Sviluppo di un Backbone ciclico Peptide Biblioteca come potenziale Antiparassitaria Therapeutics Uso Microonde irradiazione

L'obiettivo generale di questa procedura è quello di sviluppare una libreria peptidomimetica ciclica focalizzata sulla spina dorsale con diversità conformazionale utilizzando l'irradiazione a microonde per nuove terapie antiparassitarie. Questo metodo può aiutare a sviluppare nuovi strumenti per mirare in modo specifico alle interazioni proteina-proteina. Per iniziare questa procedura, aggiungere 2,5 millilitri dell'aminoacido desiderato, un millilitro di attivatore e 0,5 millilitri di base attivatore a una cartuccia di polipropilene.

Posizionare la cartuccia in un sintetizzatore a microonde automatizzato e lasciare che la reazione di accoppiamento proceda per 300 secondi a 25 watt e 75 gradi Celsius. Una volta completata la reazione, lavare la resina con sette millilitri di N, N-dimetilformammide o DMF, per 120 secondi a temperatura ambiente. Dopo aver ripetuto il passaggio precedente cinque volte, aggiungere sette millilitri di piperidina al 20% in DMF con 0,1 molari di 1-idrossibenzotriazolo, o HOBt, alla cartuccia di polipropilene e incubare per 30 secondi a 45 watt e 75 gradi Celsius.

Al termine, scolare la miscela di reazione. Successivamente, aggiungere sette millilitri di piperidina al 20% in DMF con 0,1 HOBt molare alla cartuccia di polipropilene e incubare per 180 secondi a 45 watt e 75 gradi Celsius. Dopo aver drenato la miscela di reazione, lavare la resina con sette millilitri di DMF per 120 secondi a temperatura ambiente.

Quindi, lavare la resina con sette millilitri di diclorometano, o DCM, per 120 secondi a temperatura ambiente. Per l'accoppiamento dell'anidride lavare la resina con sette millilitri di 1-metil-2-pirrolidinone, o NMP, per 120 secondi a temperatura ambiente. Al termine, scolare la miscela di reazione.

Dopo aver ripetuto il passaggio precedente tre volte, sciogliere 10 equivalenti dell'anidride corrispondente in cinque millilitri di NMP in una provetta di polipropilene da 50 millilitri. Quindi, aggiungere alla soluzione un equivalente di 4-dimetilamminopiridina, o DMAP, e 10 equivalenti di N, N-diisopropiletilamina, o DIEA. Aggiungere questa miscela alla resina e incubare per 300 secondi a 25 watt e 75 gradi Celsius.

Dopo aver lavato la resina con NMP, lavarla con sette millilitri di DMF per 120 secondi a temperatura ambiente. A questo punto, trasferire la resina in una cartuccia di polipropilene dotata di tappo, tappo e rubinetto. Una volta che la resina è stata lavata con DCM, aggiungere da 15 a 25 millilitri di una miscela di acido trifluoroacetico all'1%, triisopropilsilano al 5% e DCM al 94% alla cartuccia di polipropilene per 1 grammo di resina.

Posizionare la cartuccia di polipropilene su uno shaker e agitare per cinque minuti a temperatura ambiente. Successivamente, scolare la soluzione dalla cartuccia di polipropilene applicando il vuoto. Dopo aver ripetuto i passaggi precedenti tre volte, lavare la resina con sette millilitri di DCM per 120 secondi a temperatura ambiente.

Questi passaggi sono molto importanti, poiché i gruppi protettivi tritilici in diverse resine sono parzialmente scissi nelle soluzioni di acido trifluoroacetico DCM. La rimozione dei gruppi metiltritile è un processo lento che richiede più lavaggi. In una provetta di polipropilene da 50 millilitri, sciogliere cinque equivalenti di benzotriazolo-1-ly-oxy-tris-pirrolidinofosphonium esafluorphosphate in cinque millilitri di dibromometano.

Quindi, aggiungere 10 equivalenti di DIEA alla soluzione. Aggiungere la miscela alla resina risciacquata con DCM e incubare per 300 secondi a 25 watt e 75 gradi Celsius. Successivamente, lavare la resina con sette millilitri di DCM per 120 secondi a temperatura ambiente.

Dopo due lavaggi con DCM, trasferire la resina in una cartuccia di polipropilene e lavare due volte con etere etilico. Asciugare la resina in un essiccatore sottovuoto a temperatura ambiente per almeno tre ore su idrossido di potassio. Quindi, aggiungi 10 millilitri di un cocktail di scissione dell'acido trifluoroacetico pre-raffreddato a ogni grammo di resina.

Posizionare la cartuccia di polipropilene su uno shaker e agitare per 3 ore a temperatura ambiente. Successivamente, raccogliere la soluzione di scissione filtrando la resina in un tubo di polipropilene da 50 millilitri. Aggiungere 35 millilitri di etere etilico freddo al tubo.

Centrifugare per cinque minuti a 1,207 volte g a quattro gradi Celsius. Quindi, decantare lo strato di etere. Per il test di Kaiser, preparare la Soluzione A sciogliendo 16,5 milligrammi di cianuro di potassio in 25 millilitri di acqua distillata.

Diluire un millilitro della soluzione con 49 millilitri di peridina. Successivamente, preparare la soluzione B sciogliendo un grammo di ninidrina in 20 millilitri di etanolo. Preparare la Soluzione C sciogliendo 40 grammi di fenolo in 20 millilitri di etanolo.

Dopo che le soluzioni sono state preparate, trasferire alcune perline dalla resina in una provetta. Aggiungere tre gocce di ciascuna soluzione al tubo e mescolare. Infine, riscalda la provetta su un blocco riscaldante a 110 gradi Celsius per cinque minuti.

La sintesi dei peptidi ciclici della spina dorsale è stata eseguita utilizzando un sintetizzatore a microonde automatizzato su supporto solido seguendo il protocollo FMOC, t-butile. Il prodotto è stato analizzato mediante spettrometria di massa e il suo grado di purezza è stato determinato mediante HPLC. Lo screening biologico ha dimostrato che il peptide pL1 era attivo contro la Leishmania donovani, un parassita che causa la leishmaniosi viscerale, la leishmaniosi più grave nell'uomo.

Il peptide pL1 ha ridotto la vitalità del parassita del 75% rispetto al trattamento di controllo. Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere eseguita in tre o cinque giorni se eseguita correttamente. Dopo il suo sviluppo, questa tecnica ha aperto la strada ai ricercatori in una vasta gamma di campi per esplorare i peptidi come regolatori farmacologici nella ricerca di base e nella terapia.

Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come sviluppare una libreria focalizzata di peptidomimetici con diversità conformazionale per mirare specificamente alle interazioni proteina-proteina. Non dimenticare che lavorare con l'acido trifluoroacetico può essere estremamente pericoloso e che durante l'esecuzione di questa procedura dovrebbero essere sempre prese precauzioni come indossare una protezione per gli occhi, un camice da laboratorio e guanti mentre si lavora in un cappuccio ben ventilato.