Name: Sviluppo di un Backbone ciclico Peptide Biblioteca come potenziale Antiparassitaria Therapeutics Uso Microonde irradiazione (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-01-26T20:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 48 s
Description: Scopri la sintesi di peptidi ciclici mediante irradiazione a microonde per lo sviluppo di nuovi farmaci antiparassitari. Questo metodo consente di creare librerie con diversità conformazionale e targeting di interazioni proteina-proteina.

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Ringraziamo Lauren Van Wassenhove, Sunhee Hwang, e Daria Mochly-Rosen per le discussioni utili. Il lavoro è stato sostenuto dal National Institutes of Health di Grant NIH RC4 TW008781-01 C-IDEA (SPARK) per NQ I finanziatori non hanno avuti ruolo nel disegno dello studio, la raccolta e l&#39;analisi dei dati, decisione di pubblicare, o preparazione del manoscritto.

1. Attrezzature e reagenti Preparazione <ol><li> Attrezzature Preparazione <ol><li> Eseguire tutti i passaggi all&#39;interno di una cappa aspirante con un equipaggiamento di protezione personale. </li><li> Chimicamente sintetizzare peptidi su supporto solido con un microonde Peptide Synthesizer con un modulo aggiuntivo di Discover dotato di una sonda di temperatura a fibre ottiche per il controllo della erogazione microonde alimentazione in un recipiente di reazione Teflon (30 ml, con una fritta di vetro) o in polipropilene monouso Cartuccia (12 ml, con una fritta ruvida). </li><li> Per una corretta miscelazione, collegare l&#39;alimentazione di azoto al recipiente di reazione, oppure sigillare entrambe le estremità della cartuccia polipropilene, e disporre su un agitatore rotante. </li><li> Per scaricare miscele di reazione o lavaggi, collegare alla casa del vuoto attraverso un sifone. </li><li> Posizionare la sonda in fibra ottica nel recipiente di reazione. </li></ol></li><li> Preparazione reagenti <ol><li> Preparare la resina pesando Rink Amide AM resina 100-200 mesh (0.204 mg), Aggiungere 5 ml di miscela 1: 1 di N, N -dimethylformamide (DMF) / diclorometano (DCM) alla cartuccia recipiente / polipropilene reazione per lavare la resina giù, agitare per 2-4 ore a gonfiarsi correttamente, e drenare. </li><li> Preparare 0,2 M 9-fluorenilmetossicarbonile (Fmoc) ammino soluzioni acide sciogliendo il corrispondente acido Fmoc-ammino in DMF e agitare la miscela fino amminoacidi vengono sciolti (Tabella 1). </li><li> Preparare 0,45 M attivatore mix soluzione sciogliendo 18,96 g O - (benzotriazol-1-il) - N, N, N &#39;, N&#39; esafluorofosfato -tetramethyluronium (HBTU) in 100 ml di DMF e vortex la miscela fino a quando il solido è sciolto (Tabella 1). </li><li> Preparare 2 M di base attivatore mix soluzione combinando 34,8 ml N, N -diisopropylethylamine (DIEA) con 65,2 ml 1-metil-2-pirrolidinone (NMP) (Tabella 1). </li><li> Preparare 0,1 M deprotezione mix soluzione sciogliendo idrato 3,37 g 1-idrossibenzotriazolo (HOBt)in 250 ml di una v / v soluzione al 20% di piperidina in DMF e vortex la miscela fino a quando il solido viene disciolto (Tabella 1). </li></ol></li></ol> 2. Fmoc-protetti Amino Acid Accoppiamento <ol><li> Accoppiamento aminoacido <ol><li> Aggiungere amminoacido (2,5 ml) / attivatore (1 ml) / base attivatore (0,5 ml) per reazione cartuccia nave / polipropilene e lasciare che la reazione procede per 300 sec (25 W, 75 ° C, tabella 2). Scolare la soluzione. </li><li> Lavare la resina con DMF. Aggiungere DMF alla resina per 120 secondi (7 ml, 0 W, RT) e scaricare la soluzione. Ripetere cinque volte. </li></ol></li><li> Deprotezione Fmoc <ol><li> Aggiungere 7 ml di 20% piperidina in DMF con 0,1 M HOBt reazione cartuccia nave / polipropilene e incubare per 30 sec (45 W, 75 ° C, tabella 2). </li><li> Scolare la miscela di reazione. </li><li> Aggiungere 7 ml di 20% piperidina in DMF con 0,1 M HOBt di reazione cartuccia nave / polipropilene e incubare per 180 secondi (45 W, 75 ° C, tabella 2). </li><li> Scolare la miscela di reazione. </li><li> Lavare la resina con DMF. Aggiungere DMF alla resina per 120 secondi (7 ml 0 W, rt) e scaricare la soluzione. Ripetere cinque volte. Nota: In alternativa, mettere in pausa la procedura qui e riprendere in un secondo momento. </li></ol></li><li> Dopo amminoacido fase di accoppiamento, lavare la resina con DCM e conservare per almeno alcuni giorni a 4 ° C (per un periodo più lungo deposito resina a - 20 ° C). <ol><li> Spostare la resina dal recipiente di reazione ad una cartuccia polipropilene. </li><li> Lavare la resina con DCM. Aggiungere DCM alla resina per 120 secondi (7 ml, 0 W, rt) e scaricare la soluzione. Ripetete per tre volte. </li><li> Sigillare la cartuccia in polipropilene strettamente con un tappo superiore e rubinetto. </li><li> Prima di iniziare una nuova sintesi, gonfiare la resina per 3-4 ore in DMF (7 ml). </li></ol></li><li> Monitoraggio sintesi <ol><li> Utilizzare il test Kaiser (ninidrina) o il test cloranile per determinare rapidamente il progresso dellasintesi. Facoltativamente, eseguire una reazione di scissione piccola scala per determinare la purezza e la massa del peptide sintetizzato. Vedere la sezione 9. Nota: Per ulteriori guasti vedi tabella 3. </li></ol></li><li> Ripetere i punti 2.1 e 2.2, se lo desideri di sintetizzare peptidi mirati: Arg(Pbf)-Asn(Trt)-Gly-Gln(Trt)-Cys(Trt)-Gln(Trt)-Arg(Pbf)-Lys(Boc)-Lys(Mtt)-Gly-Gly-Tyr(But)-Gly-Arg(Pbf)-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Arg(Pbf)-Arg(Pbf)-Gln(Trt)-Arg(Pbf)-Arg(Pbf)-Arg(Pbf). </li></ol> 3. Anidride / Acid Accoppiamento <ol><li> Accoppiamento Anidride <ol><li> Lavare la resina con NMP. Aggiungere NMP alla resina per 120 secondi (7 ml, 0 W, rt) e scaricare la soluzione. Ripetete per tre volte. </li><li> Sciogliere 10 equivalenti di anidride corrispondente in NMP (5 ml), aggiungere 1 equivalente 4-dimetilamminopiridina (DMAP) e 10 equivalenti DIEA alla soluzione (Tabella 1). </li><li> Aggiungere 10: 1: 10 miscela di anidride / DMAP / DIEA alla resina e incubare per 300 sec (25W, 75 ° C, tabella 2). Scolare la soluzione. </li><li> Lavare la resina con NMP. Aggiungere NMP alla resina per 120 secondi (7 ml, 0 W, rt) e scaricare la soluzione. Ripetete per tre volte. </li></ol></li><li> Accoppiamento acido <ol><li> Lavare la resina con DMF. Aggiungere DMF alla resina per 120 secondi (7 ml, 0 W, rt) e scaricare la soluzione. Ripetete per tre volte. </li><li> Sciogliere 10 equivalenti del corrispondente acido bicarbossilico in DMF (5 ml). Aggiungere 1 DMAP equivalente e 10 equivalenti N, N &#39;-Diisopropylcarbodiimide (DIC) alla soluzione (Tabella 1). </li><li> Pre-attivare l&#39;impasto mescolando per 30 minuti. </li><li> Aggiungere la miscela alla resina e incubare per 300 sec (25 W, 75 ° C, tabella 2) e scaricare la soluzione. </li><li> Lavare la resina con DMF. Aggiungere DMF alla resina per 120 secondi (7 ml, 0 W, rt) e scaricare la soluzione. Ripetere il passaggio tre volte. </li></ol></li></ol> 4. N-methyltrityl (MTT) Proteggere Gruppo Deprotectione Nota: La catena laterale lisina è stato protetto con N-methyltrityl (MTT) 81, un gruppo di protezione che può essere deprotetto selettivamente in condizioni acide labili 82,83. Deprotect Mtt gruppo protettivo manualmente su un agitatore senza energia a microonde. <ol><li> Trasferire la resina di una cartuccia in polipropilene dotato di spina tappo e rubinetto di arresto. </li><li> Lavare la resina con DCM. Aggiungere DCM alla resina per 120 secondi (7 ml, 0 W, rt) e scaricare la soluzione. Ripetete per tre volte. </li><li> Aggiungere 15-25 ml di una miscela di 1% di acido trifluoroacetico (TFA), 5% Triisopropylsilane (TIS), e 94% DCM alla cartuccia polipropilene per grammo di resina. Nota: TFA è un acido forte e corrosivo ed è estremamente irritante per la pelle, occhi e tessuto polmonare. <ol><li> Mantenere soluzioni concentrate di TFA nella cappa in ogni momento. </li><li> Usare un equipaggiamento di protezione personale (protezione per gli occhi, un camice da laboratorio e guanti) e lavorare in una cappa ben ventilata. Cambiare i guanti tempestivamentese vengono a contatto con TFA e subito clean-up tutte le cadute. Se la pelle o gli occhi entrano in contatto con l&#39;acido, risciacquare immediatamente la zona interessata con acqua e lavare per altri 15 min. </li></ol></li><li> Posizionare la cartuccia polipropilene su un agitatore e agitare per 5 minuti a temperatura ambiente. </li><li> Scolare la soluzione dalla cartuccia polipropilene applicando il vuoto. </li><li> Ripetere i passaggi 4,3-4,5, tre volte. </li><li> Lavare la resina con DCM. Aggiungere DCM alla resina per 120 secondi (7 ml, 0 W, rt) e scaricare la soluzione. Ripetere cinque volte. </li></ol> 5. La ciclizzazione del peptide lineare <ol><li> Lavare la resina con DCM. Aggiungere DCM alla resina per 120 secondi (7 ml, 0 W, rt) e scaricare la soluzione. Ripetere cinque volte. </li><li> In una provetta di polipropilene da 50 ml, sciogliere 5 equivalenti benzotriazolo-1-ly-ossi-tris-pyrrolidinophosphonium hexafluorphosphate (PyBOP) in Dibromomethane (DBM, 5 ml) e aggiungere 10 equivalenti DIEA alla soluzione (Tabella 1). </li><li&gt; Aggiungi la miscela di resina e incubare per 300 sec (25 W, 75 ° C, tabella 2). Scolare la soluzione. </li><li> Lavare la resina con DCM. Aggiungere DCM alla resina per 120 secondi (7 ml, 0 W, rt) e scaricare la soluzione. Ripetete per tre volte. </li></ol> 6. fenditura e Deprotezione di Side catena Gruppi <ol><li> Lavare la resina con DCM ed etere etilico. <ol><li> Aggiungere DCM alla resina per 120 secondi (7 ml, 0 W, rt) e scaricare la soluzione. Ripetere due volte. </li><li> Aggiungi etere etilico alla resina per 120 secondi (7 ml, 0 W, rt) e scaricare la soluzione. Ripetere due volte. </li></ol></li><li> Essiccare la resina in essiccatore sotto vuoto a temperatura ambiente per almeno 3 ore su idrossido di potassio (KOH, 1-10 g). </li><li> Pesare la resina essiccata e trasferirlo ad una cartuccia polipropilene. </li><li> Aggiungere 10 ml di acido trifluoroacetico un (TFA) cleavage cocktail pre-raffreddata (per esempio, 90% TFA, 2,5% di acqua, 2,5% e 5% TIS fenolo) per ogni grammo di resina. </li><li> Agitare per 3 orea RT. </li><li> Raccogliere la soluzione scissione TFA filtrando la resina in un tubo di polipropilene da 50 ml. Per la filtrazione, utilizzare la fritta che è nella cartuccia polipropilene 12 ml. </li><li> Aggiungere dietiletere freddo (35 ml) al tubo. </li><li> Centrifugare per 5 minuti a 1207 xg a 4 ° C. </li><li> Decantare lo strato di etere. </li><li> Ripetere il passaggio 6,7-6,9, cinque volte. </li></ol> 7. Asciugare il Backbone ciclico Peptide <ol><li> Mantenere il peptide precipitato nello stesso tubo e asciugare in una cappa per 30 min. </li><li> Sciogliere il peptide in una miscela 1: 1 di acqua e acetonitrile (ACN). </li><li> Congelare la soluzione finale del prodotto in azoto liquido. </li><li> Lyophilize il prodotto finale. </li></ol> 8. Caratterizzazione Backbone ciclico Peptide <ol><li> Sciogliere un piccolo campione (1 mg) del prodotto in acqua (400 ml). </li><li> Iniettare il peptide disciolto (10-200 microlitri) ad una fase inversa liquida ad alta prestazione chromatography sistema (RP-HPLC) a verificare la purezza 34 peptide. </li><li> Controllare la massa del peptide usando la spettrometria di massa matrix-assisted laser desorbimento di ionizzazione (MALDI-MS) 84. <ol><li> Mescolare 1 ml (100 mM) peptide in un 1: 1 (v / v) di acetonitrile: acqua con 1 ml di matrice (acido 5 mg / ml, α-ciano-4-idrossicinnamico) in rapporto 1: 1 (v / v) di acetonitrile: acqua con TFA (0,1%). </li><li> Spot 1 ml sulla piastra MS-MALDI. </li><li> Asciugare il campione e collocarlo nello spettrometro di massa. </li></ol></li><li> Pesare il peptide e calcolare la resa per cento. </li><li> Conservare a -20 ° C. </li></ol> 9. Monitoraggio della sintesi <ol><li> Kaiser (ninidrina) prova di 85 <ol><li> Preparare le soluzioni dei reagenti. <ol><li> Preparare una soluzione sciogliendo 16,5 mg di cianuro di potassio (KCN) in 25 ml di acqua distillata. Diluire 1 ml della suddetta soluzione con 49 ml di piridina. </li><li> Preparare la Soluzione Bsciogliendo 1 g di ninidrina in 20 ml di etanolo. </li><li> Preparare Soluzione C sciogliendo 40 g di fenolo in 20 ml di etanolo. </li></ol></li><li> Utilizzare il test Kaiser per controllare il completamento dell&#39;accoppiamento amminoacido o la deprotezione del gruppo protettivo. <ol><li> Trasferire alcune perle dalla resina in una provetta. </li><li> Aggiungere tre gocce (~ 100 microlitri) di ciascuna soluzione (A, B e C) e mescolare. </li><li> Riscaldare la provetta su una piastra riscaldante a 110 ° C per 5 min. Nota: perline colorate blu (risultato positivo) indicano reazione di accoppiamento incompleto o deprotezione Fmoc gruppo protettivo. </li></ol></li></ol></li><li> Test cloranile 86 <ol><li> Preparare i seguenti reagenti freschi per ogni test. <ol><li> Preparare una soluzione di 2% cloranile in DMF, la soluzione A. </li><li> Preparare una soluzione di 2% acetaldeide in DMF, soluzione B. </li></ol></li><li> Eseguire il test cloranile per verificare il completamento di accoppiamento aminoacido o tha deprotezione del gruppo protettivo. <ol><li> Miscelare 100 ml di soluzione A con 100 ml di soluzione B in una provetta da 1,5 ml. </li><li> Cada le perline e agitare delicatamente per 5 minuti. Nota: perline colorate marrone scuro (risultato positivo) indicano deprotezione del gruppo protettivo Fmoc o una reazione giunto incompleto. </li></ol></li></ol></li><li> Reazione scissione piccola scala <ol><li> Rimuovere una piccola quantità di resina ad una cartuccia polipropilene 3 ml equipaggiato con spina tappo e rubinetto. </li><li> Trattare con una miscela 2 ml di 95% TFA, 2,5% di acqua e 2,5% TIS. </li><li> Agitare la miscela per 30 minuti a RT. </li><li> Rimuovere la resina per filtrazione usando la fritta della cartuccia polipropilene ed evaporare i solventi da un flusso di azoto. </li><li> Riprendere il residuo con acqua e analizzare il prodotto mediante HPLC e / o MS. </li></ol></li></ol> 10. Leishmania donovani promastigote vitalità in Cultura Assay <ol> &lt;li&gt; Leishmania donovani (L. donovani) condizioni di crescita e di trattamento <ol><li> Cultura L. promastigoti donovani in Modifica di Dulbecco di Eagle (DMEM) con 4,5 g / L di glucosio, L-glutammina, e piruvato di sodio a 26 ° C. </li><li> Trattare la L. donovani promastigoti con peptidi ciclici (100 micron) per 24 ore a 26 ° C. </li></ol></li><li> Leishmania donovani (L. donovani) saggio di redditività <ol><li> Valutare la vitalità del parassita con 20 microlitri alamarBlue secondo il protocollo del produttore. </li><li> Determinare riduzione alamarBlue la fluorescenza di misura (a 570 nm di eccitazione e 590 nm di emissione). Valori di fluorescenza più alti indicano maggiore attività metabolica e una maggiore vitalità del parassita. </li></ol></li></ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

La sintesi di una libreria mirata di backbone peptidi ciclici derivati ​​dalla proteina LACK del parassita Leishmania usando un forno a microonde sintetizzatore automatizzato è descritto. Una libreria concentrato di peptidi ciclici è stato sviluppato con farmacofori conservate e diversi linker. L&#39;aggiunta di vari linker come anidride glutarica, anidride succinica, acido adipico, acido pimelico, lisina, ornitina, e altri blocchi può essere utilizzato per aumentare la varietà dello spazio conformazionale dei ...

Interazioni proteina-proteina (PPI) svolgono un ruolo fondamentale nella maggior parte dei processi biologici, da intracellulare trasduzione del segnale di morte cellulare 1. Quindi, il targeting PPI è di fondamentale importanza per la ricerca di base e applicazioni terapeutiche. PPI possono essere regolate da anticorpi specifici e stabili, ma anticorpi sono costosi e difficili da produrre e hanno scarsa biodisponibilità. In alternativa, PPI possono essere bersaglio di piccole molecole. Piccole molecole sono più facili da sintetizzare e poco costoso rispetto agli anticorpi; tuttavia, sono relativamente meno flessibili e si adattano meglio piccole cavità di grandi interfacce proteina-proteina 2,3. Diversi studi hanno dimostrato che i peptidi, che sono più semplici e meno costosi rispetto agli anticorpi e più flessibile di piccole molecole, possono legarsi interfacce proteine ​​e regolare PPI 4,5. Il mercato globale peptide terapeutico è stata valutata una quindicina di miliardi di dollari nel 2013 ed è in crescita del 10,5% annually 6. Inoltre, ci sono più di 50 peptidi commercializzati, circa 270 peptidi in diverse fasi di sperimentazione clinica, e circa 400 peptidi in fase preclinica avanzate 7. Sebbene numerosi peptidi vengono utilizzati come farmaci, peptidi pongono ancora diverse sfide che limitano la loro applicazione diffusa tra cui scarsa biodisponibilità e la stabilità, l&#39;inefficienza nelle membrane cellulari di attraversamento, e la flessibilità conformazionale 8,9. Una alternativa per superare questi inconvenienti è applicare diverse modifiche come (D-amminoacido e N-alchilazione) locale e globale (ciclizzazione) vincoli 8,10-12. Queste modifiche si verificano anche in natura. Ad esempio, ciclosporina A, un peptide ciclico naturale immunosoppressore, contiene un singolo D-amminoacido e subisce N-alchilazione modifiche 13,14. Modifica di aminoacidi naturali per indurre vincoli locali, come D- e N-alchilazione, spesso colpisce il peptide9; s attività biologica. Tuttavia, ciclizzazione, in cui la sequenza di interesse può rimanere lo stesso, è più probabile per preservare l&#39;attività biologica. Ciclizzazione è un modo molto attraente per restringere peptide spazio conformazionale riducendo l&#39;equilibrio tra le diverse conformazioni. Di solito aumenta l&#39;attività biologica e selettività limitando il peptide alla conformazione attiva che media una sola funzione. Ciclizzazione migliora anche la stabilità peptide mantenendo il peptide in una conformazione che è meno riconosciuto da enzimi di degradazione. Infatti, peptidi ciclici hanno dimostrato di aver migliorato la stabilità metabolica, la biodisponibilità, e la selettività rispetto ai loro omologhi lineari 15-17. Tuttavia, ciclizzazione può essere un&#39;arma a doppio taglio poiché in alcuni casi la restrizione può impedire che i peptidi di raggiungere una conformazione bioattiva. Per superare questo ostacolo, una biblioteca focalizzato in cui tutti i peptidi hanno lo stesso SEQUENC primarioe di conseguenza costanti pharmacophores possono essere sintetizzati. Peptidi nella libreria differiscono parametri che influenzano la loro struttura, come la dimensione e la posizione dell&#39;anello, in modo da schermare successivamente per la conformazione più bioattivo 9,18. I peptidi possono essere sintetizzati sia in soluzione e da un approccio di sintesi peptidica in fase solida (SPPS), che ora è il metodo più diffuso sintesi peptidica e sarà discusso ulteriormente. SPPS è un processo mediante il quale trasformazioni chimiche vengono eseguite su un supporto solido tramite un linker per preparare una vasta gamma di composti sintetici 19. SPPS consente assemblaggio peptidi di accoppiamento consecutivo di aminoacidi in modo graduale dal C-terminale, che è attaccato ad un supporto solido, al N-terminale. Le catene laterali di acido N-alfa-ammino devono essere mascherati con gruppi protettivi che sono stabili nelle condizioni di reazione utilizzate durante peptide allungamento per garantire l&#39;aggiunta di un amminoacido per step. Nella fase finale, il peptide viene rilasciato dalla resina e la catena laterale gruppi protettori sono contemporaneamente rimossi. Mentre il peptide viene sintetizzato, tutti i reagenti solubili possono essere rimossi dal peptide-solido matrice di supporto per filtrazione e lavato via alla fine di ogni fase di accoppiamento. Con tale sistema, un grande eccesso di reagenti ad alta concentrazione può guidare reazioni di accoppiamento a completamento e tutti i passaggi di sintesi può essere effettuato nello stesso recipiente senza trasferimento di materiale 20. Sebbene SPPS ha alcune limitazioni, quali la produzione di reazioni incomplete, reazioni collaterali, reagenti impuri, nonché difficoltà di controllo della reazione 21, i vantaggi di SPPS hanno reso il &quot;gold standard&quot; per la sintesi peptidica. Questi vantaggi includono la possibilità di incorporare amminoacidi non naturali, automazione, facile purificazione, perdite fisiche minimizzate, e l&#39;uso di reagenti in eccesso, con conseguentealti rendimenti. SPPS ha dimostrato di essere estremamente utile nella sintesi di sequenze difficili 21,22, modifiche fluorescenti 23, e librerie peptidiche 24,25. SPPS è anche molto utile per altri assembly poli-chain, come oligonucleotidi 26,27, 28,29, oligosaccaridi e peptide acidi nucleici 30,31. È interessante notare che, in alcuni casi, SPPS ha dimostrato di essere vantaggioso per sintetizzare piccole molecole che sono tradizionalmente realizzati in soluzione 32,33. SFF è utilizzato sia in piccola scala per la ricerca e l&#39;insegnamento 34,35, così come su larga scala nel settore industriale 36-38. Due strategie di sintesi che sono utilizzati principalmente nella metodologia SPPS per la sintesi di peptidi sono butilossicarbonile (Boc) e 9-fluorenilmetossicarbonile (Fmoc). La strategia originale introdotte per SPPS era Boc, che richiede condizioni di acidi forti per rimuovere catena laterale gruppi protettori e fendere il peptide dal rEsin. Sintesi peptidica Fmoc-based utilizza tuttavia moderate condizioni di base ed è un mite alternativa al protocollo Boc acido labile 39. La strategia Fmoc utilizza ortogonale t-butile (tBu) Protezione catena laterale che viene rimosso nell&#39;ultimo passaggio della sintesi mentre fende il peptide dalla resina in condizioni acide. Il principio generale per la sintesi peptidica su supporto solido è presentato in Figura 1. L&#39;aminoacido iniziale, mascherato da un gruppo di protezione temporanea sul N-α-terminale, viene caricato sulla resina dal C-terminale. Un gruppo protettivo semipermanente per mascherare la catena laterale è anche utilizzato se necessario (Figura 1, Passaggio 1). La sintesi del peptide bersaglio viene assemblato dal C-terminale all&#39;N-terminale da cicli ripetitivi di deprotezione del gruppo protettivo N-α-temporaneo (Figura 1, fase 2) e accoppiamento del successivo amminoacido protetto (Figura 1 </str<html> ong&gt;, punto 3). Dopo l&#39;ultimo aminoacido viene caricato (Figura 1, fase 4), il peptide viene scissa dal supporto di resina e dei gruppi protettivi semi-permanenti sono rimossi (Figura 1, fase 5). <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/53589/53589fig1.jpg" /> Figura 1. Schema generale di sintesi in fase solida del peptide. L&#39;amminoacido N-α-protetto viene ancorato con il gruppo carbossilico tramite un linker alla resina (Passaggio 1). Il peptide desiderato viene assemblata in modo lineare dal C-terminale all&#39;N-terminale da cicli ripetitivi di deprotezione del gruppo protettivo temporaneo (TPG) dal N-α (Fase 2) e accoppiamento aminoacido (Passaggio 3). Dopo realizzare la sintesi (passo 4), i gruppi protettori semipermanenti (SPG) sono deprotetto durante peptide clivaggio (Fase 5).ottenere = &quot;_ blank&quot;&gt; Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura. Dopo il montaggio della catena peptidica completa, ciclizzazione può essere ottenuto mediante diverse alternative: (A) testa-coda ciclizzazione - questo è un modo conveniente ma limitato in quanto fornisce una sola opzione per ciclizzazione (Figura 2A), (B) ciclizzazione utilizzando gli aminoacidi della sequenza di interesse che contengono gruppi funzionali bioattive - tuttavia, l&#39;uso di questi aminoacidi può influenzare l&#39;attività biologica (Figura 2B), e (C) ciclizzazione aggiungendo aminoacidi (o altri blocchi) senza disturbare la sequenza bioattivo. Introducendo queste molecole è diffuso in quanto consente produzione di librerie focalizzate senza modificare la sequenza di interesse (Figura 2C). <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/53589/53589fig2.jpg" /> FIGURA 2. strategie peptide Alternativa ciclizzazione (A) testa-coda ciclizzazione, attraverso un legame peptidico tra il C-terminale e N-terminale.; (B) ciclizzazione tra i gruppi funzionali come un legame disolfuro tra i residui di cisteina (1), o un legame ammidico tra le catene laterali di lisina per acido aspartico / glutammico (2), o catena laterale di N- o C-terminale (3 -4); (C) ciclizzazione con l&#39;aggiunta di amminoacidi extra o derivati ​​degli aminoacidi o piccole molecole, ad esempio prima (R0) e dopo (R7) la sequenza bioattivo. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53589/53589fig2large.jpg" target="_blank">Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> Micro-onde sintesi utilizza irradiazione a microonde per riscaldare le reazioni, accelerando così chimico organico trasformazioni 40,41. Microonde chimica è basata sulla capacità del reagente / solvente per assorbire ilforno a microonde di energia e convertirla in calore 42. Prima che la tecnologia è diventata diffusa, grossi inconvenienti dovuti superare, compresa la controllabilità e la riproducibilità dei protocolli di sintesi e la mancanza di sistemi disponibili temperatura e di pressione adeguati controlli 43,44. La prima relazione di micro-onde sintesi peptidica è stato fatto utilizzando un forno a microonde cucina per sintetizzare diversi peptidi brevi (7-10 aminoacidi), con un significativo miglioramento della efficienza di accoppiamento e la purezza 45. Inoltre, l&#39;energia a microonde ha dimostrato di diminuire aggregazione catena, ridurre le reazioni collaterali, limitare racemizzazione, e migliorare i tassi di accoppiamento, che sono tutti critici per difficili e lunghe sequenze 46-53. Attualmente l&#39;uso di irradiazione con microonde per la sintesi di peptidi o composti correlati su un supporto solido è ampia, tra cui (a) Sintesi di acqua invece di solvente organico 54; (B) sintesi di peptidi concomuni modificazioni post-traduzionali, come glicopeptidi 55-58 o 59-61 phosphopeptides, la cui sintesi è tipicamente difficile a causa della bassa efficienza di accoppiamento di derivati ​​amminoacidici stericamente impediti; (C) sintesi di peptidi con modifica del backbone, come azapeptides, che possono essere costituiti dalla sostituzione del C (α) di un residuo amminoacidico con un atomo di azoto 62, o peptoids, la cui catena laterale è collegato al azoto ammidico piuttosto che l&#39;atomo Cα 63,64; (D) sintesi di peptidi ciclici 65-71; e (E) sintesi di librerie combinatoriali 51,72. In molti casi, gli autori hanno riportato una maggiore efficienza e ridotto tempo di sintesi usando irradiazione a microonde rispetto al protocollo convenzionale. Utilizzando un design razionale 73-75, abbiamo sviluppato peptidi anti-parassiti che sono stati ottenuti da recettore L del eishmania ponteggio FOattivato r C-chinasi (mancanza). MANCANZA svolge un ruolo importante nella fase precoce dell&#39;infezione Leishmania 76. Parassiti che esprimono bassi livelli di MANCANZA riescono a parassitare anche topi immunocompromessi 77 la mancanza è coinvolta nei processi parassita segnalazione essenziali e sintesi proteica 78. Pertanto, MANCANZA è una proteina impalcatura chiave 79 e un altro obiettivo prezioso. Concentrarsi sulle sequenze in MANCANZA che si conservano nei parassiti, ma non nel mammifero ospite omologo RACK, abbiamo identificato un peptide 8 aminoacidi (RNGQCQRK) che è diminuita di Leishmania sp. Vitalità nella cultura. Qui, descriviamo un protocollo per la sintesi di peptidi ciclici backbone derivati ​​dalla sequenza proteica LACK sopra descritta. I peptidi sono stati sintetizzati su un supporto solido mediante riscaldamento a microonde dalla metodologia SPPS con protocollo Fmoc / tBu. I peptidi sono stati coniugati ad un TAT 47-57 (YGRKKRRQRRR) carrier peptidico attraverso un legame ammidico comeparte del SPPS. Trasporti con sede a TAT di una varietà di carichi nelle cellule è stato utilizzato da oltre 15 anni e la consegna della merce in organuli subcellulari è stato confermato 80. Quattro differenti linker, succinico e anidride glutarica nonché adipico e acido pimelico, sono stati usati per eseguire la ciclizzazione di generare linkers acidi carbossilici da due a cinque atomi di carbonio. Ciclizzazione è stato fatto utilizzando l&#39;energia a microonde, e la scissione e della catena laterale fasi finali deprotezione sono stati fatti a mano, senza l&#39;energia a microonde. L&#39;uso di un sintetizzatore automatizzato microonde migliorato la purezza del prodotto, aumentato la resa del prodotto, e ha ridotto la durata della sintesi. Questo protocollo generale può essere applicato ad altri studi che utilizzano peptidi comprendere importante meccanismo molecolare in vitro e in vivo e sviluppare ulteriormente potenziali farmaci per malattie umane.

<table><tbody><tr><td>REAGENTS</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Solid support, resina Rink Amide AM ML</td><td>CBL</td><td>BR-1330</td><td>caricamento: 0,49 mmol/g</td></tr><tr><td>Fmoc-Ala-OH</td><td>Advanced Chemtech</td><td>FA2100</td><td></td></tr><tr><td>Fmoc-Arg(Pbf)-OH</td><td>Advanced Chemtech</td><td>FR2136</td><td></td></tr><tr><td>Fmoc-Asn(Trt)-OH</td><td>Advanced Chemtech</td><td>FN2152</td><td></td></tr><tr><td>Fmoc-Asp(OBut)-OH</td><td>Avanzato Chemtech</td><td>FD2192</td><td></td></tr><tr><td>Fmoc-Cys(Trt)-OH</td><td>Avanzato Chemtech</td><td>FC2214</td><td></td></tr><tr><td>Fmoc-Gln(Trt)-OH</td><td>Avanzato Chemtech</td><td>FQ2251</td><td></td></tr><tr><td>Fmoc-Glu(OtBu)-OH</td><td>Avanzato Chemtech</td><td>FE2237</td><td></td></tr><tr><td>Fmoc-Gly-OH</td><td>Avanzato Chemtech</td><td>FG2275</td><td></td></tr><tr><td>Fmoc-His(Trt)-OH</td><td>Avanzato Chemtech</td><td>FH2316</td><td></td></tr><tr><td>Fmoc-Ile-OH</td><td>Avanzato Chemtech</td><td>FI2326</td><td></td></tr><tr><td>Fmoc-Leu-OH</td><td>Avanzato Chemtech</td><td>FL2350</td><td></td></tr><tr><td>Fmoc-Lys(Boc)-OH</td><td>Avanzato Chemtech</td><td>FK2390</td><td></td></tr><tr><td>Fmoc-Met-OH</td><td>Avanzato Chemtech</td><td>FM2400</td><td></td></tr><tr><td>Fmoc-Phe-OH</td><td>Avanzato Chemtech</td><td>FF2425</td><td></td></tr><tr><td>Fmoc-Pro-OH</td><td>Chemtech avanzato</td><td>FP2450</td><td></td></tr><tr><td>Fmoc-Ser-(tBu)-OH</td><td>Chemtech avanzato</td><td>FS2476</td><td></td></tr><tr><td>Fmoc-Thr(tBu)-OH</td><td>Chemtech avanzato</td><td>FT2518</td><td></td></tr><tr><td>Fmoc-TRP(Boc)-OH</td><td>Chemtech avanzato</td><td>FW2527</td><td></td></tr><tr><td>Fmoc-Tyr(But)-OH</td><td>Chemtech avanzato</td><td>FY2563</td><td></td></tr><tr><td>Fmoc-Val-OH</td><td>Chemtech avanzato</td><td>FV2575</td><td></td></tr><tr><td>1-metil-2-pirrolidinone (NMP)</td><td>Sigma</td><td>328634</td><td><forte>Attenzione</forte> Tossico/Altamente infiammabile/Irritante.</td></tr><tr><td>N,N-Dimetilformammide (DMF)</td><td>Alfa Aesar</td><td>43465</td><td><forte>Attenzione</forte> Tossico. 
Utilizzare DMF di alta qualità per eliminare le reazioni collaterali come la rimozione di Fmoc a causa delle tracce di dimetilammina dalla decomposizione del DMF.</td></tr><tr><td>Diclorometano (DCM)</td><td>Sigma</td><td>D65100</td><td>Attenzione</td></tr><tr><td>Dibromometano nocivo (DBM)</td><td>Sigma</td><td>D41868</td><td>Caution Acido</td></tr><tr><td>trifluoroacetico nocivo (TFA)</td><td>Sigma</td><td>T62200<</td><td>strong>Caution Acido trifluoroacetico corrosivo/tossico</td></tr>, <tr><td>grado HPLC (TFA)</td><td>Sigma</td><td>91707</td><td><forte>Attenzione</forte> Dietilete corrosivo/tossico</td></tr><tr><td></td><td>Sigma</td><td>31690</td><td><forte>Attenzione</forte> Altamente infiammabile/Nocivo</td></tr><tr><td>Triisopropilsilano (TIS)</td><td>Sigma</td><td>233781</td><td><forte>Attenzione</forte> Acqua irritante/infiammabile</td></tr><tr><td>, grado HPLC</td><td>Sigma</td><td>270733</td><td></td></tr><tr><td>Acetonitroile, grado HPLC (ACN)</td><td>Fisher Scientifico</td><td>A998-4</td><td><forte>Attenzione</forte> Infiammabile/Irritante/Nocivo</td></tr><tr><td>N,N-Diisopropiletilamina (DIEA)</td><td>Sigma</td><td>3440</td><td><forte>Attenzione</forte> Corrosivo/Altamente infiammabile</td></tr><tr><td>Piperidina</td><td>Sigma</td><td>W290807</td><td><forte>Attenzione</forte> Tossico/Altamente infiammabile</td></tr><tr><td>Piridina</td><td>Sigma</td><td>270970</td><td><forte>Attenzione</forte> Altamente infiammabile/Dannoso</td></tr><tr><td>Etanolo (EtOH)</td><td>Sigma</td><td>459844</td><td><forte>Attenzione</forte> Altamente infiammabile/Irritante</td></tr><tr><td>1-Idrossibenzotriazolo idrato (HOBt)</td><td>Sigma</td><td>157260</td><td><forte>Attenzione</forte> Altamente infiammabile/Irritante/Nocivo</td></tr><tr><td>O-(Benzotriazol-1-il)-N,N,N&prime;,N&prime; - tetrametiluronio esafluorofosfato (HBTU)</td><td>Sigma</td><td>12804</td><td>Attenzione Irritante/Dannoso</td></tr><tr><td>Benzotriazole-1-ly-oxy-tris-pirrolidinophosphonium esafluorphosphate (PyBOP)</td><td>Advanced Chemtech</td><td>RC8602</td><td>Caution Irritante</td></tr><tr><td>Ninidrin</td><td>Sigma</td><td>454044</td><td>Attenzione</forte> Dannoso</td></tr><tr><td>Fenolo</td><td>Sigma</td><td>P3653</td><td><forte>Attenzione</forte> Corrosivo/Tossico</td></tr><tr><td>Cianuro di potassio (KCN)</td><td>Sigma</td><td>11813</td><td><forte>Attenzione</forte> Molto tossico</td></tr><tr><td>Idrossido di potassio (KOH)</td><td>Sigma</td><td>221473</td><td><forte>Attenzione</forte> Tossico</td></tr><tr><td>N,N' -Diisopropilcarbodiimmide (DIC)</td><td>Sigma</td><td>38370</td><td>Caution Infiammabile/ Tossico</td></tr><tr><td>4-Dimetilamminopiridina (DMAP)</td><td>Sigma</td><td>522805</td><td>Caution Tossico/Irritante</td></tr><tr><td>Anidride glutarica</td><td>Sigma</td><td>G3806</td><td>Caution Infiammabile/Irritante/Dannoso</td></tr><tr><td>Anidride succinica</td><td>Sigma</td><td>239690</td><td>Caution Irritante/Nocivo</td></tr><tr><td>Acido adipico</td><td>Sigma</td><td>A26357</td><td>Caution Tossico/Irritante</td></tr><tr><td>Acido pimelico</td><td>Sigma</td><td>P45001</td><td>Caution Toxic/Irritant</td></tr><tr><td>Chloranil</td><td>Sigma</td><td>23290</td><td>Caution Toxic/Irritant</td></tr><tr><td>Acetaldeide</td><td>Sigma</td><td>402788</td><td><forte>Attenzione</forte> Infiammabile/ Tossico</td></tr><tr><td><forte>ATTREZZATURA</forte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Centrifuga</td><td>Beckman Coltro</td><td>Allegra 6R Centrifuga</td><td></td></tr><tr><td>Liofilizzatore</td><td>Labconco</td><td>freezone 4.5</td><td></td></tr><tr><td>Pompa a vuoto</td><td>Franklin Electric</td><td>modello 1101101416 con 3/4 HP</td><td>Alcatel pompa con motore Franklin&nbsp;</td></tr><tr><td>Cartuccia in polipropilene 12 ml</td><td>Separazione applicata</td><td>2419</td><td></td></tr><tr><td>Tappo tappo per cartuccia in polipropilene da 12 ml</td><td>Separazione applicata</td><td>8157</td><td></td></tr><tr><td>Cartuccia in polipropilene 3 ml</td><td>Separazione applicata</td><td>2413</td><td></td></tr><tr><td>Tappo tappo per cartuccia in polipropilene da 3 ml</td><td>Separazione applicata</td><td>8054</td><td></td></tr><tr><td>Rubinetti di arresto PTFE</td><td>Separazione applicata</td><td>2406</td><td></td></tr><tr><td>Provette piatte, 50 ml</td><td>VWR</td><td>21008-240</td><td></td></tr><tr><td>Collettore di estrazione, 20 pos, 16 provette da 100 mm</td><td>Agitatore</td><td>WAT200609</td><td></td></tr><tr><td>Acque, BD adams Nutator mixer</td><td>Fisher scientific</td><td>22363152</td><td></td></tr><tr><td>Nalgene HDPE bocca stretta IP2 bottiglie, 125&nbsp; ml</td><td>Fisher scientific</td><td>03-312-8</td><td></td></tr><tr><td>Pallone di Erlenmeyer</td><td>Fisher Scientific</td><td>FB-501, 500 ml</td><td></td></tr><tr><td>Blocco riscaldante</td><td>Thermolyne</td><td>1760 dri bath Tubi</td><td></td></tr><tr><td>monouso in vetro borosilicato con estremità liscia</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-961-25</td><td></td></tr><tr><td>Micropipette e puntali Finnpipette</td><td>Thermo</td><td>20&ndash; 200 e 100 1.000 &mu; </td><td></td>l</tr><tr><td>Fiale HPLC - Micro VL PP 400 & Micro; l PK100&nbsp; &nbsp;</td><td>VWR</td><td>69400-124</td><td></td></tr><tr><td>Fiala HPLC - Tappo Snap-It Blu</td><td>VWR</td><td>66030-600</td><td></td></tr><tr><td>Colonna analitica HPLC</td><td>Peeke Scientific</td><td>U1-5C18Q-JJ</td><td>ultro 120 5 &; m C18Q, 4,6 mm ID 150 mm</td></tr><tr><td>Colonna HPLC di preparazione, XBridge&nbsp;</td><td>Acque</td><td>OBD C18 5 &; colonna m</td><td>19 mm & volte; 150 mm</td></tr><tr><td>Spettrometro di massa</td><td>Applied Biosystems</td><td>Voyager DE-RP&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Essiccatore</td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>per bombole</td><td></td><td></td><td></td>di azoto</tr><tr><td>Sistema analitico RP-HPLC Shimadzu LC-20</td><td></td><td></td><td>dotato di: controller di sistema CBM-20A, rivelatore SPD-20A, forno a colonna CTO-20A, 2 unità di erogazione solvente LC-20AD, autocampionatore SIL-20AC, degasatore DGU-20A5 (Shimadzu, MD, USA).</td></tr><tr><td>Sistema preparativo RP-HPLC Shimadzu LC-20</td><td></td><td></td><td>dotato di: controller di sistema CBM-20A, rivelatore SPD-20A, forno a colonna CTO-20A, 2 unità di erogazione solvente LC-6AD e collettore di frazioni FRC-10A (Shimadzu, MD, USA).</td></tr></tbody></table>

sviluppo di un backbone ciclico peptide biblioteca come potenziale antiparassitaria therapeutics uso microonde irradiazione

Development of a Backbone Cyclic Peptide Library as Potential Antiparasitic Therapeutics Using Microwave Irradiation

Interazioni proteina-proteina (PPI) sono intimamente coinvolti in quasi tutti i processi biologici e sono collegati a molte malattie umane. Pertanto, vi è un grande sforzo per PPI nella ricerca di base e del settore farmaceutico bersaglio. Interfacce proteina-proteina sono di solito grandi, piatti, e spesso non hanno le tasche, complicando la scoperta di piccole molecole che hanno come target tali siti. Approcci di targeting alternativi utilizzando anticorpi hanno delle limitazioni dovute alla scarsa biodisponibilità orale, a bassa permeabilità cellulare, e inefficienza della produzione. Utilizzo di peptidi per indirizzare le interfacce PPI ha diversi vantaggi. Peptidi hanno una maggiore flessibilità conformazionale, una maggiore selettività, e sono generalmente poco costoso. Tuttavia, i peptidi hanno i loro limiti, tra cui scarsa stabilità e inefficienza attraversare le membrane cellulari. Per superare tali limitazioni, peptide ciclizzazione può essere eseguita. Ciclizzazione ha dimostrato di migliorare la selettività peptide, Stabilità metabolica e biodisponibilità. Tuttavia, prevedere la conformazione bioattiva di un peptide ciclico non è banale. Per superare questa sfida, un attraente approccio a schermo una libreria mirato per schermo in cui tutti i peptidi ciclici backbone hanno la stessa sequenza primaria, ma si differenziano per i parametri che influenzano la loro conformazione, come la dimensione e la posizione dell&#39;anello. Descriviamo un protocollo dettagliato per la sintesi di una libreria di backbone peptidi ciclici mirati specifici PPI parassita. Utilizzando un approccio progettuale razionale, abbiamo sviluppato peptidi derivati ​​dalla proteina patibolo recettore L eishmania per C attivata-chinasi (mancanza). Abbiamo ipotizzato che le sequenze in MANCANZA che si conservano nei parassiti, ma non nel omologo mammifero ospite, possono rappresentare siti di interazione per le proteine ​​che sono fondamentali per la vitalità dei parassiti. I peptidi ciclici sono stati sintetizzati utilizzando irradiazione a microonde per ridurre i tempi di reazione e aumentareefficienza. Lo sviluppo di una libreria di backbone peptidi ciclici con misure degli anelli diversi facilita una schermata sistematica per la conformazione attiva più biologica. Questo metodo fornisce un modo generale, veloce e facile da sintetizzare peptidi ciclici.

Qui si descrive lo sviluppo di una piccola biblioteca mirata di backbone peptidi ciclici che colpiscono specificamente PPI vitali del parassita Leishmania e agiscono come agenti antiparassitari (per opinione su peptidi che colpiscono PPI come agenti antiparassitari 87). Attraverso la sintesi di nuovi backbone peptidi ciclici, farmacofori sono conservati in un ponteggio di dimensioni estensibile. La forza della biblioteca focalizzato qui proposto è la possibilità di variare le dimensioni peptide impal...

Viene delineato un metodo semplice e generale per la sintesi di peptidi ciclici utilizzando l'irradiazione a microonde. Questa procedura consente la sintesi di peptidi ciclici della spina dorsale con una raccolta di diverse conformazioni mantenendo le catene laterali e le frazioni farmacoforiche., e quindi, consente lo screening della conformazione bioattiva.

Sviluppo di un Backbone ciclico Peptide Biblioteca come potenziale Antiparassitaria Therapeutics Uso Microonde irradiazione

Protein-protein interactions (PPIs) are intimately involved in almost all biological processes and are linked to many human diseases. Therefore, there is ...

L'obiettivo generale di questa procedura è sviluppare una libreria mirata di peptidomimetici ciclici con diversità conformazionale, utilizzando l'irraggiamento a microonde per ottenere nuovi farmaci anti-parassitari. Questo metodo può aiutare a sviluppare nuovi strumenti per colpire in modo specifico le interazioni proteina-proteina. Per iniziare la procedura, aggiungere 2,5 millilitri dell'amminoacido desiderato, un millilitro di attivatore e 0,5 millilitri di base attivatrice a un cartuccia di polipropilene.Posizionare la cartuccia in un sintetizzatore a microonde automatico e lasciare avvenire la reazione di accoppiamento per 300 secondi a 25 watt e 75 gradi Celsius. Al termine della reazione, lavare la resina con sette millilitri di N,N-dimetilformammide, o DMF, per 120 secondi a temperatura ambiente. Dopo aver ripetuto il passaggio precedente cinque volte, aggiungere sette millilitri di piperidina al 20% in DMF con 0,1 molare di 1-idrossibenzotriazolo, o HOBt, alla cartuccia in polipropilene e incubare per 30 secondi a 45 watt e 75 gradi Celsius.Una volta terminata, scaricare la miscela di reazione. Successivamente, aggiungere sette millilitri di piperidina al 20% in DMF con 0,1 molarità di HOBt nella cartuccia di polipropilene e incubare per 180 secondi a 45 watt e 75 gradi Celsius. Dopo aver scaricato la miscela di reazione, lavare la resina con sette millilitri di DMF per 120 secondi a temperatura ambiente.Quindi, lavare la resina con sette millilitri di diclorometano, o DCM, per 120 secondi a temperatura ambiente. Per l'accoppiamento con anidride, lavare la resina con sette millilitri di 1-metil-2-pirrolidinone, o NMP, per 120 secondi a temperatura ambiente. Al termine, drenare la miscela di reazione.Dopo aver ripetuto il passaggio precedente tre volte, sciogliere 10 equivalenti dell'anidride corrispondente in cinque millilitri di NMP in un tubo di polipropilene da 50 millilitri. Quindi, aggiungere una equivalenza di 4-dimetilaminopiridina, o DMAP, e 10 equivalenti di N,N-diisopropiletilammina, o DIEA, alla soluzione. Aggiungere questa miscela alla resina e incubare per 300 secondi a 25 watt e 75 gradi Celsius.Dopo aver lavato la resina con NMP, lavarla con sette millilitri di DMF per 120 secondi a temperatura ambiente. A questo punto, trasferire la resina in una cartuccia di polipropilene dotata di tappo a capsula e rubinetto. Una volta che la resina è stata lavata con DCM, aggiungere 15-25 millilitri di una miscela costituita da 1% di acido trifluoroacetico, 5% di triisopropilsilano e 94% di DCM per ogni grammo di resina alla cartuccia di polipropilene.Posizionare la cartuccia in polipropilene su un agitatore e agitare per cinque minuti a temperatura ambiente. Successivamente, rimuovere la soluzione dalla cartuccia in polipropilene applicando un vuoto. Dopo aver ripetuto questi passaggi per tre volte, lavare la resina con sette millilitri di DCM per 120 secondi a temperatura ambiente.Questi passaggi sono estremamente importanti, poiché si è osservato che i gruppi protettivi tritilici in diverse resine vengono scissi parzialmente in soluzioni di acido trifluoroacetico in DCM. La rimozione dei gruppi metiltritilici è un processo lento che richiede numerosi lavaggi. In un tubo in polipropilene da 50 millilitri, sciogliere cinque equivalenti di Benzotriazolo-1-ilo-ossi-tris-pirrolidinofosfonio esafluorofosfato in cinque millilitri di dibromometano.Quindi, aggiungere 10 equivalenti di DIEA alla soluzione. Aggiungere la miscela alla resina risciacquata con DCM e incubare per 300 secondi a 25 watt e 75 gradi Celsius. Successivamente, lavare la resina con sette millilitri di DCM per 120 secondi a temperatura ambiente.Dopo due lavaggi con DCM, trasferire la resina in una cartuccia di polipropilene e lavare due volte con etere dietilico. Asciugare la resina in un desiccante sotto vuoto a temperatura ambiente per almeno tre ore su idrossido di potassio. Successivamente, aggiungere 10 millilitri di un cocktail di scissione con acido trifluoroacetico pre-raffreddato per ogni grammo di resina.Posizionare il cartuccio in polipropilene su un agitatore e agitare per 3 ore a temperatura ambiente. Successivamente, raccogliere la soluzione di scissione filtrando la resina in un tubo in polipropilene da 50 millilitri. Aggiungere 35 millilitri di etere dietilico freddo al tubo.Centrifugare per cinque minuti a 1.207 ×g a quattro gradi Celsius. Quindi, decantare lo strato di etere. Per il test di Kaiser, preparare la Soluzione A sciogliendo 16,5 milligrammi di cianuro di potassio in 25 millilitri di acqua distillata.Diluire un millilitro della soluzione con 49 millilitri di peridina. Successivamente, preparare la Soluzione B sciogliendo un grammo di ninidrina in 20 millilitri di etanolo. Preparare la Soluzione C sciogliendo 40 grammi di fenolo in 20 millilitri di etanolo.Dopo aver preparato le soluzioni, trasferire alcuni granuli dalla resina in un tubo da prova. Aggiungere tre gocce di ciascuna soluzione al tubo e mescolare. Infine, riscaldare il tubo da prova su un blocco riscaldante a 110 gradi Celsius per cinque minuti.La sintesi dei peptidi ciclici a schiena dorsale è stata eseguita utilizzando un sintetizzatore a microonde automatico su supporto solido, seguendo il protocollo FMOC e t-butile. Il prodotto è stato analizzato mediante spettrometria di massa e il suo grado di purezza è stato determinato mediante HPLC. Il test biologico ha mostrato che il peptide pL1 è attivo contro Leishmania donovani, un parassita responsabile della leishmaniosi viscerale, la forma più grave di leishmaniosi nell'uomo.Il peptide pL1 ha ridotto la vitalità del parassita del 75% rispetto al trattamento di controllo. Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere eseguita in tre-cinque giorni se effettuata correttamente. Dopo il suo sviluppo, questa tecnica ha aperto la strada a ricercatori in una vasta gamma di settori per esplorare i peptidi come regolatori farmacologici nella ricerca di base e nelle terapie.Dopo aver visto questo video, si dovrebbe avere una buona comprensione di come sviluppare una libreria mirata di peptidomimetici con diversità conformazionale per colpire in modo specifico le interazioni proteina-proteina. Non dimenticare che lavorare con acido trifluoroacetico può essere estremamente pericoloso e che è sempre necessario adottare precauzioni, come indossare protezioni per gli occhi, camice da laboratorio e guanti, lavorando all'interno di una cappa ben ventilata durante l'esecuzione di questa procedura.

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Il seguente protocollo fornisce tecniche per l'incapsulamento pancreatiche β-cellule in fase di crescita PEG-peptide idrogel formati da tiolo-ene foto-click reazioni. Questa piattaforma materiale non solo offre un microambiente cytocompatible per l'incapsulamento delle cellule, ma anche controllato dall'utente consente un rapido recupero delle strutture cellulari formano all'interno dei idrogel.

Generazione e recupero dei β-cellule Spheroids dal passaggio di crescita PEG-peptide idrogel

Questo video illustrerà un metodo rapido e efficiente per metacrilato poli (glicole etilenico), consentendo polimerizzazioni a catena e sintesi idrogel. Si dimostrerà come introdurre in modo simile funzionalità metacrilammide in peptidi, dettaglio metodi analitici comuni per valutare l'efficienza funzionalizzazione, fornire suggerimenti per la risoluzione dei problemi e le modifiche avanzate, e dimostrare le tecniche tipiche di caratterizzazione idrogel.

Forno a microonde assistita Funzionalizzazione di poli (etilene glicole) e On-resina Peptidi per l&#39;uso a polimerizzazione a catena ed idrogel Formazione

Peptide ammidi terziarie (PTA) sono una superfamiglia di peptidomimetici che includono ma non sono limitate a peptidi, peptoids e peptidi N-metilato. Qui si descrive un metodo sintetico che combina split-e-pool e le strategie sub-monomeri per sintetizzare un one-tallone biblioteca un composto di PTA.

Split-e-pool Sintesi e caratterizzazione di peptidi Terziario Ammide Biblioteca

Viene presentato un protocollo per sintetizzare peptoidi con funzionalità cationica mista nella stessa sequenza (monomeri di tipo lisina e arginina). Viene anche descritto il successivo test di questi composti contro la Leishmania mexicana, i protozoi parassiti che causano la leishmaniosi cutanea.

Un metodo efficiente per la sintesi di peptoids con monomeri misto Lisina-tipo / Arginina-tipo e valutazione della loro attività anti-Leishmania

Il protocollo presenta l' Escherichia coli-base pressione selettiva incorporazione degli aminoacidi non canonico (ncAAs) il lactococcal peptide antimicrobico nisina. Le proprietà possono essere modificate durante l'espressione ricombinante tramite sostituzione con ncAAs desiderata in media di sviluppo definito. Conseguenti variazioni bioattività sono mappati da saggi di inibizione di crescita e microscopia a fluorescenza.

Peptidi antimicrobici prodotte dalla pressione selettiva incorporazione di aminoacidi Non canonico

Questo protocollo presenta la sintesi di peptidi ciclici tramite bisalchilazione tra cisteina e metionina e la facile reazione tiolo-yne innescata dal centro del propargil sulfinfo.

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Costruzione di peptidi ciclici che penetrano nelle cellule per una maggiore penetrazione delle barriere biologiche

Il lievito di fissione viene utilizzato qui come ospite eterologo per esprimere proteine citoscheletriche batteriche come FtsZ e MreB come proteine di fusione traduzionali con GFP per visualizzare la loro polimerizzazione. Inoltre, i composti che influenzano la polimerizzazione vengono identificati mediante imaging utilizzando un microscopio a fluorescenza.

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Viene presentato un apparecchio semplice, economico e innovativo per l'esecuzione di sintesi di peptidi in fase solida in un reattore a microonde commerciale.

Un adattamento economico di un reattore a microonde commerciale per la sintesi di peptidi in fase solida

Questo protocollo descrive un metodo per produrre e valutare l'attività antimicrobica e la citotossicità del peptide cationico Mel4 e del mimetico dei peptidi RK758. Integrando sintesi chimica, espressione ricombinante e saghi funzionali standardizzati, fornisce un flusso di lavoro semplificato per la produzione e il test di peptidi e mimetici di piccole molecole.

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Scopri la sintesi di peptidi ciclici mediante irradiazione a microonde per lo sviluppo di nuovi farmaci antiparassitari. Questo metodo consente di creare librerie con diversità conformazionale e targeting di interazioni proteina-proteina.

Sviluppo di un Backbone ciclico Peptide Biblioteca come potenziale Antiparassitaria Therapeutics Uso Microonde irradiazione

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