Name: Sintesi in fase solida di un funzionalizzato Bis-Peptide Uso di Sicura del fucile Metodologia (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-05-15T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 42 s
Description: Scopri la sintesi di bis-peptidi funzionalizzati mediante tecniche in fase solida con metodologia "safety catch". Questo protocollo dimostra l'assemblaggio su resina HMBA per ottenere prodotti con elevata purezza.

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Gli autori desiderano ringraziare il Dr. Zachary Z. Brown e Jennifer Alleva per lo sviluppo iniziale di questa tecnica di sintesi in fase solida e Matthew Parker FL utili per le discussioni. Questo lavoro è supportato dalla Defense Threat Reduction Agency (DOD-DTRA) (HDTRA1-09-1-0009) e Horst Witzel Fellowship Award supportato da Cephalon, Inc.

1. Setup <ol><li> La reazione set-up per la sintesi in fase solida è una cartuccia filtro di polipropilene o reattore di vetro che è collegato mediante un tubo di polipropilene ad un pallone chiuso filtrazione sotto vuoto, come mostrato nella Figura 1. La reazione può essere miscelato con un agitatore magnetico o da gorgogliare azoto attraverso il reattore. </li><li> Un collettore gas collegato ad una bombola Argon dotato di un tubo di essiccazione e di gorgogliamento olio è inoltre consigliabile in quanto permette il recipiente di reazione deve essere contenuta in atmosfera inerte e permette la rimozione di reagenti da contenitori sigillati. </li><li> Tutte le operazioni vengono eseguite in una cappa aspirante e proprio dispositivo di protezione individuale (occhiali, camice e guanti di nitrile) è obbligatorio. </li></ol> 2. Primo caricamento Bis-Peptide Onto Resina <ol><li> Pesare 114 mg di HMBA-AM Resina (0,88 mmol / g di carico, 100 mmol) in 8 ml di reazione recipiente e aggiungere barra magnetica di agitazione. Chiudere la parte superiore del secolorecipiente e con un setto di gomma e il tubo di spurgo con argon per almeno 5 minuti. </li><li> Nel frattempo, pesano 117,3 mg del composto 1 della figura 3 (586,63 g / mol, 2 eq) e 59,2 mg di 1 - (mesitilene-2-solfonil)-3-nitro-1 ,2,4-triazolo (MSNT, 296,0 g / mol, 2 eq) in una provetta da centrifuga 15 mL monouso e sciogliere in 2 mL di diclorometano anidro (DCM). Aggiungere 24 microlitri di 1-metilimidazolo (NMI, 80,81 mL / mol, 3eq) alla soluzione e mescolare fino a completo scioglimento. </li><li> Trasferire la soluzione attivata al recipiente di reazione attraverso una siringa e consentono di mescolare sotto argon notte (circa 10 ore). </li><li> Rimuovere il setto e drenare la miscela di reazione. Lavare la resina con DCM (5x) e dimetilformammide (DMF) (5x). Eseguire il &quot;test rosso metile&quot; descritto nel paragrafo 10.1 per valutare il grado di carico resina. Se la resina rimane rosso durante il test rosso metile passi poi 2.2 e 2.3 deve essere ripetuto. Un colore giallo, indicativo di un test negativo rosso di metile, è preferito;Tuttavia, poiché tutti i gruppi ossidrilici rimanenti saranno limitati nel passaggio successivo, un risultato leggermente positivo (colore luce resina arancione) può essere accettabile. </li></ol> 3. Deprotezione della prima resina Bis-peptide e simultanea Capping <ol><li> Aggiungere 1 mL di DCM al recipiente di reazione si aggiunge 1 ml di acido bromidrico 33% in acido acetico a gocce nell&#39;arco di 30 secondi (bolle verifica) e permettono a mescolare per 15 minuti. Scolare e lavare la resina con DCM (5x) e poi ripetere il procedimento una volta di più. </li><li> Lavare la resina con DCM (5x) quindi DMF (5x). Neutralizzare il resina mediante lavaggio due volte con un 5% v / v soluzione di N, N-diisopropiletilammina (DIPEA) in DMF, poi lavare con DCM (5x) e DMF (5x) nuovamente. Eseguire il &quot;test rosso metile&quot; e &quot;test cloranile&quot; discusso nella sezione 10.1 e 10.2. I risultati dovrebbero essere negativo per il rosso metile, test e positivo per il test cloranile. </li></ol> 4. Giunto Boc / tBu-Protetto funzionalizzato Bis-Amino Acid <ol><li> Reintrodurre un&#39;atmosfera inerte alla resina contenente recipiente di reazione mediante lavaggio tre volte con DCM anidro poi attaccare un setto e linea di argon. Spurgare e lavare il contenitore con l&#39;aggiunta di 1-2 mL di DCM anidro e lasciare che si agita per 30 secondi, quindi lo scarico della nave fino a quando la linea di argon gorgogliatore comincia a salire. Fate questo almeno una volta di più. </li><li> Preparare una soluzione di 0,15 M funzionalizzata bis-amminoacido (3eq) e 245 mg di 1-idrossi-7-azabenzotriazole (HOAT, 136,11 g / mol, 18eq) in 2 mL di 2:1 DCM: DMF in un test fiamma essiccata Tubo in atmosfera di argon. Aggiungere 47 microlitri di diisopropilcarbodiimmide (DIC, 156,6 mL / mol, 3eq) e mescolare per 90 minuti. </li><li> Aggiungere 35 microlitri DIPEA (174,19 ml / mol, 2 eq) in 666 pl DMF anidra di resina e consentire in agitazione per 5 minuti. </li><li> Trasferire la pre-attivato bis-ammino soluzione acida recipiente di reazione attraverso una siringa e consentono di agitazione per una notte. </li><li> Scolare la miscela di reazione e lavare due volte con DCM anidro mentre sotto<html> argon. </li><li> Per promuovere la chiusura del dichetopiperazina, aggiungere una soluzione 0,25 M di HOAT (136,11 g / mol, 10eq) e DIC (156,6 mL / mol, 10eq) in uno 4 mL di 1:1 DCM: DMF e permettono di mescolare sotto argon per 1 ora. </li><li> Rimuovere il setto e drenare la miscela di reazione. Lavare la resina con DCM (5x) e DMF (5x). Se lo si desidera, eseguire il &quot;test cloranile&quot; discusso nella sezione 10.2. </li></ol> 5. Deprotezione di Boc / tBu-Protetto funzionalizzato Bis-Amino Acid <ol><li> Aggiungere 2 mL di una soluzione di acido trifluororacetic 95:5 (TFA): triisopropilsilano (TIPS) al recipiente di reazione e permettono di mescolare per 1 ora. Scolare e lavare la resina per circa 30 secondi con DCM (5x) e poi ripetere il procedimento una volta di più. </li><li> Lavare la resina con DCM (5x) quindi DMF (5x). Neutralizzare il resina mediante lavaggio due volte con un 5% v / v soluzione di DIPEA in DMF, poi lavare DCM (5x) e DMF (5x) nuovamente. Se lo si desidera, eseguire il &quot;test cloranile&quot; discusso nella sezione 10.2. </li></ol>Le &quot;&gt; 6. Ripetere i punti 4 e 5 come desiderato per sintetizzare mirati bis-peptide. 7. Funzionalizzazione del Bis-Peptide End Prolidine <ol><li> La fine prolidine del crescente bis-peptide può essere acilati indipendentemente o insieme attraverso un dichetopiperazina. Inoltre, tale fine può essere omesso protetto, che sarà clivato quest&#39;ultimo, offrendo l&#39;amminoacido libero. Se lo si desidera, eseguire il &quot;test cloranile&quot; discusso nel paragrafo 10.2 per valutare l&#39;efficienza di accoppiamento. </li></ol> 8. La deprotezione del Fmoc e Acilazione della fine quaternario del Bis-Peptide <ol><li> Una soluzione 2 ml di 20% piperidina in DMF viene aggiunto e la reazione viene mescolata per 20 minuti. Scolare e lavare la resina con DMF (5x) e poi ripetere il procedimento una volta di più. </li><li> Lavare la resina con DCM (5x) quindi DMF (5x). </li><li> Preparare una soluzione 0,15 M di amminoacido (3eq) in 2 mL di N-metilpirrolidone (NMP) con 114 mg 2 - (7-aza-1H-benzotriazolo-1-il) -1,1,3,3-tetrametiluronio esafluorofosfato<html> (HATU, 380,2 g / mol, 3eq) e 104,5 ul DIPEA (174,19 mL / mol, 6EQ) e mescolare bene. Aggiungere al recipiente di reazione e permettono di agitare per 6 ore. </li><li> Lavare la resina con DCM (5x) quindi DMF (5x). </li></ol> 9. Rimuovere il gruppo Boc dalla resina Bound Amino Acid e Cleave in resina <ol><li> Aggiungere 2 mL di TFA 1:1: soluzione DCM al recipiente di reazione e permettono di agitare per 30 minuti. Scolare e lavare la resina con DCM (5x) e poi ripetere il procedimento una volta di più. </li><li> Lavare e asciugare la resina per 30 secondi con DCM (5x) e poi DMF (5x). </li><li> Aggiungere 2 mL di una soluzione al 10% DIPEA in DMF anidra e permettono di mescolare 24-48 ore. </li><li> Raccogliere miscela di reazione in pre-pesato pallone a fondo tondo. Trasferire 30 pl di questa soluzione a 450 pl di THF in un flacone LC-MS per l&#39;analisi e presentare. Lavare la resina con ulteriori aliquote di DMF e raccogliere nel pallone a fondo tondo quindi rimuovere il solvente sotto vuoto. </li></ol>dflinebreak &quot;&gt; 10. Purificazione di Bis-Peptide <ol><li> Sciogliere grezzo bis-peptide in una quantità minima di dimetilsolfossido (100-250 mL) e trasferimento nell&#39;inserto flaconcino HPLC. Inserire luogo in autocampionatore di semi-prepitive sistema HPLC (Hewlett Packard serie 1100) equipaggiato con un Prep XTerra MS C18 5 um 7.8x150 colonna mm e 100 pl ciclo di iniezione. </li><li> Eseguire più di 50 iniezioni ul del campione utilizzando un programma di pendenza 5-95% acetonitrile in acqua con 0,1% di acido formico in 30 minuti durante il monitoraggio a 274 nm. Raccogliere il picco prodotto in pre-pesato monouso provetta da centrifuga e congelare a secco utilizzando una liofilizzatore. Attenzione deve essere assunto con la prima esecuzione, come un leggero cambiamento nel tempo di ritenzione di picco rispetto al LCMS analitici si osserva tipicamente. </li></ol> 11. Metodi di valutazione <ol><li> METILE ROSSO TEST 7: Rimuovere ~ 1 mg di resina a secco tramite pipetta monouso e lavare in 4 mL recipiente di reazione. Aggiungere una soluzione di 20 mg rosso di metile, 50 microlitri N, N&#39;-diisopropilcarbodiimmide (DIC), 5 mg e 4-dimetilamminopiridina (DMAP) in 500 pl DCM anidro e permettono a mescolare per 5-10 min. Scolare e lavare resina con DCM fino a quando il filtrato diventa incolore. L&#39;indicazione è positiva le gocce di resina restanti arancione o rosso. </li><li> Cloranile TEST 12: Transfer ~ 1 mg di resina a secco in una piccola fiala tramite pipetta monouso. Aggiungere 3 gocce di sia cloranile 0,8 mM in DMF e la soluzione al 2% in soluzione acetaldeide DMF e lasciate riposare a temperatura ambiente per 5-10 minuti. L&#39;indicazione è positiva le gocce di resina di tornitura blu / viola. </li><li> TRAP TEST ATTIVAZIONE: composti attivati ​​durante la sintesi può essere valutata trasferendo una piccola quantità (pl 5-10) della soluzione attivata per un liquido cromatografia-spettrometria di massa (LC-MS) flacone contenente 50 pl di pirrolidina. Mescolare a mano per pochi secondi (SOLUZIOdovrebbe diventare il giallo) e poi diluire con 450 microlitri di tetraidrofurano (THF) e sottoporre LC-MS. </li><li> ANALITICA LC-MS: Il prodotto finale e intermedi attivati ​​possono essere valutato utilizzando un HP 1200 serie LC-MS impianto dotato di Waters XTerra MS C18 3,5 micron 4,6 mm x 150 mm di colonna ed un sistema gradiente 5-95% di acetonitrile in acqua con 0,1% di acido formico in 30 minuti. </li></ol> 12. Risultati rappresentativi Un esempio di entrambi grezzo (Figura 4) e purificata (Figura 5) tracce LCMS sono fornite. Purificati rese di circa il 10% si aspetta con le modalità sopra descritte. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/4112/4112fig1.jpg" /> Figura 1. Schema di set-up sperimentale per la sintesi in fase solida. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/4112/4112fig2.jpg" /> Figura 2.Nomenclature rilevanti del Bis-aminoacidi / bis-peptidi. <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/4112/4112fig3.jpg" /> Figura 3. Complesso schema sintetico. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/4112/4112fig3large.jpg" target="_blank">Clicca qui per ingrandire la figura</a> . <img alt="Figura 4a" src="/files/ftp_upload/4112/4112fig4a.jpg" /> Figura 4a. Trace HPLC del prodotto grezzo a 274 nm. <img alt="Figura 4b" src="/files/ftp_upload/4112/4112fig4b.jpg" /> Figura 4b. Spettro di MS Peak prodotto grezzo. <img alt="Figura 5a" src="/files/ftp_upload/4112/4112fig5a.jpg" /> Figura 5a. HPLC Trace di prodotto purificato a 274 nm. <img alt="Figura 5b" src="/files/ftp_upload/4112/4112fig5b.jpg" /> Figura 5b. Spettro di MS purificato Product Peak.

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<li>Komba, S., Sasaki, S., Machida, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+New+Colorimetric+Test+for+Detection+of+Hydroxyl+Groups+in+Solid-Phase+Synthesis%5BTitle%5D)+AND+%22Tet.+Lett%22%5BJournal%5D)">A New Colorimetric Test for Detection of Hydroxyl Groups in Solid-Phase Synthesis.</a> Tet. Lett. 48, 2075-2078 (2007).</li>
<li>Demner, O., Dijkgraaf, I., Schottelius, M., Wester, H. J., Kessler, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Introduction+of+Functional+Groups+into+Peptides+via+N-Alkylation%5BTitle%5D)+AND+%22Org.+Lett%22%5BJournal%5D)">Introduction of Functional Groups into Peptides via N-Alkylation.</a> Org. Lett. 10, 2015-2018 (2008).</li>
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<li>Kaiser, E., Colescot, R. L., Bossinger, C. D., Cook, P. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Color+Test+for+Detection+of+Free+Terminal+Amino+Groups+in+Solid-Phase+Synthesis+of+Peptides%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Biochem%22%5BJournal%5D)">Color Test for Detection of Free Terminal Amino Groups in Solid-Phase Synthesis of Peptides.</a> Anal. Biochem. 34, 595-598 (1970).</li>
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</ol>

Non ci sono conflitti di interesse dichiarati.

L&#39;approccio sintetico qui presentato fornisce un metodo per la sintesi di funzionalizzati bis-peptidi da blocchi acido bis-ammino costruzione utilizzando comuni tecniche in fase solida di sintesi peptidica. La sintesi di monomeri di questi &quot;mattoni&quot; PRO4 di trans-4-idrossiprolina 3 è altamente scalabile ed è stato completato con successo alla fase idantoina a 600 mmol (234 g) scala (non pubblicato). Una volta che i monomeri sono in mano, l&#39;uso di tecniche in fase solida fornisce un metodo più rapido di bis-peptide sintesi del nostro attuale soluzione fase metodologia 4 eliminando la necessità di reazione work-up e purificazioni intermedi. La sfida primario in sintesi in fase solida viene diagnosi progressi sintetico e risolvere problemi in quanto non intermedi sono isolati. Questo ha portato allo sviluppo di numerosi test colorimetrici comprese quelle per identificare se ammine libere (Kaiser Test 10) o senza idrossidoYLS (Methyl Red Test 7), sono esposti su resina. Sfortunatamente, il test comunemente usato Kaiser 10 non è generalmente applicabile nel nostro sintesi in fase solida per l&#39;utilizzo quasi esclusivo di ammine secondarie o ammine attaccati ad un carbonio quaternario. Altre opzioni per la valutazione di resina HMBA includono divisioni di prova utilizzando un nucleofilo quale idrazina 11, quantitativa scissione Fmoc monitorato da UV / Vis 1,11, e la cattura e l&#39;analisi in arrivo composti attivati. Un altro problema trascurato in sintesi in fase solida è la natura ripetitiva di passaggi sintetici richieste dall&#39;operatore. Cosciente di questo, gli autori consiglia vivamente l&#39;uso di un foglio di calcolo o lista di controllo durante l&#39;esecuzione di qualsiasi manuale in fase solida sintesi peptidica. La difficoltà nell&#39;utilizzare bis-peptidi per sintesi in fase solida rispetto alle comuni α-amminoacidi include il potenziale per accoppiamenti più difficile a causa sterico hinDrance, la necessità di on-resina chiusure dichetopiperazina e deprotections simultanee (Boc / tBu; Cbz / tBu). Un altro difficilmente è quello di conseguire rilascio quantitativa dalla resina utilizzando questa &quot;sicura&quot; metodo rispetto a mezzi più convenzionali. Con questi fattori in mente, è molto probabile che un&#39;ulteriore ottimizzazione di questo metodo può essere realizzato e le iniziative attuali sono in corso nel nostro gruppo per migliorare il metodo presentato qui.

<table border="1"><tr><td> Nome </td><td> Azienda </td><td> Numero di catalogo </td><td> Comments </td></tr><tr><td> HMBA-Am Resina </td><td> Novabiochem </td><td> 855018 </td><td></td></tr><tr><td> MSNT </td><td> Novabiochem </td><td> 851011 </td><td></td></tr><tr><td> NMI </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 336092 </td><td> Tossico, Corrosivo </td></tr><tr><td> DCM </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> <a href="http://www.sigmaaldrich.com/catalog/ProductDetail.do?lang=en&amp;N4=D65100%7CSIAL&amp;N5=SEARCH_CONCAT_PNO%7CBRAND_KEY&amp;F=SPEC" target="_blank">D65100</a> </td><td> Cancerogeno </td></tr><tr><td> DCM anidro </td><td> Acros </td><td> 34846 </td><td> Cancerogeno </td></tr><tr><td> Acido bromidrico 33% in acido acetico </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 248630 </td><td> Tossico, Corrosive, fumi quando è aperto </td></tr><tr><td> DIPEA </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 387649 </td><td> Infiammabile, tossico, corrosivo </td></tr><tr><td> DMF </td><td> Fisher Scientific </td><td> AC27960 </td><td> Infiammabili, tossici </td></tr><tr><td> DMF anidra </td><td> Acros </td><td> 34843 </td><td> Infiammabili, tossici </td></tr><tr><td> HOAT </td><td> GenScript </td><td> C01568 </td><td></td></tr><tr><td> DIC </td><td> Acros </td><td> BP590 </td><td> Infiammabile, tossico, corrosivo </td></tr><tr><td> TFA </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> T6508 </td><td> Tossico, Corrosivo </td></tr><tr><td> CONSIGLI </td><td> Acros </td><td> 21492 </td><td> Infiammabili, tossici </td></tr><tr><td> Piperidina </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 104094 </td><td> Infiammabile, tossico, corrosivo </td></tr><tr><td> HATU </td><td> GenScript </td><td> C01566 </td><td&gt; Toxic </td></tr><tr><td> NMP </td><td> Acros </td><td> 36438 </td><td> Tossico </td></tr><tr><td> DMAP </td><td> Novabiochem </td><td> 851055 </td><td> Tossico </td></tr><tr><td> Methyl Red </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 250198 </td><td></td></tr><tr><td> THF </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 401757 </td><td> Infiammabile, tossico, perossido di Formazione </td></tr><tr><td> Pirrolidina </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> P73803 </td><td> Infiammabile, tossico, corrosivo </td></tr><tr><td> Dimetilsolfossido </td><td> Pescatore </td><td> D1281 </td><td></td></tr><tr><td> SPPS recipienti per reazioni </td><td> Grazia </td><td> 211108 </td><td></td></tr><tr><td> LCMS </td><td> Agilent </td><td> Serie 1200 </td><td></td></tr><tr><td> Semi-Prep LC </td><td> Hewlett Packard </td><td> Serie 1100 </td><td></td></tr><tr&gt; <td> Liofilizzatore </td><td> Labconco </td><td> 7934027 </td><td></td></tr><tr><td> Rotovapor </td><td> Buchi </td><td> R-210 Series </td><td></td></tr><tr><td> Argo </td><td> Airgas </td><td> AR PP300CT </td><td></td></tr></table>

sintesi in fase solida di un funzionalizzato bis-peptide uso di &quot;sicura del fucile&quot; metodologia

Solid Phase Synthesis of a Functionalized Bis-Peptide Using "Safety Catch" Methodology

Nel 1962, RB Merrifield pubblicato la prima procedura utilizzando sintesi in fase solida del peptide come un nuovo percorso per sintetizzare in modo efficiente peptidi. Questa tecnica subito dimostrato la sua soluzione più vantaggiosa in fase predecessore in termini di tempo e lavoro. Miglioramenti relativi alla natura del supporto solido, i gruppi di protezione impiegati e dei metodi di attacco utilizzati nel corso degli ultimi cinque decenni hanno solo aumentato l&#39;utilità del sistema originale di Merrifield. Oggi, l&#39;uso di un Boc e protezione basato su base / nucleofilo strategia di resina scindibile o Fmoc e protezione basato su resina acida strategia scindibile, introdotta da RC Sheppard, sono più comunemente utilizzati per la sintesi di peptidi 1. Ispirato strategia solido supportato Merrifield, abbiamo sviluppato un Boc / terz-butil fase solida strategia di sintesi per l&#39;assemblaggio di funzionalizzati bis-peptidi 2, che è qui descritti. L&#39;uso di sintesi in fase solida rispetto to soluzione fase metodologia non è solo vantaggiosa in termini di tempo e di lavoro come descritto da Merrifield 1, ma consente anche una maggiore facilità nella sintesi del bis-peptide librerie. La sintesi qui dimostrano che incorpora una fase finale di scissione che utilizza due step &quot;sicura&quot; meccanismo per liberare il funzionalizzato bis-peptide dalla resina mediante formazione dichetopiperazina. Bis-peptidi sono rigidi, spiro-scala oligomeri di bis-amminoacidi in grado di posizionare la funzionalità in modo prevedibile e progettabili, controllato dal tipo e la stereochimica delle unità monomeriche e la connettività tra ogni monomero. Ogni bis-amminoacido è un stereochimicamente puro, ciclico scaffold che contiene due aminoacidi (un acido carbossilico con una α-ammina) 3,4. Il nostro laboratorio sta attualmente indagando le potenzialità funzionali del bis-peptidi attraverso una vasta gamma di settori tra cui catalisi, interazioni proteina-proteina e nanomaterials.

L&#39;efficiente sintesi in fase solida di un peptide funzionalizzato bis-peptide trimero di utilizzare un &quot;sicura&quot; procedura clivaggio dalla resina HMBA descritto.

Sintesi in fase solida di un funzionalizzato Bis-Peptide Uso di &quot;Sicura del fucile&quot; Metodologia

Nel 1962, R.B. Merrifield pubblicò la prima procedura che utilizzava la sintesi peptidica su fase solida come nuova via per sintetizzare efficientemente i peptidi. Questo...

L'obiettivo generale del seguente esperimento è sintetizzare un peptide BSP funzionalizzato utilizzando tecniche a fase solida. Questo viene ottenuto caricando un aminoacido BIS protetto sulla resina di acido idrossietil benzoico. Successivamente, si ripetono cicli di accoppiamento con protezione profonda per attaccare aminoacidi bis funzionalizzati, un processo che allunga il peptide BIS e mostra la funzionalità desiderata.Infine, il primo acido bis aminoacidico viene modificato con un acido aminoacidico alfa al fine di scindere il peptide BIS dalla resina mediante formazione di di-chetopirazina. I risultati ottenuti mostrano la sintesi riuscita di un peptide BSP funzionalizzato con buona purezza grezza e rese isolate costanti di circa il 10%, in base all'analisi mediante spettrometria di massa con cromatografia liquida. Le implicazioni di questa tecnica si estendono alla sintesi parallela e di librerie di peptide bis, poiché i peptide BIS vengono assemblati su una resina solida, che è più facilmente manipolabile rispetto alle reazioni in soluzione e i sottoprodotti possono essere facilmente rimossi per filtrazione.La dimostrazione visiva di questo metodo è fondamentale poiché molti dei passaggi sono difficili da apprendere, in quanto richiedono numerosi dettagli importanti necessari per garantire che tutte le reazioni giungano il più possibile a completamento. Nella sintesi in fase solida, non esiste alcun modo per purificare gli intermedi. Pertanto, per ottenere un prodotto finale puro, ogni reazione deve essere spinta fino al massimo possibile.Si consiglia di creare un elenco di controllo delle procedure sperimentali per evitare confusione, poiché i passaggi sono di natura ripetitiva. Questo protocollo inizia con il caricamento del primo peptide BSP, la protezione del primo peptide BSP e il cappuccio simultaneo della resina. Per iniziare, caricare il primo peptide BSP pesando 114 milligrammi di resina H-M-B-A-A in un recipiente di reazione da otto millilitri e aggiungendo una barretta magnetica per agitazione.Chiudere la parte superiore del recipiente con il settimo di gomma ed effluire il tubo con Argon per almeno cinque minuti. Nel frattempo, preparare la soluzione di aminoacido BIS attivato come descritto nel protocollo scritto. In abbinamento a questo video, trasferire la soluzione nel recipiente di reazione mediante siringa e agitare sotto Argon durante la notte. Il giorno seguente, rimuovere il settimo e scaricare la miscela di reazione.Si lava la resina aggiungendo circa due millilitri di clorometano alla resina. Si agita per 30 secondi fino a un minuto, quindi si sgrava. Si ripete questo procedimento quattro volte con DCM e successivamente si lava la resina cinque volte con dimetilformammide.Per eseguire la protezione profonda del primo bis-amminoacido e contemporaneamente la cappatura della resina, aggiungere lentamente due millilitri di una soluzione di bromuro di idrogeno al 33% in acido acetico e DCM al recipiente di reazione. Lasciare agitare per 15 minuti dopo aver scaricato e lavato la resina cinque volte con DCM. Ripetere la sequenza di protezione D un’ulteriore volta.Successivamente, lavare la resina cinque volte con DCM seguito da cinque lavaggi con DMF, neutralizzare la resina lavandola due volte con la soluzione al 5% volume/volume di D-I-P-E-A in DMF. Quindi lavare cinque volte con DCM e altre cinque volte con DMF. A questo punto si può procedere al coupling dell'aminoacido bis funzionalizzato protetto.Per prima cosa, reintrodurre un'atmosfera inerte nel recipiente di reazione contenente la resina, lavandolo tre volte con DCM anidro. Quindi, fissare un settino e sottoporre il recipiente a un purgaggio con linea di argon e lavaggio aggiungendo da uno a due millilitri di DCM anidro e agitando per 30 secondi. Successivamente, svuotare il recipiente fino a quando il borbottio della linea di argon non inizia a salire.Ripetere questo processo almeno un’altra volta. Successivamente, preparare una soluzione di acido bis amino funzionalizzato in un tubo a saggio asciutto alla fiamma sotto atmosfera di Argon. Aggiungere 47 microlitri di DIC e agitare per 90 minuti.Quindi aggiungere 35 microlitri di D-I-P-E-A in 666 microlitri e DMF anidro alla resina e agitare per ulteriori cinque minuti. Trasferire la soluzione del BIS aminoacido preattivato nel recipiente mediante siringa e agitare tutta la notte e il giorno seguente. Svuotare la miscela di reazione e lavare due volte con DCM anidro sotto argon.Un passaggio fondamentale di questo procedimento è il legame degli amminoacidi biz. Per garantire la chiusura degli anelli di di-cheto piperazina, si impiegano tempi di reazione più lunghi con agenti attivanti aggiuntivi. Per favorire la chiusura della di-cheto pirazina, aggiungere una soluzione di HOAT e DIC e agitare sotto argon per un'ora.Successivamente, rimuovere il setto e scaricare la miscela di reazione. Lavare la resina cinque volte con DCM e cinque volte con DMF. Questa sezione descrive la protezione totale dell'aminoacido BIS funzionalizzato, la protezione totale di F moc e l'acilazione del primo aminoacido BIS.Per eseguire la deprotezione profonda dell'amminoacido bifunzionalizzato protetto, aggiungere lentamente due millilitri di una soluzione di TFA e TIPS al recipiente di reazione e agitare per un'ora dopo lo scarico; lavare la resina con DCM per circa 30 secondi, quindi scaricare e ripetere il lavaggio con DCM per cinque volte. Ripetere quindi l'intera sequenza di lavaggio della resina per deprotezione profonda seguendo il ciclo di lavaggio A-D-C-M-D-M-F. Neutralizzare la resina lavandola due volte con una soluzione al 5% volume/volume di D-I-P-E-A in DMF.Eseguire quindi un altro lavaggio D-C-M-D-M-F. A partire da questo punto, il peptide BIS può essere allungato con altri aminoacidi bis funzionalizzati o funzionalizzato sull'acido carbossilico del gruppo azotato terminale, oppure entrambe le operazioni. Per rimuovere il gruppo protettivo FM, aggiungere una soluzione di due millilitri di piperidina al 20% in DMF e mescolare la reazione per 20 minuti.Svuotare e lavare la resina cinque volte con DMF. Ripetere questo processo una volta in più dopo un'ulteriore lavaggio della resina. Isolare il primo bis-amminoacido aggiungendo la soluzione di amminoacido preparata al recipiente di reazione e agitare per sei ore come passaggio finale.Lavare la resina cinque volte con DCM e cinque volte con DMF. L'ultima parte di questo protocollo prevede la rimozione del gruppo Bach dall'amminoacido legato alla resina e il distacco dalla resina stessa. Aggiungere innanzitutto due millilitri di una soluzione T-F-A-D-C-M uno a uno al recipiente di reazione e agitare per 30 minuti.Svuotare e lavare la resina cinque volte con DCM. Quindi ripetere questo processo una volta ancora. Lavare e svuotare la resina per 30 secondi, cinque volte con DCM e cinque volte con DMF.Successivamente, aggiungere due millilitri di una soluzione di 10%D-I-P-E-A in DMF anidro e agitare da 24 a 48 ore. Infine, raccogliere la miscela di reazione in un pallone a fondo rotondo pre-pesato. Trasferire 30 microlitri di questa soluzione in 450 microlitri di Tetra Hydro FU in un file lc MS e inviarla per analisi.Lavare la resina con ulteriori aliquote di DMF e raccogliere nel pallone a fondo tondo. I seguenti metodi possono essere utilizzati per monitorare le trasformazioni chimiche sulla resina durante la sintesi. Per rilevare i gruppi ossidrilici liberi, eseguire il test con il rosso di metile rimuovendo innanzitutto circa un milligrammo di resina secca mediante pipetta monouso.Sciacquare in un recipiente di reazione da quattro millilitri. Aggiungere una soluzione di rosso metile preparata come descritto nel testo e agitare per cinque-dieci minuti. Svuotare e lavare la resina cinque volte con DCM; la presenza di perle di resina arancioni o rosse indica la presenza di gruppi ossidrilici liberi.Questo test può essere utilizzato per valutare il caricamento del primo aminoacido bis e i passaggi di cappucciatura della resina. Per rilevare le ammine secondarie, eseguire il test del cloralio trasferendo circa un milligrammo di resina secca in una piccola provetta mediante pipetta monouso. Aggiungere tre gocce sia della soluzione di cloralio 0,8 millimolare in DMF sia della soluzione di aldeide acida al 2% in DMF.E lasciamo in posa a temperatura ambiente per cinque-dieci minuti. In questo caso, la presenza di sfere di resina di colore blu o viola indica che sono presenti ammine secondarie libere sul composto legato alla resina. Per confermare l'efficienza di attivazione, eseguire il test di intrappolamento dell'attivazione: il composto attivato durante la sintesi può essere valutato trasferendo da cinque a dieci microlitri della soluzione attivata in un vial per cromatografia liquida-spettrometria di massa contenente 50 microlitri di olaine, miscelato manualmente.Per alcuni secondi, la soluzione dovrebbe diventare gialla, quindi diluire con 450 microlitri di tetrahydrofuran e sottoporre ad analisi LC-MS. Il prodotto finale e gli intermedi attivati possono essere valutati utilizzando un sistema LCM S dotato di una colonna in fase inversa C 18 e un sistema di solventi costituito da acqua e acetonitrile con acido formico al 0,1%. Questo tracciato L-C-M-S-U-V fornisce un esempio della buona purezza del prodotto grezzo.Il picco principale nello spettro riscontrato a 21,3 minuti presenta una massa compatibile con la massa prevista del prodotto. Questo può essere visualizzato nello spettro di massa del prodotto grezzo, in cui il picco rivela i principali picchi corrispondenti alla massa, alla massa più quella dello ione sodio, nonché alla massa meno quella del gruppo protettivo IV DDE. Qui viene mostrato il tracciato UV-LCMS degli spettri purificati che rivela un prodotto molto puro a 21,3 minuti e lo spettro di massa che conferma l'identità di questo picco trier purificato.Dopo aver visto questo video, si dovrebbe avere una buona comprensione di come utilizzare le tecniche di sintesi solid fase per ottenere peptidi bis funzionalizzati dopo il loro sviluppo. Questa tecnica ha aperto la strada ai ricercatori nel campo dei peptidi biz per esplorare applicazioni nelle interazioni proteina-proteina e nella catalisi. Una volta padroneggiata, tale tecnica può portare alla sintesi di un trimero di peptidi biz funzionalizzato in quattro o cinque giorni, se eseguita correttamente.Quando si esegue questa procedura, è importante ricordare di mantenere le perle immerse nella reazione e nelle soluzioni di lavaggio seguendo questo protocollo. Altri metodi, come la sintesi in parallelo o quella di librerie, possono essere eseguiti per rispondere ad altre domande, ad esempio sull'effetto della stereochimica o di funzionalità alternative sul legame proteico o sull'attività catalitica. Non dimenticare che lavorare con reagenti organici può essere estremamente pericoloso e che precauzioni, come l'uso di idonei dispositivi di protezione personale e di una cappa aspirante, devono essere sempre adottate durante l'esecuzione di questa procedura.

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