Il trasferimento genico in embrioni di pollo da anziani Ex ovo Elettroporazione

L'obiettivo generale di questa procedura è quello di eseguire il trasferimento genico in embrioni di pollo più anziani in vivo per studiare la funzione genica e la regolazione nelle fasi di sviluppo più avanzate. Ciò si ottiene rompendo prima un uovo intorno al giorno di incubazione 2,5 e trasferendo l'intero embrione in un sistema di piastre di Petri. Il secondo passo consiste nell'iniettare il plasmide, codificando il gene di interesse nella parte appropriata dell'embrione.

Dopo aver iniettato il plasmide, posizionare gli elettrodi accanto all'embrione ed eseguire l'elettroporazione X ovo, il passaggio finale consiste nel raccogliere gli embrioni elettroporati per l'analisi. In definitiva, l'immunoistochimica viene utilizzata per rilevare l'espressione dei geni trasferiti nell'embrione. Oggi ti mostreremo come eseguire l'elettroporazione ovale X utilizzando i BUL di pollo.

Il vantaggio principale di questa tecnica è che l'elettroporazione X può superare i problemi dell'elettroporazione eccessiva utilizzata per il trasferimento genico negli embrioni di pollo più anziani. Il successo della coltura X ovo di embrioni di pollo richiede l'uso di uova fresche fecondate. Non utilizzare uova conservate a 12 gradi Celsius per più di una settimana.

Deporre le uova sui lati lunghi in un'incubatrice a tiraggio forzato a 37,5 gradi Celsius con il 60% di umidità dopo un'incubazione di 2,5 giorni. Quando gli embrioni sono a circa hamburger e Hamilton. Fase 17, estrarre le uova dall'incubatrice.

Etichetta la parte superiore di ogni uovo con una matita per indicare la direzione di rottura per ogni uovo. Versare circa 20 millilitri di acqua distillata sterile in una capsula di Petri grande e pulita con un diametro di 145 millimetri. Inserire una piccola piastra di Petri sterile con un diametro di 94 millimetri nella capsula di Petri grande.

Quindi, rompi ogni uovo sul fondo contro un bordo di metallo affilato. Aprire con cura l'uovo e trasferirne tutto il contenuto nella piccola capsula di Petri. Per garantire la buona qualità dell'embrione, l'intero contenuto dell'ovulo deve essere conservato in una forma normalmente rotonda in un sistema di piastre di Petri senza alcuna lesione alla membrana del vilin.

Dopo aver trasferito il contenuto di ogni uovo nel piatto piccolo, coprite il piatto grande con un coperchio. Mettere i sistemi di piastre di Petri in un altro incubatore per un'ulteriore coltura a 37,5 gradi Celsius con circa il 60% di umidità prima dell'elettroporazione X ovo. Utilizzare un micro elettrodo polare per estrarre capillari di vetro da tubi di vetro di 1,0 millimetri di diametro.

Rompere la punta dei capillari di vetro in un diametro appropriato. Successivamente, impostare i parametri appropriati per l'elettroporazione, come tensioni diverse per il tessuto distinto e le dimensioni degli embrioni. Collegare gli elettrodi appropriati all'elettro in base al tessuto bersaglio e alle dimensioni degli embrioni.

Preparare una soluzione plasmidica contenente plasmidi, codificante un gene bersaglio e un gene marcatore. In questa dimostrazione, la caderina sette o CAD sette è il bersaglio e la proteina fluorescente verde o GFP è il marcatore. Aggiungere il verde veloce a una concentrazione finale dello 0,1% per etichettare la soluzione plasmidico in verde.

Infine, utilizzare una pipetta orale per caricare il capillare di vetro con la soluzione plasmidica. Gli embrioni di pollo provenienti dalla coltura di X ovo che sono stati incubati per sei giorni vengono utilizzati per l'elettroporazione di X ovo. Per iniziare questa procedura, utilizzare una pinza fine per strappare con cura le membrane di tylene e amnio sopra il tectum ottico e aggiungere tre gocce di soluzione sterile di cloruro di sodio allo 0,9% sulla superficie del tectum.

Utilizzando una pipetta per bocca, iniettare la soluzione plasmidica dal capillare di vetro nella cavità del tectum. Posizionare gli elettrodi con un catodo ad ago di tungsteno e un anodo a piastra rettangolare accanto al tectum. Utilizzare immediatamente l'elettro per applicare impulsi elettrici al tectum.

Coprire la grande capsula di Petri con il coperchio e rimetterla nell'incubatore due o tre giorni dopo l'elettroporazione dei plasmidi che codificano GFP e CAD sette nel tectum di pollo a E sei, i tectum vengono raccolti e fissati per l'immunocolorazione. I risultati sono mostrati in questa figura a E otto. La proteina GFP è fortemente espressa nel tum, come indicato da queste immagini dell'intera montatura qui.

Il pannello A è un'immagine in campo chiaro. Il pannello B è un'immagine GFP e il pannello C è emerso. Immagine Inoltre, nelle sezioni del tectum a E, nove proteine GFP visualizzate in verde nel pannello D e CAD sette proteine visualizzate in rosso nel pannello E sono co-espresse come rappresentate dal colore giallo nel pannello F.Se eseguita correttamente, l'efficienza dell'elettroporazione X ovo è compresa tra il 60 e il 100%Questi risultati suggeriscono che l'elettroporazione X ovo è un metodo di successo per il trasferimento genico in embrioni di pollo più anziani in vivo.

Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come eseguire il trasferimento genico in embrioni di pollo più vecchi e buona fortuna con il tuo esperimento.