Sintesi in fase solida di un funzionalizzato Bis-Peptide Uso di "Sicura del fucile" Metodologia

L'obiettivo generale del seguente esperimento è quello di sintetizzare un peptide BSP funzionalizzato utilizzando tecniche in fase solida. Ciò si ottiene caricando un amminoacido BIS protetto su una resina di acido idrossietilbenzoico. Quindi vengono ripetuti cicli di accoppiamento di protezione profonda per legare gli amminoacidi bis funzionalizzati, un processo che allunga il peptide BIS e mostra la funzionalità desiderata.

Infine, il primo amminoacido bis viene modificato con un amminoacido alfa al fine di scindere il peptide BIS dalla resina mediante formazione di DI Keto pirazina. Si ottengono risultati che mostrano il successo della sintesi di un peptide BSP funzionalizzato in buona purezza grezza e rese isolate costanti di circa il 10% sulla base dell'analisi di spettrometria di massa cromatografica liquida. Le implicazioni di questa tecnica si estendono alla sintesi parallela e in libreria di peptidi bis perché i peptidi BIS sono assemblati su una resina solida, che è più facilmente manipolabile rispetto alle reazioni in soluzione e i sottoprodotti sono facilmente rimossi mediante filtrazione.

La dimostrazione visiva di questo metodo è fondamentale in quanto molti dei passaggi sono difficili da apprendere perché ci sono molti dettagli importanti necessari per garantire che tutte le reazioni si avvicinino il più possibile al completamento. Con la sintesi in fase solida, non c'è modo di purificare gli intermedi. Quindi, per ottenere un prodotto finale pulito, ogni reazione deve essere guidata il più lontano possibile.

Si consiglia di creare una lista di controllo delle procedure sperimentali per evitare confusione poiché i passaggi sono di natura ripetitiva. Questo protocollo inizia con il caricamento del primo peptide BSP, la protezione del primo peptide BSP e il contemporaneo incappucciamento della resina. Per iniziare, caricare il primo peptide BSP pesando 114 milligrammi di resina H-M-B-A-A in un recipiente di reazione da otto millilitri e aggiungere un'ancoretta magnetica.

Tappare la parte superiore del recipiente con il setto di gomma e spurgare la provetta con Argonne per almeno cinque minuti. Nel frattempo, preparare la soluzione di aminoacidi BIS attivati come descritto nel protocollo scritto. A corredo di questo video, trasferire la soluzione nel recipiente di reazione tramite siringa e mescolare sotto Argonne per una notte il giorno successivo, rimuovere il setto e scolare la miscela di reazione.

Lavare la resina aggiungendo circa due millilitri di clorometano alla resina. Mescolate per 30 secondi a un minuto e poi scolate. Ripetere questo processo quattro volte con DCM e poi lavare la resina cinque volte con dimetilformammide.

Per eseguire una protezione profonda del primo amminoacido bis e la contemporanea tappatura della resina, aggiungere lentamente due millilitri di una soluzione di bromuro di idrogeno al 33% in acido acetico e DCM al recipiente di reazione. Lasciare mescolare per 15 minuti dopo aver scolato e lavato la resina cinque volte in DCM. Ripetere ancora una volta la sequenza di protezione D.

Successivamente, lavare la resina cinque volte in DCM seguito da cinque volte in DMF, neutralizzare la resina lavando due volte con la soluzione al 5% in volume di D-I-P-E-A in DMF. Quindi lavare cinque volte con DCM e cinque volte con DMF ancora una volta. Ora è possibile eseguire l'accoppiamento dell'amminoacido bis funzionalizzato protetto.

Innanzitutto, reintrodurre un'atmosfera inerte nel recipiente di reazione contenente resina lavando tre volte con DCM anidro. Quindi collegare uno spurgo del setto e della linea argonne e lavare il recipiente aggiungendo da uno a due millilitri di DCM anidro e mescolando per 30 secondi. Quindi scolare il recipiente fino a quando il gorgogliatore della linea argonne inizia a salire.

Ripeti questo processo almeno un'altra volta. Successivamente, preparare una soluzione di amminoacido bis funzionalizzato in una provetta essiccata alla fiamma in atmosfera di Argonne. Aggiungere 47 microlitri di DIC e mescolare per 90 minuti.

Quindi aggiungere 35 microlitri di D-I-P-E-A in 666 microlitri e hydrus DMF alla resina e mescolare per altri cinque minuti. Trasferire la soluzione di aminoacidi BIS preattivata nel recipiente tramite siringa e mescolare per una notte il giorno successivo. Scolare la miscela di reazione e lavare due volte con DCM anidro sotto argon.

Un passaggio critico in questa procedura sono gli accoppiamenti di amminoacidi. Per garantire la chiusura dell'anello di cheto piperazine, impieghiamo tempi di reazione più lunghi con agenti attivanti aggiuntivi. Per favorire la chiusura della di keto pirazina, aggiungere una soluzione HOAT e DIC mescolare sotto argon per un'ora.

Quindi, rimuovere il setto e scolare la miscela di reazione. Lavare la resina cinque volte con DCM e cinque volte con DMF. Questa sezione copre la protezione profonda dell'aminoacido BIS funzionalizzato, la protezione profonda di F moc e l'acilazione del primo amminoacido BIS.

Per eseguire una protezione profonda dell'amminoacido bis funzionalizzato protetto, aggiungere lentamente due millilitri di una soluzione di TFA e TIPS al recipiente di reazione e mescolare per un'ora dopo lo svuotamento, lavare la resina con DCM per circa 30 secondi e quindi scolare ripetere il lavaggio DCM cinque volte. Quindi ripetere l'intera sequenza di lavaggio con resina per la protezione profonda dopo il lavaggio A-D-C-M-D-M-F. Neutralizzare la resina lavando due volte con una soluzione al 5% in volume di D-I-P-E-A in DMF.

Quindi eseguire un altro lavaggio D-C-M-D-M-F. Da qui, il peptide BIS può essere allungato con altri amminoacidi bis funzionalizzati o funzionalizzato sull'acido carbossilico azotato principale o entrambi. Per proteggere il gruppo FM, aggiungere una soluzione di due millilitri di paridina per tubi al 20% in DMF e mescolare la reazione per 20 minuti.

Scolare e lavare la resina cinque volte in DMF. Ripetere questo processo ancora una volta dopo un ulteriore lavaggio della resina. A Isolare il primo amminoacido bis aggiungendo la soluzione di amminoacido preparata al recipiente di reazione e mescolare per sei ore come passaggio finale.

Lavare la resina cinque volte con DCM e cinque volte con DMF. La parte finale di questo protocollo include la rimozione del gruppo di Bach dall'amminoacido legato alla resina e la scissione dalla resina. Per prima cosa, aggiungere due millilitri di una soluzione T-F-A-D-C-M uno a uno al recipiente di reazione e mescolare per 30 minuti.

Scolare e lavare la resina cinque volte in DCM. Quindi ripeti questo processo ancora una volta. Lavare e scolare la resina per 30 secondi, cinque volte con DCM e cinque volte con DMF.

Successivamente, aggiungere due millilitri di una soluzione di D-I-P-E-A al 10% in DMF anidro e mescolare per 24-48 ore. Infine, raccogliere la miscela di reazione in un pallone a fondo tondo pre-pesato. Trasferire 30 microlitri di questa soluzione in 450 microlitri di Tetra Hydro FU in un file lc MS e inviarlo per l'analisi.

Lavare la resina con aliquote aggiuntive di DMF e raccoglierla nel pallone a fondo tondo. I seguenti metodi possono essere utilizzati per monitorare le trasformazioni chimiche della resina durante la sintesi. Per rilevare i gruppi ossidrilici liberi, eseguire il test del rosso metile rimuovendo prima circa un milligrammo di resina secca tramite una pipetta monouso.

Sciacquare in un recipiente di reazione da quattro millilitri. Aggiungere una soluzione di rosso metile preparata come descritto nel testo e mescolare per cinque-10 minuti. Scolare e lavare la resina cinque volte con DCM: le perle di resina arancioni o rosse indicano la presenza di gruppi ossidrilici liberi.

Questo test può essere utilizzato per valutare il carico delle prime fasi di tappatura degli amminoacidi e della resina. Per rilevare i mezzi secondari, eseguire il test del cloralio trasferendo circa un milligrammo di resina secca in una piccola fiala tramite pipetta monouso. Aggiungere tre gocce di cloralio 0,8 millimolare in soluzione di DMF e aldeide acida al 2% in soluzione di DMF.

E sediamoci a temperatura ambiente per cinque-10 minuti. In questo caso, le perle di resina blu o viola sono un'indicazione che sul composto legato alla resina sono presenti mezzi secondari liberi. Per confermare l'efficienza di attivazione, eseguire il test della trappola di attivazione, il composto attivato durante la sintesi può essere valutato trasferendo da cinque a 10 microlitri della soluzione attivata in una fiala per spettrometria di massa per cromatografia liquida contenente 50 microlitri di olaina miscelata a mano.

Per alcuni secondi, la soluzione dovrebbe diventare gialla, quindi diluire con 450 microlitri di tetra idrourano e sottoporla all'analisi lc MS. Il prodotto finale e gli intermedi attivati possono essere valutati utilizzando un sistema LCM S dotato di una colonna in fase inversa C 18 e di un sistema solvente di acetil nitrile acquoso con acido formico allo 0,1%. Questa traccia L-C-M-S-U-V fornisce un esempio della buona purezza del prodotto grezzo.

Il picco maggiore nello spettro trovato a 21,3 minuti risulta avere una maschera coerente con la massa di prodotto prevista. Questo può essere visualizzato nello spettro di massa del prodotto grezzo, il picco rivela i picchi maggiori corrispondenti alla massa, più la massa dello ione sodio, così come la massa meno la massa del gruppo di protezione DDE IV. Qui è mostrata la traccia UV LCMS degli spettri purificati che rivela un prodotto molto puro a 21,3 minuti e lo spettro di massa che conferma l'identità di questo picco di Treviri purificato.

Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come utilizzare le tecniche solid face per sintetizzare i peptidi bis funzionalizzati dopo il suo sviluppo. Questa tecnica ha aperto la strada ai ricercatori nel campo dei peptidi biz per esplorare le applicazioni nelle interazioni proteina-proteina e nella catalisi Una volta padroneggiata. Questa tecnica può portare alla sintesi di un trimero peptidico biz funzionalizzato in quattro o cinque giorni se eseguita correttamente.

Quando si tenta questa procedura, è importante ricordarsi di mantenere le perle immerse nelle soluzioni di reazione e di lavaggio Seguendo questa procedura. Altri metodi, come la sintesi parallela o in libreria, possono essere eseguiti per rispondere a domande aggiuntive come l'effetto della stereochimica o delle funzionalità alternative sul legame proteico o sull'attività catalitica. Non dimenticare che lavorare con reagenti organici può essere estremamente pericoloso e che quando si esegue questa procedura è necessario adottare sempre precauzioni come l'uso di adeguati dispositivi di sicurezza personale e una cappa aspirante.