1% per etichettare la soluzione di plasmidi in verde.Infine, utilizzare una pipetta a bocca per caricare la capillare di vetro con la soluzione plasmidica. Per l'elettroporazione X ovo si utilizzano embrioni di pollo coltivati in ovo e incubati per sei giorni. Per iniziare questa procedura, utilizzare pinzette fini per strappare con attenzione le membrane di tilionio e amnios sopra il tetto ottico e aggiungere tre gocce di soluzione sterile di cloruro di sodio 0,9% sulla superficie del tetto.Utilizzando una pipetta a bocca, iniettare la soluzione plasmidica dalla capillare di vetro nella cavità del tetto. Posizionare gli elettrodi con una calamita di tungsteno come catodo e una piastra rettangolare come anodo accanto al tetto. Applicare immediatamente degli impulsi elettrici al tetto mediante elettroporazione.Coprire la grande piastra di Petri con il coperchio e riporla nell'incubatore due o tre giorni dopo l'elettroporazione di plasmidi codificanti GFP e CAD sette nel tetto mesencefalico del pollo a E sei; i tetti vengono quindi raccolti e fissati per l'immunomarcatura. I risultati sono mostrati in questa figura a E otto. La proteina GFP è fortemente espressa nel tetto, come indicato da queste immagini in preparazione intera riportate qui.Il pannello A è un'immagine in campo chiaro. Il pannello B è un'immagine GFP e il pannello C è un'immagine sovrapposta. Inoltre, nelle sezioni del tetto mesencefalico a E9, la proteina GFP visualizzata in verde nel pannello D e la proteina CAD7 visualizzata in rosso nel pannello E sono coespressi, come rappresentato dal colore giallo nel pannello F. Quando eseguita correttamente, l'efficienza dell'elettroporazione X ovo è compresa tra il 60 e il 100%. Questi risultati indicano che l'elettroporazione X ovo è un metodo efficace per il trasferimento genico in embrioni di pollo più sviluppati in vivo.Dopo aver visionato questo video, dovresti avere una buona comprensione di come eseguire il trasferimento genico in embrioni di pollo più sviluppati e buona fortuna con il tuo esperimento.

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