Name: Sintesi e caratterizzazione di 1,2-Dithiolane per volta peptidi autoassemblanti (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-08-20T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 54 s
Description: Scopri la sintesi di peptidi modificati con 1,2-dithiolane per la chimica supramolecolare. Questo metodo efficiente consente accoppiamento e deprotezione su resina con un'unica purificazione finale.

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Gli autori piacerebbe ringraziare il Dr. B. Ellen Scanley per la sua formazione tecnica e aiuto utilizzando il TEM al Connecticut State Colleges e Università (CSCU) centro per le nanotecnologie e Dr. Ishita Mukerji alla Wesleyan University per l'accesso al suo CD spettrofotometro. Il lavoro segnalato è stata in parte sostenuto dall'Istituto scienza alla Fairfield University, la NASA Connecticut Space Grant Consortium e dalla National Science Foundation sotto Grant numero-1624774.

1. sintesi e purificazione di 1,2-Dithiolane modificati Peptide
<ol><li>Sintesi di dithiolane precursore, 3-(acetylthio) -2-(acetylthiomethyl) acido propanoico19.
	<ol>
<li>Aggiungere 1 g di 3-bromo - 2-(bromomethyl) acido propionico (1 equiv.) dissolto in quantità minima di 1 M NaOH (circa 4 mL) in un pallone di reazione di 25 mL fondo tondo con agitazione a 55 ° C. Sigillare il pallone di reazione con un setti e posto sotto atmosfera di azoto.</li>
		<li>Preparare una soluzione contenente 1,49 g di Tio acetato di potassio (3.2 equiv.) in 4 mL di acqua deionizzata e 3 mL di acido solforico 2M (H2SO4) creare thioacetic acid in situ.</li>
		<li>Tirare la soluzione di acido thioacetic in una siringa di plastica monouso da 10 mL e inserire un ago sulla siringa. Aggiungere goccia a goccia la miscela per il pallone di reazione forando attraverso i setti con l'ago. Continuare la reazione durante la notte a 55 ° C.</li>
		<li>Monitorare la reazione di cromatografia su strato sottile (TLC) su gel di silice 60 F254 piastre utilizzando una miscela di metanolo e diclorometano (1:9). Visualizzare lo stato di avanzamento di reazione dalla macchia di verde di bromocresolo. Il prodotto ha un Rf = 0,57.</li>
		<li>Dopo la reazione è completa e raffreddati a temperatura ambiente, acidificare la miscela a pH 1 con 2 M H2così4. Un olio giallo separa dalla soluzione.</li>
		<li>Estrarre il prodotto con cloroformio freddo (40 mL x 3). Unire i livelli organici e asciugare su solfato di magnesio. Rimuovere il cloroformio sotto pressione ridotta.</li>
		<li>Confermare l'identità del prodotto isolato, 1, dalla spettroscopia di risonanza magnetica nucleare (NMR), come mostrato nelle figure 1B e C. Aspettiamo i seguenti risultati: 1H NMR, CDCl3, 300 MHz: d = 10.1 (b, 1 H), 3.2 (m, H 4), 2,9 (m, H 1) 2.4 (s, 6 H); 13 C NMR, CDCl3, 75 MHz: d = 195,1 (OS-3Cdi CH), 177,6 (-COOH), 45,1 (-CH2S-), 30.5 (CH), 29.2 (-SCOCH3). Nota: Il prodotto è un olio giallo e presenta un rendimento complessivo di 83%. Utilizzare il prodotto senza ulteriore purificazione.</li>
	</ol></li>
	<li>SPPS e accoppiamento su resina di Dithiolane precursore Nota: La sintesi peptidica in fase solida descritta di seguito è stato condotto su un sintetizzatore di peptidi automatizzato, seguendo protocolli del produttore consigliato. Impostazioni e i reagenti possono essere adattati per altri strumenti commerciali o quando si utilizza aminoacidi specializzati.<ol>
<li>Pesare 0,156 g di resina di Rink ammide 4-methylbenzhydrylamine (MBHA) (0,1 mmol) e posto in un recipiente di reazione. Gonfiare la resina in dimetilformammide (DMF) per almeno 15 minuti prima dell'inizio della sintesi.</li>
		<li>Pesare fuori 4 equivalenti di ogni fluorenylmethyloxycarbonyl (Fmoc) protetto dell'amminoacido (0,4 mmol) nella sequenza e 0,152 g di N, N, N', N'- tetrametil-O-(1H- benotriazol-1-yl) uranio esafluorofosfato (0,4 mmol, HBTU) per ogni amminoacido nella sequenza. Ogni cartuccia contiene HBTU sia il Fmoc-protetto dell'amminoacido.</li>
		<li>Dopo aver eseguito tutte le pre-sintesi controlla sul sintetizzatore (riempire i reagenti, svuotate le linee dei reagenti e pressurizzato tutti i flaconi di reagente), posizionare le cartucce dell'aminoacido in giostra in C' a N' direzione capolinea. Inserire una cartuccia vuota dopo la posizione finale dell'aminoacido per la fase finale di deprotezione Fmoc N-terminale.</li>
		<li>Sintetizzare il peptide utilizzando le impostazioni consigliate standard.<ol>
<li>DEPROTECT gruppo Fmoc dalla resina con 5 mL di 20% piperidina in DMF (5 min x 2).</li>
			<li>Lavare la resina con DMF (6 x 5 mL) prima della fase di accoppiamento.</li>
			<li>Per un passaggio di singolo accoppiamento, aggiungere 4 mL di 0,4 M N-metilmorpholin-in DMF al Fmoc-protetto dell'aminoacido e HBTU. Attivare la soluzione di Fmoc-protetto dell'amminoacido per 30 s prima di trasferire la soluzione per il recipiente di reazione. Nota: Il sintetizzatore di peptidi automatizzato mescola la resina e la soluzione di bubbling N2 gas ogni 30 s per 20 minuti mentre la reazione di accoppiamento si svolge. Per sintesi peptidica manuale, posizionare il recipiente di reazione su agitatore orbitale a bassa velocità per tutta la durata del passaggio del giunto.</li>
			<li>Scolare la soluzione e lavare la resina con DMF (3 x 5 mL).</li>
			<li>Ripetere i passaggi da 1.2.4.1 attraverso 1.2.4.4 per ogni amminoacido Fmoc-protetto in C' a N'-direzione capolinea di sintetizzare il peptide di interesse.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Dopo il passaggio finale per la deprotezione N-terminale, è possibile trasferire la resina in una siringa monouso sinterizzata. Lavare la resina con DMF (3 x 5 mL) e diclorometano (DCM, 3 x 5 mL). Nota: La resina può essere conservata dopo DCM di lavaggio in un essiccatore sotto vuoto. Se la resina è stata memorizzata precedente accoppiamento, assicurati di gonfiare la resina in DMF prima la reazione di accoppiamento.</li>
		<li>Coppia il precursore dithiolane (1) a N-terminale del peptide su resina aggiungendo 4 equivalenti di 1, 5 mL di DMF, 4 equivalenti di HBTU e 10 equivalenti di N, N-diisopropylethylamine (DIPEA). Pre-attivare la miscela di accoppiamento per 10 min prima di aggiungere la resina contenente la siringa sinterizzato.</li>
		<li>Agitare la reazione di accoppiamento per 2 h. Dopo 2 h, lavare la resina con DMF (3 x 5 mL) e ripetere la reazione di accoppiamento con l'agitazione durante la notte.</li>
		<li>Dopo il secondo accoppiamento, lavare la resina con DMF (3 x 5 mL) e DCM (3 x 5 mL). Nota: La resina può essere conservata a questo punto sotto vuoto fino fenditura.</li>
	</ol></li>
	<li>Tio acetato deprotezione e fenditura del Peptide dalla resina
	<ol>
<li>Per deprotect il gruppo Tio acetato dal precursore dithiolane N-terminale, trasferire la resina essiccata in una provetta di reazione microonde 10 mL e aggiungere 2 mL di DMF. Lasciare che la resina si gonfiano, aggiungere una piccola ancoretta magnetica alla nave e risospendere con una bassa velocità di agitazione magnetica per 15 min.</li>
		<li>Aggiungere 2 mL di concentrato idrossido di ammonio, il recipiente di reazione con i setti del silicone di cap e posizionare il recipiente di reazione in un reattore a microonde utilizzando le impostazioni di forno a microonde di 75 ° C per 45 minuti con agitazione.</li>
		<li>Dopo la reazione di forno a microonde è completa, è possibile trasferire la resina in una siringa monouso pulito sinterizzata. Lavare con DMF (2 x 5 mL) e metanolo (MeOH, 2 x 5 mL).</li>
		<li>Aggiungere una soluzione concentrata di idrossido di ammonio in metanolo (1:4), per un volume totale di 5 mL. Lasciare a scuotere una notte per aumentare l'ossidazione intramolecolare del legame bisolfurico dithiolane ring.</li>
		<li>Lavare la resina con MeOH (2 x 5 mL) e DCM (3 x 5 mL). Nota: La resina essiccata può essere memorizzata in un essiccatore sotto vuoto a questo punto.</li>
		<li>Aggiungere il cocktail di clivaggio della resina contenente la siringa con agitando delicatamente per 1,5 h. Il clivaggio cocktail utilizzato è 95% acido trifluoroacetico (TFA), 2,5% triisopropylsilane (suggerimenti) e 2,5% acqua ad un volume totale di 5 mL. Attenzione: Lavorare sotto cappa chimica. TFA è volatile e corrosivi. Nota: Per la maggior parte delle sequenze peptidiche e dell'aminoacido sidechain protezione dei gruppi, la suddetta soluzione cocktail di clivaggio è sufficiente; Tuttavia, cocktail di clivaggio alternativo può essere necessaria per alcuni catena laterale dell'amminoacido proteggere gruppi (in particolare peptidi contenenti Cys, Met, Trp e Arg) o altra resina chimica20.</li>
		<li>Precipitare il peptide grezzo in 25 mL di etere etilico freddo in una provetta conica da 50 mL di aggiunta goccia a goccia dalla siringa sinterizzata. Il peptide precipita come solido bianco. Pellet il peptide mediante centrifugazione a 1300 x g per 10 min. decantare con attenzione l'etere etilico in un contenitore separato per la raccolta dei rifiuti.</li>
		<li>Aggiungere un altro 25 mL di etere etilico a tubo conico e risospendere il precipitato nel Vortex. Ripetere la centrifugazione a 1300 x g per 10 min e decantare l'etere etilico nuovamente. Asciugare il pellet sotto vuoto.</li>
	</ol></li>
	<li>Purificazione di 1,2-Dithiolane per volta Peptide Nota: Purificare il peptide grezzo da HPLC in fase inversa. Raccogliere e combinare le cime del peptide e confermare la massa mediante spettrometria di massa MALDI-TOF.<ol>
<li>Dissolva la pallina del peptide grezzo in quantità minima di acetonitrile con 0,1% TFA. A causa di idrofobicità di peptide e la propensione di aggregazione, delicatamente riscaldare il campione a 40 ° C per facilitare la solubilità. Nota: Evitare di più alte temperature e sonicazione del peptide per prevenire potenziali bisolfuro cambio reazioni21,22,23.</li>
		<li>Per preparare 1 mL del peptide grezzo per purificazione HPLC, aggiungere 400 μL di brodo concentrato del peptide in acetonitrile a 600 µ l di H2O con 0,1% TFA e filtro attraverso un filtro per siringa 22 μm in un flacone HPLC. Un ulteriore 5% isopropanolo possa essere aggiunti per evitare la precipitazione e l'aggregazione del peptide.</li>
		<li>Purificare il peptide utilizzando C-18 semi-preparatorio colonna con una portata di 3 mL/min su una sfumatura lineare di 15-55% acetonitrile in 20 min. Set i rivelatori UV a 222 nm (spina dorsale ammide) e 330 nm (legame disolfuro). Raccogliere e combinare i picchi di interesse (Figura 2A).</li>
		<li>Confermare la massa di prodotto del peptide di spettrometro di massa MALDI-TOF in modalità reflectron (Figura 2B). Per l'analisi, mescolare 0,5 μL di picco raccolto sulla piastra MALDI con 0,5 μL della matrice di acido (DHB) 2,5-dihydroxybenzoic (10 mg/mL DHB in 50% acetonitrile, 0,1% TFA). Nota: Comune addotti in MALDI-TOF spettrometria di massa includono il sodio e sale di potassio del complesso ([M + Na]+ e [M + K]+) picchi. Il campione prima dell'analisi di desalificazione è consigliata se le cime di sale addotto sopprimono il segnale del picco principale [M + H]+ . Inoltre, un picco ossidato di [M + O]+ è anche rilevato nel peptide 1,2-dithiolane per volta. Un rapporto sull'ossidazione di laser indotta dall'ionizzazione MALDI utilizzando matrice DHB suggerisce che fattori quali la concentrazione del campione, solvente e intensità del laser possono essere modificati per limitare il MALDI indotta da ossidazione artefatto24.</li>
		<li>Dopo la conferma della corretta messa di MALDI-TOF, lyophilize il peptide dopo il congelamento flash. Mantenere la polvere liofilizzata peptide sotto vuoto fino all'assemblaggio.</li>
	</ol></li>
</ol>2. caratterizzazione di supramolecolari auto-assemblaggio di strutture
<ol><li>
Formazione di fibre amiloidi
	<ol>
<li>Per preparare l'auto-assemblaggio soluzione, pesare 1 mg di polvere di peptide utilizzando una bilancia analitica. Sciogliere in una miscela (pH 7,5) di 20% acetonitrile e 10 mM (4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic, acido (HEPES) in una provetta da microcentrifuga da 1,5 mL, ad una concentrazione finale di miscela di assemblaggio del peptide 1 mg/mL. Vortex la soluzione di montaggio e congedo per assemblare a temperatura ambiente.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Caratterizzazione spettroscopica delle fibre amiloidi
	<ol>
<li>Seguire il processo di assemblaggio del peptide tramite spettroscopia di trasformata di Fourier infrarossa (FTIR) ogni pochi giorni. Un vasto picco centrato intorno 1670 cm-1 è la firma di IR derivanti da peptidi smontati in esempio17. Gli esempi di montaggio del peptide di solito prendono una o due settimane per il vasto picco smontato a scomparire e raggiunge la maturazione.<ol>
<li>Secco un'aliquota dell'8-10 μL della soluzione di montaggio come una sottile pellicola sul cristallo diamante ATR. Monitorare la scomparsa di un picco di acqua grande e ampio da 1640 a 1630 cm-1 come le forme di film secco.</li>
			<li>Acquisire spettri IR da 1500-1800 cm-1 in media 50 scansioni con una risoluzione di 2 cm-1 . Acquisire e sottrarre le scansioni in background prima di ogni scansione del campione. La firma di IR per l'assemblaggio di β-foglio è un picco acuto tra il 1625 e 1635 cm-1 (Figura 3A)25,26.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Caratterizzare l'assembly del peptide in β-foglio ricche strutture supramolecolari mediante dicroismo circolare (CD). Registrare gli spettri utilizzando un spectropolarimeter CD con un sistema di controllo temperatura Peltier.<ol>
<li>Aggiungere 30 μL della soluzione di montaggio in un microcuvette di lunghezza di percorso 0,1 mm. Nota: Un supporto delle cellule è necessaria per il bloccaggio e posizionare la cella di lunghezza di percorso breve nello strumento.</li>
			<li>Per ogni spettro, impostare lo strumento CD ai seguenti parametri: scansione lunghezze d'onda di 300 nm a 180 nm, frequenza di scansione di 100/min, larghezza di banda di 1 nm, 25 ° C, media di tre scansioni.</li>
			<li>Raccogliere uno spettro del buffer (20% acetonitrile/10 mM HEPES, pH 7.5) e sottrarre da ogni scansione del campione come un controllo. La firma di CD per β-fogli è che un ellitticità minimo centrato circa 220 nm (Figura 3B)27.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Microscopia di fibre amiloidi
	<ol>
<li>Consentire due o tre settimane per i campioni del peptide di maturare in β-foglio ricche strutture supramolecolari. Nota: Gli assembly possono essere imaged mediante microscopia elettronica a trasmissione (TEM) nelle fasi precedenti del processo di assemblaggio.<ol>
<li>Pipettare 10 μL della soluzione di montaggio peptide sulla superficie della griglia del carbone TEM. Nota: fare attenzione per non toccare la punta della pipetta di superficie della griglia. Alta precisione, a chiusura automatica pinzette vengono utilizzate per contenere la griglia TEM durante la preparazione.</li>
			<li>Attendere 1-2 min per consentire gli assembly di adsorbire sulla superficie della griglia. Rimuovere l'eccesso esempio toccando la carta da filtro al bordo della griglia.</li>
			<li>Preparare una colorazione di acetato di uranile 2% aggiungendo 100 μL di acqua deionizzata per soluzione di acetato di uranile 4% commercialmente disponibili. Aggiungere 10 μL della macchia di acetato di uranile 2% sulla superficie della griglia e incubare per 2-3 min. Dopo l'incubazione, rimuovere l'eccesso macchia toccando la carta da filtro al bordo della griglia.</li>
			<li>Posizionare le griglie TEM in un essiccatore sotto vuoto durante la notte. Conservare sotto vuoto fino a formazione immagine.</li>
			<li>Immagine i campioni preparati con TEM (Figura 3). Parametri tipici per microscopia sono come segue: immagini a ingrandimenti che vanno da 9.300 X-23, 000 X, filamento di tungsteno con una tensione di accelerazione di 120 kV. Nota: ImageJ può essere utilizzato per misurare la larghezza media della fibra delle strutture supramolecolari di acquisite TEM immagini28. Attenzione: Si prega di consultare tutte le schede di dati di sicurezza (SDS) prima dell'uso. Parecchi prodotti chimici utilizzati nella sintesi, purificazione e caratterizzazione di peptidi autoassemblanti descritto 1,2-dithiolane per volta sono corrosivi o tossici e deve essere utilizzato solo sotto una cappa chimica. Sempre utilizzare appropriati dispositivi di protezione individuale (tra cui occhiali protettivi, camice da laboratorio, lunghezza pantaloni, Scarpe chiuse) quando si lavora in laboratorio.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
</ol>

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</ol>

Gli autori non hanno nulla a rivelare.

Questo articolo discute i dettagli sia la sintesi e la purificazione di un peptide di autoassemblanti 1,2-dithiolane per volta N-terminale e la caratterizzazione delle strutture supramolecolari risultante. La sintesi del peptide 1,2-dithiolane segnalato qui presenta i vantaggi, tra cui una sintesi di uno stadio per produrre il precursore dithiolane, 3-(acetylthio) -2-acido propanoico (acetylthiomethyl) e la resina il forno a microonde deprotezione reazione dei Tio acetato precursore protezione gruppo per produrre la fraz...

Il legame peptidico robusto formando chimica coinvolta nella sintesi del peptide di fase solida e la capacità di controllare la composizione e la lunghezza della sequenza rendono i peptidi che auto-assemblarsi in strutture supramolecolari un campo fortemente ricercato. I fattori che controllano e stabilizzano strutture auto-assemblate del peptide, tra cui la catena laterale sterico e interazioni elettrostatiche, legame idrogeno e idrofobo effetti1, servono come un insieme di regole di progettazione. Come la ricerca in queste regole fondamentali di progettazione continua a progredire, il logico passo successivo nel peptide coinvolge auto-assemblaggio sta espandendo la diversità delle funzioni e strutture basate su peptidi. Durante l'auto-assemblaggio di peptidi sono un biomateriale versatile che sono stati utilizzati per molte applicazioni biomediche sintonizzando il peptide sequenza o assieme condizioni2,3,4, lo sviluppo di strategie per modifiche post-montaggio al peptide nanofibre5,6,7,8,9 rimane un'area relativamente inesplorata.
Chimica di cambio e del tiolo bisolfuro dinamico alla superficie delle strutture supramolecolari è un'area che ha il potenziale per produrre biomateriali nuovi e funzionale. L'incorporazione di 1,2-dithiolane moiety (comunemente un derivato di acido lipoico (la) o acido asparagusic (aa)) sono stati segnalati in liposomi sistemi10,11, blocco copolimeri12,13e come organizzazione di ancoraggi alle superfici14,15. Qui, segnaliamo la sintesi e la caratterizzazione di un peptide autoassemblanti derivato dal nucleo nucleanti del peptide Aβ associato con la malattia di Alzheimer che è stata modificata al N-terminale con un gruppo funzionale di 1,2-dithiolane16, 17. Le fibre risultanti supramolecolari ora servono come piattaforma sperimentale per lo studio della reattività di bisolfuro-cambio e tiolo alla superficie supramolecolare di fibre amiloidi18.

<table><tbody><tr><td>Resina MBHA di ammide della pista, alto carico</td><td>Gyros Protein Technologies</td><td>RAM-5-HL Evitare il</td><td>contatto con la pelle e gli occhi; non inalare</td></tr><tr><td>N,N-Dimetilformammide</td><td>Fisher Scientific</td><td>D119-4</td><td>Liquido e vapore infiammabili; irritante per gli occhi e la pelle; Utilizzare dispositivi di protezione individuale; tenere lontano da fiamme libere</td></tr><tr><td>Fmoc-L-Val-OH</td><td>Gyros Protein Technologies</td><td>FLA-25-V</td><td>Indossare dispositivi di protezione individuale; non inalare</td></tr><tr><td>Fmoc-L-Leu-OH</td><td>Gyros Protein Technologies</td><td>FLA-25-L</td><td>Indossare dispositivi di protezione individuale; non inalare</td></tr><tr><td>Fmoc-L-Lys(Boc)-OH</td><td>Gyros Protein Technologies</td><td>FLA-25-KBC</td><td>Indossare dispositivi di protezione individuale; non inalare</td></tr><tr><td>Fmoc-L-Phe-OH</td><td>Gyros Protein Technologies</td><td>FLA-25-F</td><td>Indossare dispositivi di protezione individuale; non inalare</td></tr><tr><td>Fmoc-L-Ala-OH</td><td>Gyros Protein Technologies</td><td>FLA-25-A</td><td>Indossare dispositivi di protezione individuale; non inalare</td></tr><tr><td>Fmoc-L-Gln(Trt)-OH</td><td>Gyros Protein Technologies</td><td>FLA-25-QT</td><td>Indossare dispositivi di protezione individuale; non inalare</td></tr><tr><td>N,N,N&prime;,N&prime;-Tetramethyl-O-(1H-benzotriazol-1-yl)uronium hexafluorophosphate</td><td>Gyros Protein Technologies</td><td>26432</td><td>Provoca irritazione della pelle, degli occhi e delle vie respiratorie; non inalare; utilizzare sotto il cofano o in un'area ben ventilata</td></tr><tr><td>0,4 M N-metilmorfolina in DMF</td><td>Gyros Protein Technologies</td><td>PS3-MM-L</td><td>altamente infiammabile; indossare dispositivi di protezione individuale; tenere lontano da fonti di calore e tenere il contenitore ben chiuso; non inalare o ingerire; lavare accuratamente la pelle dopo aver maneggiato</td></tr> il <tr><td>20% di piperidina in DMF</td><td>Gyros Protein Technologies</td><td>PS3-PPR-L</td><td>Provoca gravi ustioni agli occhi e alla pelle; Liquido e vapore infiammabili; Non inalare</td></tr><tr><td>diclorometano</td><td>Fisher Scientific</td><td>D37-4</td><td>Può causare cancro; Non inalare; Indossare dispositivi di protezione individuale; utilizzare solo sotto il cofano; in caso di contatto salire con acqua per almeno 15 minuti e consultare un medico</td></tr><tr><td>acetonitrile</td><td>Fisher Scientific</td><td>A998-4</td><td>Infiammabile; irritante per gli occhi; Utilizzare dispositivi di protezione individuale; Utilizzare solo sotto una cappa aspirante; tenere lontano da fiamme libere o superfici calde; in caso di contatto sciacquare con acqua per almeno 15 minuti e consultare un medico</td></tr><tr><td>acido trifluoroacetico</td><td>Fisher Scientific</td><td>A116-50</td><td>Provoca gravi ustioni; non inalare; dannoso per gli organismi acquatici; utilizzare dispositivi di protezione individuale; utilizzare solo sotto cappa aspirante; in caso di contatto sciacquare con acqua per almeno 15 minuti e rivolgersi immediatamente a un medico</td></tr> 4<tr><td>% acetato di uranile</td><td>Microscopia elettronica</td><td>Scienze 22400-4</td><td>Non inalare; nocivo per la vita acquatica</td></tr><tr><td>acido 4-(2-idrossietil)piperazina-1-etansolfonico</td><td>Acros Organics</td><td>AC172571000</td><td>Non inalare; utilizzare all'aperto o in un'area ben ventilata</td></tr><tr><td>azoto Gas</td><td>TechAir</td><td></td><td>Contenuto sotto pressione, può esplodere se riscaldato</td></tr><tr><td>acido 3-bromo-2-(bromometil)propionico</td><td>Alfa Aesar</td><td>AAA1963014</td><td>Non inalare; provoca irritazione alla pelle e agli occhi; corrosivo</td></tr><tr><td>idrossido di sodio</td><td>Fisher Scientific</td><td>S318-100</td><td>Utilizzare dispositivi di protezione individuale; utilizzare solo sotto la cappa aspirante; in caso di contatto sciacquare l'area per almeno 15 minuti e consultare un medico</td></tr><tr><td>tioacetato di potassio</td><td>Acros Organics</td><td>AC221300250</td><td>Provoca irritazione alla pelle e agli occhi; non inalare; utilizzare dispositivi di protezione individuale</td></tr><tr><td>acido solforico</td><td>Fisher Scientific</td><td>SA213</td><td>Provoca ustioni; tenere lontano dall'acqua; tenere lontano da materiale combustibile; non inalare; utilizzare dispositivi di protezione individuale; in caso di contatto, sciacquare l'area per almeno 15 minuti e consultare un medico</td></tr><tr><td>cloroformio-d</td><td>Acros Organics</td><td>AC320690075</td><td>Possibile pericolo di cancro; irritante per la pelle e gli occhi; non inalare; Utilizzare dispositivi di protezione individuale; utilizzare solo sotto la cappa aspirante; In caso di contatto, sciacquare l'area per almeno 15 minuti e consultare un medico</td></tr><tr><td>cloroformio</td><td>Fisher Scientific</td><td>C298-4</td><td>Possibile pericolo di cancro; irritante per la pelle e gli occhi; non inalare; Utilizzare dispositivi di protezione individuale; utilizzare solo sotto la cappa aspirante; In caso di contatto, sciacquare l'area per almeno 15 minuti e consultare un medico</td></tr><tr><td>N,N-diisopropiletilamina</td><td>Acros Organics AC367841000</td><td></td><td>Altamente infiammabile; dannoso per gli organismi acquatici; indossare dispositivi di protezione individuale; non ingerire</td></tr><tr><td>idrossido di ammonio</td><td>Fisher Scientific</td><td>A669S-500</td><td>Corrosivo; non inalare</td></tr><tr><td>metanolo</td><td>Fisher Scientific</td><td>A452-4</td><td>Liquidi e vapori infiammabili; utilizzare dispositivi di protezione individuale; non inalare; In caso di contatto, risciacquare l'area per almeno 15 minuti e consultare un medico</td></tr><tr><td>triisopropilsilano</td><td>Sigma Aldrich</td><td>233781</td><td>infiammabile; utilizzare dispositivi di sicurezza protettivi personali; tenere il contenitore ben chiuso</td></tr> etere <tr><td>etilico</td><td>Fisher Scientific</td><td>E138-1</td><td>Estremamente infiammabile; Irritante per la pelle e gli occhi; Utilizzare dispositivi di protezione individuale</td></tr><tr><td>acido 2,5-diidrossibenzoico</td><td>Sigma Aldrich</td><td>39319-10x10MG-F</td><td>non inalare; irritante per la pelle e gli occhi</td></tr><tr><td>acido alfa-ciano-4-idrossicinnamico</td><td>Alfa Aesar</td><td>AAJ67635EXK</td><td></td></tr><tr><td>c18 zip-tip</td><td>Millipore</td><td>ZTC18S096</td><td></td></tr><tr><td>tris(2-carbossietil) fosspina cloridrato</td><td>Thermo Scientific</td><td>PI20490</td><td></td></tr><tr><td>gel di silice 60 F254 fogli TLC rivestiti con supporto in alluminio</td><td>EMD Millipore</td><td>1.05549.0001</td><td></td></tr><tr><td>Tubi NMR di precisione a parete sottile</td><td>Bel-Art</td><td>663000585</td><td>5mm O.D.</td></tr><tr><td>Siringhe Norm-Ject interamente in plastica Air</td><td>Tite</td><td>AL10</td><td></td></tr><tr><td>ago monouso</td><td>BD PrecisionGlide</td><td>BD 305185</td> gli <td>aghi usati vengono smaltiti in contenitori per rifiuti taglienti</td></tr><tr><td>siringhe fritte usa e getta</td><td>Torviq</td><td>SF1000LL</td><td>10 ml sono state utilizzate siringhe fritte, ma sono disponibili siringhe più grandi se necessario per la sintesi su larga scala.</td></tr><tr><td>griglia di carbonio</td><td>Ted Pella, Inc.</td><td>CF200-CU</td><td>Assicurarsi di preparare i campioni e la colorazione sul lato della griglia di carbonio, non sul lato di rame lucido delle</td></tr><tr><td>pinzette a chiusura automatica</td> della griglia <td>Microscopia elettronica Scienze</td><td>78318-3X</td><td>punte molto affilate, lunghezza: 120 mm</td></tr><tr><td>0,1 mm lunghezza percorso corto cella</td><td>Starna Cells, Inc.</td><td>20/C-Q-0.1</td><td>Tappi per</td></tr><tr><td>recipienti fragili da 10 ml</td><td>CEM</td><td>909210</td><td></td></tr><tr><td>Recipienti a pressione da 10 ml</td><td>CEM</td><td>908035</td><td></td></tr><tr><td>Colonna HPLC semi-prep Aeris</td><td>Phenomenex</td><td>00F-4632-N0</td> Supporto per celle <td>da 150 x 10 mm</td></tr><tr><td></td><td>Starna Cells, Inc.</td><td>CH-2049</td><td>Necessario quando si utilizzano celle a percorso corto</td></tr><tr><td>Sintetizzatore di peptidi PS3</td><td>Gyros Protein Technologies</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Reattore a microonde DiscoverSP Centrifuga</td><td>CEM</td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>HERMLE</td><td>Z 206 A</td><td>utilizzato un rotore fisso 6x50 mL</td></tr><tr><td>HPLC</td><td>Shimadzu</td><td></td><td>UV</td></tr><tr><td>Detector spettrometro a risonanza magnetica nucleare</td><td>Avance, Bruker</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Spettrometro di massa MALDI-TOF</td> da 300 MHz <td>Axima Confidence,</td> liofilizzatore Shimadzu <td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>Tecnologia Millrock</td><td>BT85A</td><td></td></tr><tr><td>Spettrometro a infrarossi a trasformata di Fourier</td><td>Alpha Tensore,</td> Microscopio elettronico a trasmissione Bruker <td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>Tecnai Spirit, FEI</td><td></td><td>Utilizzato con la fotocamera digitale CCD a fibre ottiche Gatan Orius. Accessibile presso lo</td></tr><tr><td>spettropolarimetro per dicroismo circolare</td><td>J-810</td> del CSCU Center for Nanotechnology, JASCO <td></td><td>Utilizzato con un regolatore di temperatura Peltier a sei celle. Accesso alla Wesleyan University.</td></tr></tbody></table>

sintesi e caratterizzazione di 1,2-dithiolane per volta peptidi autoassemblanti

Synthesis and Characterization of 1,2-Dithiolane Modified Self-Assembling Peptides

Questo rapporto si concentra sulla sintesi di un N-terminale 1,2-dithiolane modificate autoassemblanti peptide e la caratterizzazione del risultante self-assembled strutture supramolecolari. Il percorso sintetico si avvale della sintesi del peptide di fase solida con l'accoppiamento su resina della molecola del precursore dithiolane, 3-(acetylthio) -2-acido propanoico (acetylthiomethyl) e il Tio acetato assistita da microonde deprotection del peptide N-terminale prima scissione finale dalla resina di cedere l'1,2-dithiolane per volta peptide. Dopo la purificazione di cromatografia liquida ad alte prestazioni (HPLC) del peptide 1,2-dithiolane, derivato dal nucleo nucleanti del peptide Aβ associato a malattia di Alzheimer, il peptide è indicato per assemblarsi in fibre amiloidi Croce-β. Protocolli per caratterizzare le fibre amiloidi-trasformata di Fourier spettroscopia infrarossa (FT-IR), spettroscopia di dicroismo circolare (CD) e microscopia elettronica a trasmissione (TEM) sono presentati. I metodi di modificazione del N-terminale con una molecola di 1,2-dithiolane a peptidi autoassemblanti ben caratterizzati ora possono essere esplorati come sistemi modello per sviluppare strategie di modificazione post-montaggio e dinamica chimica covalente e dintorni superfici di nanofibra peptide supramolecolari.

A parte la sintesi di uno stadio iniziale della molecola precursore dithiolane, il resto della sintesi del peptide di 1,2-dithiolane per volta si verifica su supporto solido (Figura 1A). La conversione di 3-bromo - 2-(bromomethyl) propionico acido 3-(acetylthio) -2-(acetylthiomethyl) propionico acido, il precursore di dithiolane, è confermata da 1H e 13C NMR (Figura 1B e C) prima di esso è a...

Un protocollo per la sintesi di un 1,2-dithiolane modificato peptide e la caratterizzazione delle strutture supramolecolari derivanti dal peptide self-assembly.

Sintesi e caratterizzazione di 1,2-Dithiolane per volta peptidi autoassemblanti

This report focuses on the synthesis of an N-terminus 1,2-dithiolane modified self-assembling peptide and the characterization of the resulting ...

Man mano che le strutture per aumentare la funzionalità delle strutture supermolecolari crescono, questo metodo di incorporare gruppi 1, 2-ditiolani con peptidi autoassemblanti può aiutare a rispondere a domande chiave sulla reattività sulle superfici supermolecolari. Il vantaggio principale di questa tecnica è che l'accoppiamento e la deprotezione della molecola precursore dell'1,2-ditiolano avviene sulla resina con un solo passaggio di purificazione del peptide finale modificato. Poiché il tempo necessario agli assemblaggi per maturare nelle loro strutture supermolecolari finali varia, la dimostrazione visiva dei metodi di caratterizzazione e dei risultati per gli assemblaggi supermolecolari è fondamentale.Per sintetizzare il precursore del ditiolano, sciogliere prima un grammo di acido 3-bromo-2-proprionico in circa quattro millilitri di idrossido di sodio monomolare in un pallone di reazione a fondo tondo da 50 millilitri a 55 gradi Celsius con agitazione. Quando tutto il reagente è stato sospeso in soluzione, sigillare il pallone di reazione con un setto e porre il pallone in atmosfera di azoto. Successivamente, aggiungi 1,49 grammi di tioacetato di potassio e tre millilitri di acido solforico a due molari a quattro millilitri di acqua deionizzata per creare acido tiocetico in situ.Aspirare la soluzione di acido tiocetico in una siringa di plastica monouso da 10 millilitri e dotare la siringa di un ago calibro 18, quindi perforare i setti con l'ago per aggiungere la miscela goccia a goccia al pallone di reazione e continuare la reazione durante la notte a 55 gradi Celsius. La mattina successiva, monitorare la reazione mediante cromatografia su strato sottile su piastre di gel di silice 60 F254 utilizzando una miscela di metanolo e diclorometano e visualizzando l'andamento della reazione mediante colorazione verde bromocresolo. Quando la reazione completata si è raffreddata a temperatura ambiente, acidificare la miscela con acido solforico a due molari a un pH di uno.Un olio giallo dovrebbe separarsi dalla soluzione, quindi estrarre il prodotto con tre aggiunte da 40 millilitri di cloroformio freddo e combinare gli strati organici per l'essiccazione su solfato di magnesio, rimuovendo il cloroformio a pressione ridotta. Il prodotto deve essere un olio giallo con una resa complessiva dell'83% e può essere utilizzato senza ulteriore purificazione. Per accoppiare il precursore del ditiolano all'N-terminale del peptide su resina, aggiungere quattro equivalenti del precursore del ditiolano a cinque millilitri di dimetilformammide, quattro equivalenti di HBTU e 10 equivalenti di DIPEA.Lasciare preattivare la miscela di accoppiamento per 10 minuti a temperatura ambiente prima di aggiungere il campione alla siringa fritta contenente resina N-terminale. Agitare la reazione di accoppiamento per due ore, seguita da tre lavaggi da cinque millilitri in dimetilformammide fresca e ripetere la reazione di accoppiamento e l'agitazione notturna. Dopo il secondo accoppiamento, lavare la resina con tre lavaggi di dimetilformammide da cinque millilitri seguiti da tre lavaggi di resina di diclorometano da cinque millilitri e trasferire la resina essiccata in un tubo di reazione a microonde da 10 millilitri.Quindi, per deproteggere il gruppo tioacetato dal precursore N-terminale del ditiolano, aggiungere due millilitri di dimetilformammide al tubo. Lasciare che la resina si gonfi, aggiungere una piccola ancoretta magnetica al recipiente e risospendere la resina con un'agitazione magnetica a bassa velocità. Dopo 15 minuti, aggiungere due millilitri di idrossido di ammonio concentrato alla provetta, tappare il recipiente di reazione con un setto di silicone e posizionare il recipiente in un reattore a microonde per 45 minuti a 75 gradi Celsius mescolando.Quando la reazione a microonde è completa, trasferire la resina in una siringa pulita, usa e getta e lavare la resina con due lavaggi di dimetilformammide da cinque millilitri e due lavaggi di metanolo da cinque millilitri. Dopo l'ultimo lavaggio, aggiungere cinque millilitri di cocktail di scissione alla siringa contenente resina per un'incubazione di 1 ora e mezza agitando delicatamente a temperatura ambiente. Per preparare un millilitro di peptide grezzo per la cromatografia liquida ad alte prestazioni o la purificazione HPLC, aggiungere 400 microlitri di stock peptidico concentrato in acetonitrile a 600 microlitri di acqua integrata con lo 0,1% di acido trifluoroacetico e filtrare la soluzione attraverso un filtro a siringa da 22 micrometri in una fiala HPLC.Per purificare il peptide, utilizzare una colonna semi-preparativa C18 a una portata di tre millilitri al minuto su un gradiente lineare dal 15 al 55% di acetonitrile in 20 minuti con i rivelatori UV impostati su 222 nanometri e 330 nanometri. Quindi raccogli e combina i picchi di interesse. Per la conferma del prodotto peptidico mediante tempo di volo di desorbimento/ionizzazione laser assistita da matrice o spettrometria di massa MOD-TOF, miscelare 0,5 microlitri del picco raccolto su una piastra di desorbimento/ionizzazione laser assistita da matrice contenente 0,5 microlitri di matrice di acido 2,5-diidrossibenzoico.Per preparare una soluzione di autoassemblaggio, sciogliere un milligrammo di polvere di peptide liofilizzato in una miscela di acetonitrile al 20% e HEPES da 10 millimolari in una provetta da microcentrifuga da 1,5 millilitri, quindi agitare la soluzione di assemblaggio e lasciare assemblare il campione a temperatura ambiente. Quando l'assemblaggio peptidico raggiunge la maturazione, asciugare da 8 a 10 microlitri della soluzione di assemblaggio come un film sottile sul cristallo di diamante attenuato a riflessione totale e monitorare la scomparsa di un picco d'acqua grande e largo da 1640 a 1631 centimetri inversi mentre si forma il film secco. Acquisisci spettri di fondo e infrarossi da 1500 a 1800 centimetri inversi con una media di 50 scansioni con una risoluzione di due centimetri inversi, sottraendo le scansioni di sfondo prima di ogni scansione del campione.La firma infrarossa per l'assemblaggio del foglio beta dovrebbe essere osservata come un picco acuto compreso tra 1625 e 1635 centimetri inversi. Quando i campioni di peptidi sono maturati in strutture supermolecolari ricche di fogli beta, caricare 10 microlitri della soluzione di assemblaggio del peptide sulla superficie di una griglia di carbonio per microscopio elettronico a trasmissione e lasciare che gli assemblaggi si adsorbiscano sulla superficie della griglia per uno o due minuti. Toccare la carta da filtro sul bordo della griglia per rimuovere il campione in eccesso e aggiungere 10 microlitri di colorante di acetato di uranile al 2% appena preparato sulla superficie della griglia per un'incubazione di due o tre minuti, quindi rimuovere la macchia in eccesso con carta da filtro e posizionare la griglia in un essiccatore sottovuoto durante la notte prima dell'imaging del giorno successivo mediante microscopia elettronica a trasmissione.A parte la sintesi iniziale in un solo passaggio della molecola precursore del ditiolano, il resto della sintesi del peptide modificato con 1,2-ditiolano avviene su supporto solido. La conversione dell'acido 3-bromo-2-proprionico in acido 3-2-propanoico, il precursore del ditiolano, è confermata dalla risonanza magnetica nucleare del protone e del carbonio-13 prima che venga accoppiato all'ammina N-terminale libera di un peptide ancora in resina. Dopo la deprotezione, il peptide grezzo viene purificato mediante HPLC in fase inversa e la massa del prodotto viene confermata dalla spettrometria di massa MOLDI-TOF.La spettroscopia infrarossa e di dicroismo circolare in trasformata di Fourier può essere utilizzata per monitorare l'autoassemblaggio del peptide 1,2-ditiolano purificato in fibre amiloidi mature per caratterizzare la loro conformazione estesa del foglio beta. Le fibre possono quindi essere visualizzate mediante microscopia elettronica a trasmissione. Sebbene questi metodi possano essere utilizzati per modificare l'N-terminale di qualsiasi sequenza peptidica ancora sulla resina, è importante ricordare che le condizioni di autoassemblaggio del peptide devono essere ottimizzate per ciascun peptide.Queste tecniche, che aggiungono gruppi 1, 2-ditiolano a peptidi autoassemblanti, consentiranno ai ricercatori nel campo dei biomateriali di esplorare la reattività superficiale supermolecolare.

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Un manuale semplice e generale metodo di sintesi peptoid con attrezzature di base e dei reagenti disponibili in commercio è delineato, consentendo peptoids per essere facilmente sintetizzati nella maggior parte dei laboratori. La sintesi, purificazione e caratterizzazione di un 36mer peptoid anfifilici è descritto, così come la sua auto-assemblaggio in altamente ordinato nanosheets.

Sintesi in fase solida Submonomer dei Polimeri Peptoid e il loro self-assembly in altamente ordinato nanosheets

Questo video dimostra l'auto-assemblaggio di peptidi amiloidi in una struttura supramolecolare ricca di fogli beta utilizzando la spettroscopia infrarossa in trasformata di Fourier. Un raggio infrarosso viene fatto passare attraverso un cristallo con un alto indice di rifrazione e viene registrato l'assorbimento di energia attraverso l'interfaccia del cristallo e del campione. Le strutture secondarie delle proteine del campione vengono identificate analizzando i loro picchi di assorbimento...

Una tecnica di spettroscopia infrarossa in trasformata di Fourier per studiare l'autoassemblaggio dei peptidi

Questo documento descrive la formazione di strutture a base di peptidi altamente ordinati dal processo spontaneo di auto-assemblaggio. Il metodo utilizza peptidi disponibili sul mercato e le apparecchiature di laboratorio comune. Questa tecnica può essere applicata a una grande varietà di peptidi e può portare alla scoperta di nuovi assemblaggi a base di peptidi.

Formazione di strutture biomolecolari ordinate dalla Self-assemblaggio di piccoli peptidi

Vi presentiamo un protocollo per la costruzione di thioether/vinile peptidi elicoidale solfuro-tethered utilizzando foto-indotta del tiolo-ene/tiolo-yne hydrothiolation.

Costruzione di peptidi elicoidale Via foto-indotta del tiolo-ene/yne Hydrothiolation Thioether/vinile solfuro-tethered

Questo protocollo descrive un metodo efficiente per sintetizzare una Nanoemulsione di un coniugato acido oleico acids-platinum(II) stabilizzato con un tripeptide di lisina-tirosina-fenilalanina (KYF). Le forme di Nanoemulsione in condizioni blande sintetiche tramite auto-assemblaggio del KYF e il coniugato.

Nanoemulsione Tripeptide-stabilizzato di acido oleico

Viene presentato un protocollo per la sintesi di oligomeri peptoidi codificati in informazioni e per l'autoassemblaggio di questi peptoidi diretti in sequenza in scale molecolari utilizzando ammine e aldeidi come coppie dinamiche di reazione covalenti e Lewis acida rara terra triflates in metallo come reagenti multiruolo.

Sintesi dei Peptoidi a informazione e del loro autoassemblaggio covalente dinamico diretto in sequenza

Questo protocollo presenta la sintesi di peptidi ciclici tramite bisalchilazione tra cisteina e metionina e la facile reazione tiolo-yne innescata dal centro del propargil sulfinfo.

Costruzione di peptidi ciclici utilizzando un centro di solfonio on-tether

Questo protocollo mira a valutare peptidi biofunzionali autoassemblanti per l'adesione cellulare, la morfologia degli organoidi e l'espressione genica mediante immunocolorazione. Utilizzeremo una linea cellulare di cancro del colon-retto per fornire un modo economico per ottenere organoidi per test intensivi.

Fabbricazione e caratterizzazione di organoidi di cancro del colon-retto da una linea cellulare SW1222 in una matrice peptidica autoassemblante ultracorta

Questo protocollo presenta tre metodi di preparazione rapidi e semplici che utilizzano le condizioni ambientali per innescare l'autoassemblaggio di peptidi in idrogel. Inoltre, viene descritta la caratterizzazione degli idrogel peptidici, dimostrando che gli idrogel peptidici meccanicamente stabili possono essere formati in queste semplici condizioni.

Preparazione di idrogel peptidi autoassemblati meccanicamente stabili

Peptide ammidi terziarie (PTA) sono una superfamiglia di peptidomimetici che includono ma non sono limitate a peptidi, peptoids e peptidi N-metilato. Qui si descrive un metodo sintetico che combina split-e-pool e le strategie sub-monomeri per sintetizzare un one-tallone biblioteca un composto di PTA.

Split-e-pool Sintesi e caratterizzazione di peptidi Terziario Ammide Biblioteca

Scopri la sintesi di peptidi modificati con 1,2-dithiolane per la chimica supramolecolare. Questo metodo efficiente consente accoppiamento e deprotezione su resina con un'unica purificazione finale.

Sintesi e caratterizzazione di 1,2-Dithiolane per volta peptidi autoassemblanti

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