Sintesi e caratterizzazione di 1,2-Dithiolane per volta peptidi autoassemblanti

Man mano che le strutture per aumentare la funzionalità delle strutture supermolecolari crescono, questo metodo di incorporare gruppi 1, 2-ditiolani con peptidi autoassemblanti può aiutare a rispondere a domande chiave sulla reattività sulle superfici supermolecolari. Il vantaggio principale di questa tecnica è che l'accoppiamento e la deprotezione della molecola precursore dell'1,2-ditiolano avviene sulla resina con un solo passaggio di purificazione del peptide finale modificato. Poiché il tempo necessario agli assemblaggi per maturare nelle loro strutture supermolecolari finali varia, la dimostrazione visiva dei metodi di caratterizzazione e dei risultati per gli assemblaggi supermolecolari è fondamentale.

Per sintetizzare il precursore del ditiolano, sciogliere prima un grammo di acido 3-bromo-2-proprionico in circa quattro millilitri di idrossido di sodio monomolare in un pallone di reazione a fondo tondo da 50 millilitri a 55 gradi Celsius con agitazione. Quando tutto il reagente è stato sospeso in soluzione, sigillare il pallone di reazione con un setto e porre il pallone in atmosfera di azoto. Successivamente, aggiungi 1,49 grammi di tioacetato di potassio e tre millilitri di acido solforico a due molari a quattro millilitri di acqua deionizzata per creare acido tiocetico in situ.

Aspirare la soluzione di acido tiocetico in una siringa di plastica monouso da 10 millilitri e dotare la siringa di un ago calibro 18, quindi perforare i setti con l'ago per aggiungere la miscela goccia a goccia al pallone di reazione e continuare la reazione durante la notte a 55 gradi Celsius. La mattina successiva, monitorare la reazione mediante cromatografia su strato sottile su piastre di gel di silice 60 F254 utilizzando una miscela di metanolo e diclorometano e visualizzando l'andamento della reazione mediante colorazione verde bromocresolo. Quando la reazione completata si è raffreddata a temperatura ambiente, acidificare la miscela con acido solforico a due molari a un pH di uno.

Un olio giallo dovrebbe separarsi dalla soluzione, quindi estrarre il prodotto con tre aggiunte da 40 millilitri di cloroformio freddo e combinare gli strati organici per l'essiccazione su solfato di magnesio, rimuovendo il cloroformio a pressione ridotta. Il prodotto deve essere un olio giallo con una resa complessiva dell'83% e può essere utilizzato senza ulteriore purificazione. Per accoppiare il precursore del ditiolano all'N-terminale del peptide su resina, aggiungere quattro equivalenti del precursore del ditiolano a cinque millilitri di dimetilformammide, quattro equivalenti di HBTU e 10 equivalenti di DIPEA.

Lasciare preattivare la miscela di accoppiamento per 10 minuti a temperatura ambiente prima di aggiungere il campione alla siringa fritta contenente resina N-terminale. Agitare la reazione di accoppiamento per due ore, seguita da tre lavaggi da cinque millilitri in dimetilformammide fresca e ripetere la reazione di accoppiamento e l'agitazione notturna. Dopo il secondo accoppiamento, lavare la resina con tre lavaggi di dimetilformammide da cinque millilitri seguiti da tre lavaggi di resina di diclorometano da cinque millilitri e trasferire la resina essiccata in un tubo di reazione a microonde da 10 millilitri.

Quindi, per deproteggere il gruppo tioacetato dal precursore N-terminale del ditiolano, aggiungere due millilitri di dimetilformammide al tubo. Lasciare che la resina si gonfi, aggiungere una piccola ancoretta magnetica al recipiente e risospendere la resina con un'agitazione magnetica a bassa velocità. Dopo 15 minuti, aggiungere due millilitri di idrossido di ammonio concentrato alla provetta, tappare il recipiente di reazione con un setto di silicone e posizionare il recipiente in un reattore a microonde per 45 minuti a 75 gradi Celsius mescolando.

Quando la reazione a microonde è completa, trasferire la resina in una siringa pulita, usa e getta e lavare la resina con due lavaggi di dimetilformammide da cinque millilitri e due lavaggi di metanolo da cinque millilitri. Dopo l'ultimo lavaggio, aggiungere cinque millilitri di cocktail di scissione alla siringa contenente resina per un'incubazione di 1 ora e mezza agitando delicatamente a temperatura ambiente. Per preparare un millilitro di peptide grezzo per la cromatografia liquida ad alte prestazioni o la purificazione HPLC, aggiungere 400 microlitri di stock peptidico concentrato in acetonitrile a 600 microlitri di acqua integrata con lo 0,1% di acido trifluoroacetico e filtrare la soluzione attraverso un filtro a siringa da 22 micrometri in una fiala HPLC.

Per purificare il peptide, utilizzare una colonna semi-preparativa C18 a una portata di tre millilitri al minuto su un gradiente lineare dal 15 al 55% di acetonitrile in 20 minuti con i rivelatori UV impostati su 222 nanometri e 330 nanometri. Quindi raccogli e combina i picchi di interesse. Per la conferma del prodotto peptidico mediante tempo di volo di desorbimento/ionizzazione laser assistita da matrice o spettrometria di massa MOD-TOF, miscelare 0,5 microlitri del picco raccolto su una piastra di desorbimento/ionizzazione laser assistita da matrice contenente 0,5 microlitri di matrice di acido 2,5-diidrossibenzoico.

Per preparare una soluzione di autoassemblaggio, sciogliere un milligrammo di polvere di peptide liofilizzato in una miscela di acetonitrile al 20% e HEPES da 10 millimolari in una provetta da microcentrifuga da 1,5 millilitri, quindi agitare la soluzione di assemblaggio e lasciare assemblare il campione a temperatura ambiente. Quando l'assemblaggio peptidico raggiunge la maturazione, asciugare da 8 a 10 microlitri della soluzione di assemblaggio come un film sottile sul cristallo di diamante attenuato a riflessione totale e monitorare la scomparsa di un picco d'acqua grande e largo da 1640 a 1631 centimetri inversi mentre si forma il film secco. Acquisisci spettri di fondo e infrarossi da 1500 a 1800 centimetri inversi con una media di 50 scansioni con una risoluzione di due centimetri inversi, sottraendo le scansioni di sfondo prima di ogni scansione del campione.

La firma infrarossa per l'assemblaggio del foglio beta dovrebbe essere osservata come un picco acuto compreso tra 1625 e 1635 centimetri inversi. Quando i campioni di peptidi sono maturati in strutture supermolecolari ricche di fogli beta, caricare 10 microlitri della soluzione di assemblaggio del peptide sulla superficie di una griglia di carbonio per microscopio elettronico a trasmissione e lasciare che gli assemblaggi si adsorbiscano sulla superficie della griglia per uno o due minuti. Toccare la carta da filtro sul bordo della griglia per rimuovere il campione in eccesso e aggiungere 10 microlitri di colorante di acetato di uranile al 2% appena preparato sulla superficie della griglia per un'incubazione di due o tre minuti, quindi rimuovere la macchia in eccesso con carta da filtro e posizionare la griglia in un essiccatore sottovuoto durante la notte prima dell'imaging del giorno successivo mediante microscopia elettronica a trasmissione.

A parte la sintesi iniziale in un solo passaggio della molecola precursore del ditiolano, il resto della sintesi del peptide modificato con 1,2-ditiolano avviene su supporto solido. La conversione dell'acido 3-bromo-2-proprionico in acido 3-2-propanoico, il precursore del ditiolano, è confermata dalla risonanza magnetica nucleare del protone e del carbonio-13 prima che venga accoppiato all'ammina N-terminale libera di un peptide ancora in resina. Dopo la deprotezione, il peptide grezzo viene purificato mediante HPLC in fase inversa e la massa del prodotto viene confermata dalla spettrometria di massa MOLDI-TOF.

La spettroscopia infrarossa e di dicroismo circolare in trasformata di Fourier può essere utilizzata per monitorare l'autoassemblaggio del peptide 1,2-ditiolano purificato in fibre amiloidi mature per caratterizzare la loro conformazione estesa del foglio beta. Le fibre possono quindi essere visualizzate mediante microscopia elettronica a trasmissione. Sebbene questi metodi possano essere utilizzati per modificare l'N-terminale di qualsiasi sequenza peptidica ancora sulla resina, è importante ricordare che le condizioni di autoassemblaggio del peptide devono essere ottimizzate per ciascun peptide.

Queste tecniche, che aggiungono gruppi 1, 2-ditiolano a peptidi autoassemblanti, consentiranno ai ricercatori nel campo dei biomateriali di esplorare la reattività superficiale supermolecolare.