Un metodo efficiente per la sintesi di peptoids con monomeri misto Lisina-tipo / Arginina-tipo e valutazione della loro attività anti-Leishmania

L'obiettivo generale di questa procedura è quello di introdurre monomeri di tipo lisina e arginina all'interno della stessa sequenza peptoide e di valutare l'attività di questi composti contro Leishmania mexicana, i parassiti causali della malattia tropicale trascurata, la leishmaniosi cutanea. Sono urgentemente necessarie nuove terapie per la leishmaniosi cutanea e questa procedura può aiutare a identificare e sviluppare i peptoidi come una nuova classe di potenziali antinfettivi per questa malattia tropicale trascurata. Il vantaggio principale di questo protocollo è che possono essere sintetizzati peptoidi che contengono funzionalità cationiche miste.

Questo è altamente desiderabile in quanto può aiutare a modulare le attività biologiche delle sequenze. Sebbene questo test contro la forma mammifera del parassita, può anche essere utilizzato contro lo stadio di insetto di Leishmania mexicana o applicato a linee cellulari di mammiferi. La dimostrazione visiva di questo metodo è davvero utile perché mostra la natura graduale della sintesi e anche la coltura del parassita in vari punti del ciclo di vita di Leishmania mexicana.

Per iniziare questa procedura preparare le soluzioni in dimetilformammide come indicato nel protocollo di testo. Quindi, aggiungere 0,1 millimoli di resina ammidica di pista protetta da Fmoc a un recipiente di reazione in polipropilene da 20 millilitri tappato con due fritte. Aggiungere cinque millilitri di dimetilformammide e lasciare riposare il recipiente per 60 minuti a temperatura ambiente.

Quindi, svuotare il DMF utilizzando una piattaforma per vuoto di estrazione in fase solida. Quindi, aggiungi due millilitri di soluzione di piperidina preparata. Posizionare il recipiente su una piattaforma di agitazione a 450 giri/min a temperatura ambiente e agitare per cinque minuti.

Drenare la soluzione utilizzando la stazione a vuoto. Quindi, aggiungere due millilitri di soluzione di piperidina e agitare alle stesse condizioni per 15 minuti. Al termine dell'agitazione, drenare la soluzione tramite una stazione a vuoto.

Aggiungere due millilitri di DMF e mescolare per 30 secondi per lavare la resina. Scolare il DMF e ripetere il lavaggio tre volte. Per iniziare la sintesi del submonomero, aggiungere un millilitro di soluzione di acido bromoacetico preparata e 0,2 millilitri di soluzione DIC preparata.

Agitare per 20 minuti a temperatura ambiente. Quindi, scolare la soluzione e lavare tre volte utilizzando due millilitri di DMF ogni volta. Aggiungere un millilitro di soluzione amminica preparata.

Quindi, agitare la resina per 60 minuti a temperatura ambiente. Scolare la soluzione e lavare la resina tre volte utilizzando due millilitri di DMF ogni volta. Quindi, aggiungere un millilitro di soluzione di acido bromoacetico e 0,2 millilitri di soluzione DIC.

Agitare per 20 minuti a temperatura ambiente. Quindi, scolare la soluzione e lavare tre volte utilizzando due millilitri di DMF ogni volta. Per introdurre un monomero funzionalizzato con guanidina, aggiungere alla resina un millilitro di soluzione di diammina non protetta.

Agitare per 60 minuti a temperatura ambiente. Quindi, scolare la soluzione e lavare la resina con due millilitri di DMF per tre volte. Aggiungere 0,5 millilitri di soluzione preparata di 2-acetil dimedone.

Agitare per 60 minuti a temperatura ambiente. Quindi, scolare la soluzione e lavare la resina con due millilitri di DMF per tre volte. Continuare la sintesi del submonomero fino a quando non viene effettuata la sequenza desiderata.

Quindi, aggiungere quattro millilitri di soluzione di idrazina preparata e agitare per tre minuti a temperatura ambiente. Scolare la soluzione e ripetere tre volte. Quindi, lavare la resina tre volte utilizzando due millilitri di DMF per ogni lavaggio.

Aggiungere DIPEA e sei equivalenti di pirazolo-1-carbossamidina per ammina libera nella sequenza peptoide. Agitare per 60 minuti a temperatura ambiente. Al termine dell'agitazione, scolare la soluzione.

Lavare la resina tre volte utilizzando due millilitri di diclorometano per ogni lavaggio. Asciugare la resina all'aria per 10 minuti e conservarla per un uso futuro. Dopo l'aggiunta di ammina può essere eseguita una scissione di prova per verificare il progresso della sintesi.

Per iniziare la scissione finale, aggiungere quattro millilitri di cocktail di scissione alla stessa cartuccia di reazione fritta utilizzata per la sintesi e coprire il recipiente. Agitare per 90 minuti a temperatura ambiente. Quindi, utilizzando il recipiente di reazione fritto, filtrare il cocktail di scissione dalla resina in un pallone a fondo tondo.

Far evaporare il cocktail di scissione utilizzando un evaporatore rotante. Aggiungere due millilitri di etere etilico anidro per far precipitare il peptoide. Utilizzando una pipetta, rimuovere l'etere etilico e gettarlo.

Quindi, ripetere la precipitazione dell'etere etilico tre volte. Una volta completata la precipitazione, sciogliere il peptoide grezzo in 10 millilitri di acetonitrile preparato e soluzione acquosa acidificata. Trasferire in un contenitore pre-pesato.

Quindi, congelare a meno 20 gradi Celsius e liofilizzare fino a ottenere una polvere secca pronta per la purificazione mediante HPLC in fase inversa. Dopo aver coltivato i parassiti Leishmania mexicana e la trasformazione allo stadio di amastigote axenico, iniziare il test di citotossicità preparando soluzioni madre composte come indicato nel protocollo di testo. Aggiungere due microlitri di soluzione madre di peptoidi da cinque millimolari, il controllo dell'amfotericina B e il controllo DMSO alla riga superiore di una piastra a 96 pozzetti, come indicato nel protocollo di testo.

Utilizzando una pipetta multicanale, aggiungere 48 microlitri di terreno fresco alla fila superiore. Aggiungere 25 microlitri di terreno fresco a tutte le altre file. Successivamente, eseguire una diluizione seriale pipettando 25 microlitri di soluzione dalla riga superiore, aggiungendola alla riga sottostante e mescolando.

Ripetere le diluizioni per l'intera piastra scartando gli ultimi 25 microlitri pipettati dalla fila inferiore. Quindi, trasferire una coltura di parassiti in una provetta da centrifuga da 50 millilitri. Centrifugare per cinque minuti a 447 volte g.

Versare il vecchio terreno e aggiungere 10 millilitri di terreno fresco. Quindi, utilizzando una pipetta, risospendere delicatamente il pellet di parassiti nel nuovo terreno. Contare utilizzando un emocitometro migliorato Neubauer e diluire la coltura a otto milioni di parassiti per millilitro.

Dopo che la coltura è stata diluita, aggiungere 25 microlitri di parassiti a ciascun pozzetto. Incubare la piastra per 60 minuti a 32 gradi Celsius. Una volta completata l'incubazione, rimuovere 40 microlitri di soluzione da ciascun pozzetto.

Aggiungere 90 microlitri di terreno fresco in ogni pozzetto e incubare a 32 gradi Celsius per 24 ore. Quindi, aggiungere 10 microlitri di soluzione di vitalità cellulare a base di resazurina in ciascun pozzetto. Incubare a 32 gradi Celsius per quattro ore.

Al termine dell'incubazione, utilizzare un lettore di piastre per misurare la fluorescenza. Analizzare i dati rimuovendo il fondo medio e confrontando la fluorescenza dei pozzetti dopo la normalizzazione con la resezione con i controlli DMSO. In questo studio, due peptoidi sono sintetizzati utilizzando 120 milligrammi di resina ammidica di pista ciascuno.

I prodotti vengono purificati mediante cromatografia liquida ad alta pressione in fase inversa e le frazioni corrispondenti alla massa target vengono combinate e ottenute sotto forma di polveri bianche. La quantità raccolta per i due peptoidi è mostrata qui con rese di circa il 30% per frazioni di purezza superiore al 90%. La purezza del prodotto viene valutata utilizzando un'HPLC analitica in fase inversa e visualizzata, a 220 nanometri, l'assorbanza della spina dorsale dell'ammide.

Entrambi i peptoidi sono considerati omogenei. I risultati rappresentativi dei test di citotossicità contro L Mexicana sono mostrati qui. Le soluzioni stock da cinque millimolari dei composti sono realizzate in DMSO di grado per colture cellulari e testate in triplicati almeno due volte per garantire dati robusti.

Si può vedere che il peptoide B è più efficace del peptoide A nel ridurre la percentuale di parassiti vitali ed entrambi hanno un effetto dose-dipendente. Dopo aver osservato questo metodo, dovresti avere una buona comprensione di come sintetizzare, caratterizzare e purificare peptoidi che contengono sia monomeri di tipo lisina che di tipo arginina e come utilizzarli nei test di citotossicità contro Leishmania mexicana. Il nostro metodo per aggiungere la doppia funzionalità cationica ai peptoidi aggiunge solo un semplice passaggio in più al metodo di sintesi dei peptoidi comunemente usato come submonomero.

Seguendo questo metodo, è possibile aggiungere submonomeri di tipo lisina o arginina di diverse lunghezze per aumentare la diversità delle librerie, ad esempio con catene laterali di lunghezza compresa tra due e sei atomi di carbonio. Durante il tentativo di sintesi dei peptoidi, è molto importante ricordarsi di lavare bene la resina tra un passaggio e l'altro per evitare l'aggiunta o la cancellazione indesiderata di prodotti. Questo metodo apre la strada ai ricercatori per esplorare l'attività biologica di peptoidi misti funzionalizzati cationicamente e per confrontare questa attività con quelli che contengono esclusivamente monomeri di tipo lisina o arginina.

Infine, non dimenticare che i parassiti e molti dei reagenti utilizzati in questo protocollo possono essere estremamente pericolosi. Pertanto, è importante utilizzare sempre dispositivi di protezione individuale adeguati e lavorare all'interno di una cappa aspirante o di una cabina di sicurezza microbiologica, se del caso.