Name: Isolamento e la coltura delle cellule della cresta neurale da Embryonic Murine tubo neurale (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-06-02T14:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 48 s
Description: Impara a isolare e coltivare cellule della cresta neurale da embrioni murini con questo protocollo efficiente. Ottieni popolazioni pure al 96% senza FACS per studiare biologia dello sviluppo e neurobiologia in vitro.

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Vorremmo riconoscere Marc Wozniak per l&#39;assistenza video. Vorremmo inoltre ringraziare Sean Morrison del Southwestern per il protocollo originale per la coltura di cellule di ratto NC. Questo lavoro è stato supportato Vanderbilt University Medical Support programma Academic Center e da sovvenzioni da parte del NIH (HD36720 e HD036720-11S109) e il 11GRNT7690040 AHA a PAL, borse predoctoral della AHA (0615209B) e NIH (NS065604) a NAM, e ERP è stato sostenuta da una sovvenzione del NIH di formazione T32HD007502.

1. Preparazione Piastre <ol><li> Utilizzare la tecnica sterile in ogni momento. </li><li> Preparare fibronectina (FN) diluendo 100 pl di plasma umano archivio di FN in un volume finale di 3,3 ml in PBS di Dulbecco (DPBS). Concentrazione finale è di 30 ug / ml e questo può essere conservato a 4 ° C per 1 settimana. </li><li> Coprire fondo di ciascun pozzetto di una sterile coltura tissutale quattro piastre con soluzione FN e lasciate riposare per 15 minuti. Assicurarsi che l&#39;intera superficie è coperta. Assicurarsi che il supporto durante questo periodo (punti 2 e 3). </li><li> Rimuovere FN soluzione e consentire piastre asciugare. Lavare delicatamente i pozzetti con 500 microlitri DMEM, rimuovere DMEM, e aggiungere 500 microlitri di auto-rinnovamento (SR) medio (vedi sotto). Incubare a 37 ° C in un incubatore umidificato contenente il 5 percento CO 2. Completa questo circa un&#39;ora prima della dissezione in modo che le piastre saranno asciutti prima dell&#39;uso. </li></ol> 2. Preparazione Medio SR <ol><li> Per la cultura della vagale e del tronco NCda dieci embrioni (circa una cucciolata, a seconda del background genetico della linea di mouse), preparare 25 mL di mezzo di SR. Combina 12,5 mL bassa di glucosio DMEM, 7,5 ml di mezzo Neurobasal, 25 microlitri di acido retinoico (117 uM concentrazione finale), e 25 pl 2-mercaptoetanolo (50 mM di concentrazione finale). Mescolare bene. </li><li> Aggiungere 3,75 ml di estratto di Chick Embryo, 250 microlitri N 2 supplemento di sale, 500 microlitri B27 supplemento e 250 microlitri di penicillina-streptomicina (1% concentrazione finale). Filtrare il mezzo attraverso un filtro 0,22 micron. </li><li> Aggiungere 10 L IGF1 sterile (20 ug / ml concentrazione finale) e 20 pl bFGF sterile (20 ug / ml concentrazione finale). Miscelare per inversione. Conservare a 4 ° C. </li></ol> 3. Preparazione Media Wash <ol><li> Per circa 10 embrioni preparare 50 ml di mezzo di lavaggio. Combinare 50 mg BSA con 35 mL di glucosio DMEM bassa, 15 ml di mezzo Neurobasal, e 500 pl penicillina-streptomicina (1% concentrazione finale). Filtro sterile con 0,22Filtro um. </li></ol> 4. Preparazione Collagenasi / dispasi <ol><li> Aggiungere 50 pl di 100 mg / ml di collagenasi / dispasi a 5 ml DPBS. Mescolare bene. </li><li> Siringa filtro da 0,2 um filtrare e aggiungere 1,5 ml in ciascuna delle tre pozzetti di una piastra ben dodici. Pipettare circa 1 ml di mezzo di lavaggio nei pozzetti rimanenti. Conservare intera piastra sul ghiaccio fino al momento di digerire il tessuto sezionato. </li><li> Tagliare punte di una punta P20 e P1000 pipetta filtro con una lama di rasoio sterile. Tagliare appena sotto il bordo smussato della punta. Il cut off p1000 saranno utilizzati per trasferire l&#39;embrione, mentre tutta la p20 verrà utilizzato per trasferire i pezzi di tessuto isolato. </li></ol> 5. Isolamento vagale e Tube Trunk Neural da 9,5 embrioni DPC <ol><li> Per le gravidanze temporizzati, dighe con un tappo vaginale sono considerati 0,5 dpc a mezzogiorno del mattino la spina si osserva. Sacrificio e rimuovere l&#39;utero a 9,5 DPC. </li><li> Rimuovere la decidua dall&#39;utero e delicatamente rTogliete l&#39;embrione dalla decidua. Una volta sperimentato con questo protocollo, isolare 3-4 9.5 embrioni DPC in un momento in DPBS sterili. Utilizzare la tecnica sterile e strumenti di dissezione sterilizzati. Gli strumenti possono essere sterilizzati in autoclave, sterilizzazione a calore o di incubazione in etanolo. </li><li> Per vagale anteriore NC: usando aghi da insulina, tagliare il tubo neurale alla placode metà otic. Tagliare di nuovo al margine posteriore del somite 4 °. Tagliare il tessuto ventrale del tubo neurale per rimuovere gli archi faringei e il cuore. </li><li> Per NC tronco: usando aghi da insulina, rimuovere la parte del tubo neurale tra 16-22 somiti (o l&#39;ultimo somite, se gli embrioni sono evolutivamente anteriore a quella fase di 22 somite). </li><li> Tenere il sacco vitellino e qualsiasi tessuto embrionale residuo per la genotipizzazione. </li></ol> 6. Rimozione di non-neurale ectoderma e mesoderma <ol><li> Porre tubo neurale contenente segmenti in collagenasi / dispasi a temperatura ambiente per 10 minutis. Lavare immediatamente in mezzo lavaggio. </li><li> Ritorna tessuto DPBS sterili. Utilizzo di aghi da insulina sterile, rimuovere delicatamente il non-neurale ectoderma dal tessuto e separare i somiti lontano dal tubo neurale. Le parti restanti del ultime mesoderma dal tessuto somite può essere rimosso triturando delicatamente con un cut-down p20 punta. Fare attenzione a non danneggiare il tubo neurale. Osservare attentamente la situazione durante la triturazione. </li><li> Posizionare il tubo neurale attraverso isolato un secondo e il terzo lavaggio a 30 secondo di media lavaggio. </li><li> Risciacquare una volta in mezzo SR, e posizionare il tubo isolato neurale nel centro di un FN rivestita bene che è stato preparato precedentemente (Fase 1,3). Umidificare la camera di ipossia con un piatto di acqua sterile. Porre la capsula nella camera di ipossia e lavare la camera con gas miscelato al 3% O 2 (utilizzare un serbatoio contenente una miscela di 1% O 2, 6% CO 2, 93% N 2). </li><li> Maneggiare sempre la camera con estrema attenzione per garantire that espianti sono indisturbati e rimangono nel centro dei pozzetti. </li><li> Incubare a 37 ° C. Sintesi dei passaggi 5-6 è mostrato in Figura 1. </li></ol> 7. La rimozione del tubo neurale <ol><li> Dopo 24 ore di incubazione, rimuovere il tubo neurale delicatamente stuzzicando il bordo del tubo neurale lontano dalle cellule migranti usando un ago sterile di insulina. Rimuovere e gettare il tubo neurale dal mezzo mediante taglio sterile p20 come nel passaggio 6,2 e sostituire il mezzo con mezzo fresco SR (Figura 2). Questo viene fatto più facilmente utilizzando un microscopio invertito. </li></ol> 8. Risultati rappresentativi Dopo 24 ore di incubazione a 37 ° C in condizioni di ipossia, celle NC siano trasferite dal tubo neurale in una popolazione quasi puro (Figura 3a). A volte, meno di culture, ideali non produrrà escrescenze robuste. Ad esempio, è possibile che dopo 24 ore tegli tubo neurale avrà arrotolato su se stessa e il CN non si allontanino dal tubo neurale (Figura 3b). Di tanto in tanto il tubo neurale non si attaccano alle piastre rivestite fibronectina. Nella nostra esperienza, sub-ottimale la migrazione NC o problemi con il collegamento del tubo neurale può essere influenzato negativamente da condizioni normossia o concentrazione della fibronectina, rispettivamente. L&#39;attività enzimatica della collagenasi / dispasi varia leggermente per partita e tempo di digestione deve essere opportunamente regolata, tuttavia, non digerire il tessuto più di quindici minuti. Overdigestion del tubo neurale in tessuto contenente collagenasi / dispasi comporterà anche escrescenze carenti. Se il tessuto somite non viene facilmente rimosso dal tubo neurale dopo incubazione in collagenasi / dispasi, il tubo neurale può essere incubate per più di dieci minuti. Talvolta il tubo neurale non collegare al substrato. Se questo è il caso, controllare la fibronecstagno di concentrazione e le condizioni di ipossia. Mentre condizioni di normossia può essere utilizzato per coltura di tipo selvatico NC, condizioni di ipossia imitare maggiormente l&#39;ambiente in vivo 29,30. Nella nostra esperienza, condizioni di ipossia si critica quando la coltura mutante NC. Per esempio, quando Foxd3 mutante NC sono stati coltivati ​​in condizioni di normossia, tronco NC aveva una escrescenza cella notevolmente ridotto rispetto ai controlli. Questa disparità di dimensioni escrescenza stato rimosso quando gli espianti sono stati coltivati ​​in condizioni di ipossia (Figura 4). Inoltre, quando wild-type espianti tubo neurale sono state coltivate in normossia, il numero di caspasi-cellule positive era maggiore di quella di analoghi espianti coltivati ​​in ipossia (dati non mostrati). Mantenendo tutta la cultura NC in ipossia, i confronti possono più facilmente essere fatta tra le dinamiche di controllo e culture mutanti. <img src="/files/ftp_upload/4134/4134fig1.jpg" alt="Figura 1" /> <strong&gt; Figura 1. Schematica complessiva di isolamento NC. A) Dissect regioni di interesse dall&#39;embrione. B) Digest del tubo neurale in collagenasi / dispasi per dieci minuti (non superiore a quindici minuti). C) Lavare in mezzo di lavaggio. D) Dissect via il non-neurale ectoderma e mesoderma. EF) Lavare due volte in mezzo di lavaggio. G) Piatto in media rinnovamento di noi stessi. Incubare a 37 ° C in 3% O 2 condizioni di ipossia. <img src="/files/ftp_upload/4134/4134fig2.jpg" alt="Figura 2" /> Figura 2. La rimozione graduale del tubo neurale di espianto. Il tubo neurale deve essere rimosso dopo 24-48 ore per evitare la contaminazione con cellule non-NC. A) Si noti il ​​confine tra il tubo neurale e la conseguenza NC (linea continua). B) Tagliare lungo il bordo del tubo neurale con un ago da insulina. C) Eliminare il tubo neurale e sostituire media con terreno fresco rinnovamento di noi stessi. Linea tratteggiata indica la conseguenza della misura. Abbreviazione: NT, del tubo neurale. Figura 3. Esempi rappresentativi di risultati. A) escrescenza espianto tipica dopo 24 ore di incubazione in terreno di rinnovamento di noi stessi in condizioni di ipossia (linea tratteggiata indica la conseguenza della misura). B) Visualizzazione ingrandita della crescita degli NC dopo 48 ore di coltura. C) cultura meno ideale, con bassa resa escrescenza. A e C sono state coltivate nelle stesse condizioni. Le immagini mostrano la gamma naturale robustezza cultura. Questo può essere influenzata da efficienza di isolamento tubo neurale, la concentrazione di FN, condizioni di ipossia, e il tempo in collagenasi / dispasi digestioni. <img src="/files/ftp_upload/4134/4134fig4.jpg" alt="Figura 4" /> Figura 4. Nelle analisi in vitro di culture espianti NC in normossia contro l&#39;ipossia. Di controllo (tipo selvatico), le cellule migrate NC da espianti del tubo neurale dopo 48 ore in condizioni di coltura normossia. Al contrario, Foxd3 mutanteNC si era notevolmente ridotto escrescenze cellulari in normossia (bordi rossi contorni marchio delle escrescenze NC). Quando espianti comparabili sono state coltivate in condizioni di ipossia, Foxd3 mutanti espianti NC è cresciuta relativamente ai controlli, consentendo analisi successive. Nota, questo comportamento correlava bene con il comportamento di Foxd3 mutante NC in vivo.

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Non abbiamo nulla da rivelare.

Particolare attenzione dovrebbe essere prestata alla fase di sviluppo dell&#39;embrione per assicurare il successo di questo approccio. Contando somiti di embrioni di topo primi è fondamentale sia per la fase di adattamento embrioni all&#39;interno di una cucciolata e la determinazione delle regioni corrette di tubo neurale per l&#39;isolamento. Una variazione di uno o due somiti tra embrioni è entro una gamma ragionevole di temporizzazione di sviluppo, a seconda della risoluzione dell&#39;esperimento condotto. Un embri...

<table border="1"><tbody><tr><td> Reagente </td><td> Azienda </td><td> Numero di catalogo </td><td> Comments </td></tr><tr><td> DMEM (glucosio basso) </td><td> Gibco / Invitrogen </td><td> 11885 </td><td></td></tr><tr><td> Media Neurobasal </td><td> Gibco </td><td> 21103 </td><td></td></tr><tr><td> BSA </td><td> Sigma </td><td> A3912-10G </td><td></td></tr><tr><td> DPBS </td><td> Gibco </td><td> 14190-144 </td><td></td></tr><tr><td> IGF1 </td><td> BD Biosciences </td><td> 354037 </td><td> Conservare in 50 ug / mL aliquote a -20 ° C. </td></tr><tr><td> bFGF </td><td> BD Biosciences </td><td> 354060 </td><td> Conservare in 25 ug / ml aliquote a -20 ° C. </td></tr><tr><td> Fibronectina </td><td> Gibco </td><td> 33016-015 </td><td> Conservata nella 1mg/mL aliquots a -20 ° C. </td></tr><tr><td> L&#39;acido retinoico </td><td> Sigma </td><td> R2625 </td><td> Conservare a 35 mcg / ml aliquote dopo ricostituzione in etanolo a -20 ° C. </td></tr><tr><td> 2-mercaptoetanolo </td><td> Sigma </td><td> D-5637 </td><td></td></tr><tr><td> N 2 integratore </td><td> Gibco </td><td> 17502-048 </td><td></td></tr><tr><td> B27 supplemento </td><td> Gibco </td><td> 17504-044 </td><td></td></tr><tr><td> Steriflip 0,22 micron filtri </td><td> Millipore </td><td> SCGP00525 </td><td></td></tr><tr><td> Penicillina-streptomicina </td><td> Invitrogen </td><td> 15140122 </td><td></td></tr><tr><td> 0,20 micron filtri </td><td> Corning </td><td> 431219 </td><td></td></tr><tr><td> Siringhe (per filtrazione) </td><td> BD Biosciences </td><td> 301604 </td><td></td></tr&gt; <tr><td> Quattro pozzetti </td><td> Thermo Fisher Scientific </td><td> 176740 </td><td></td></tr><tr><td> Collagenasi / dispasi </td><td> Roche </td><td> 269 ​​638 </td><td> Attività varia a seconda del lotto. Conservare in 100 mg / mL aliquote a -20 ° C. </td></tr><tr><td> Insulina aghi (Calibro 29 ½) </td><td> Becton Dickson </td><td> 309306 </td><td></td></tr><tr><td> Camera di ipossia </td><td> Billups-Rothenberg </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Oxygen Analyzer </td><td> Billups-Rothenberg </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Pinza # 5 </td><td> Strumenti di Scienze Belle </td><td></td><td> Per la rimozione di utero e decidua. </td></tr><tr><td> Tripsina-EDTA (0,25%) </td><td> Gibco </td><td> 25200 </td><td></td></tr></tbody></table>

isolamento e la coltura delle cellule della cresta neurale da embryonic murine tubo neurale

Isolation and Culture of Neural Crest Cells from Embryonic Murine Neural Tube

Il embrionale cresta neurale (NC) è una popolazione di cellule progenitrici multipotenti che si origina nel lato dorsale del tubo neurale, subisce un epitelio di transizione mesenchimale (EMT) e migra in tutta l&#39;embrione, dando luogo a diversi tipi di cellule 1-3. NC ha anche la capacità unica di influenzare la differenziazione e la maturazione degli organi bersaglio 4-6. Quando espiantato in vitro, progenitori NC sottoposti a self-renewal, migrare e differenziarsi in una varietà di tipi di tessuto compresi i neuroni, glia, cellule muscolari lisce, cartilagine e osso. Multipotenza NC è stata descritta da espianti del tubo neurale aviaria 7-9. In isolamento in vitro di cellule NC facilita lo studio delle dinamiche NC, compresa la proliferazione, la migrazione e multipotenza. Ulteriori attività nei sistemi di aviaria e nel ratto hanno dimostrato che le cellule espiantati NC mantengono il loro potenziale NC, quando trapiantati in embrione 10-13. Poiché queste proprietà intrinseche cellulari sono conservati in espiantati progenitori NC, il saggio di espianto del tubo neurale fornisce un&#39;opzione interessante per lo studio della NC in vitro. Per ottenere una migliore comprensione del mammifero NC, molti metodi sono stati impiegati per isolare popolazioni NC. NC-derivati ​​progenitori può essere coltivato da posizioni post-migratori, sia l&#39;embrione e adulti per studiare la dinamica di post-migratori progenitori NC 11,14-20, tuttavia l&#39;isolamento di cellule progenitrici NC in quanto emigrano dal tubo neurale fornisce la migliore conservazione dei NC potenzialità e le proprietà delle cellule migratorie 13,21,22. Alcuni protocolli impiegano fluorescenza selezione delle cellule attivate (FACS) per isolare una popolazione NC arricchito per progenitori particolari 11,13,14,17. Tuttavia, quando a partire da embrioni in fase iniziale, il numero di cellule sufficienti per le analisi sono difficili da ottenere con FACS, complicando l&#39;isolamento dei primi NC populations da embrioni individuali. Qui, descriviamo un approccio che non si basa su FACS ed i risultati in una popolazione di circa il 96% NC puro basato su un Wnt1 Cre-giornalista attivato lignaggio 23. Il metodo presentato qui è l&#39;adattamento di protocolli ottimizzati per la cultura di ratto NC 11,13. I vantaggi di questo protocollo rispetto ai precedenti metodi che sono 1) le cellule non sono cresciute su uno strato alimentatore, 2) FACS non è necessaria per ottenere una popolazione relativamente puro NC, 3) NC premigratory cellule vengono isolate e 4) risultati sono facilmente quantificato. Inoltre, questo protocollo può essere utilizzato per l&#39;isolamento di NC da qualsiasi modello di topo mutante, facilitando lo studio delle caratteristiche NC con diverse manipolazioni genetiche. Il limite di questo approccio è che il NC viene rimosso dal contesto dell&#39;embrione, che è noto per influenzare la, migrazione sopravvivenza e la differenziazione del NC 2,24-28.

Isolamento di embrionale cresta neurale dal tubo neurale facilita l&#39;uso di<em&gt; In vitro</em&gt; Metodi per lo studio della migrazione, self-renewal, e multipotenza di cresta neurale.

Isolamento e la coltura delle cellule della cresta neurale da Embryonic Murine tubo neurale

La cresta neurale (NC) embrionale è una popolazione di progenitori multipotenti che ha origine nella regione dorsale del tubo neurale, subisce una transizione epitelio-mesenchimale...

Prevedere tre ore per eseguire questo protocollo. Una volta acquisita esperienza, il protocollo dovrebbe richiedere da una a due ore, a seconda del numero di embrioni dissezionati. Questo protocollo descrive come ottenere un embrione di 9,5 giorni post-coito tagliato a livello della placca otica media fino al somite quattro, al fine di isolare il tessuto contenente il tubo neurale vagale.Alle fasi embrionali 16 e 22 si isolerà il tessuto contenente il tubo neurale del tronco. La cresta neurale vagale migra dal tubo neurale vagale. Mentre la cresta neurale del tronco migra dal tubo neurale del tronco, il tessuto dissezionato sarà digerito enzimaticamente in una soluzione di collagenasi, lavato e l'epidermide non neurale e il mesoderma saranno dissecati via.Il tubo neurale isolato verrà lavato altre due volte e quindi seminato in un mezzo di auto-rinnovamento. Sono Elise Wark del Laboratorio Bosky presso la Vanderbilt University. Oggi dimostrerò come isolare la cresta neurale dal tubo neurale in coltura esplantata.Questa tecnica ti permetterà di studiare le caratteristiche della cresta neurale in vitro. Cominciamo. Inizia diluendo 100 microlitri di fibronectina da uno mg per ml in 3,2 millilitri di DPBS sterile.Aggiungere una quantità sufficiente della soluzione di fibronectina da 30 microgrammi per millilitro da coprire il fondo di ogni pozzetto di una piastra a quattro pozzetti. Toccare leggermente gli angoli della piastra a quattro pozzetti per assicurarsi che ogni pozzetto sia uniformemente ricoperto. Lasciare la piastra da parte mentre si prepara e filtra il mezzo.La piastra deve rimanere in posa per almeno 15 minuti. Raccogliere i seguenti reagenti per preparare il mezzo. I mezzi vengono preparati in un cabinet a sicurezza biologica, freschi prima dell'uso.Assicurarsi di utilizzare sempre una tecnica sterile. Rimuovere la fibra nin dalla piastra a quattro pozzetti e lasciarla asciugare con il coperchio aperto nella parte posteriore della cappa. Occorrono circa 15 minuti perché la fibra nin si asciughi completamente.Una volta che la piastra è asciutta, aggiungere 500 microlitri di mezzo di autorenovamento a ciascuna. Posizionare immediatamente la piastra a 37 gradi in un incubatore umidificato con anidride carbonica al 5% prima di iniziare la dissezione. Mescolare 50 microlitri di collaghenasi nello spazio disco in cinque millilitri di DPBS. Assicurarsi di aggiungere tutto il collaghenasi dispa per garantire una digestione efficiente.Utilizzare un filtro per siringa da 0,2 micron per filtrare la soluzione di collagenasi dispa in tre pozzetti di una piastra a 12 pozzetti. Ogni pozzetto deve ricevere un terzo della soluzione da cinque millilitri. Pipettare circa un millilitro di mezzo di lavaggio in ciascuno dei pozzetti rimanenti. Posizionare la piastra sul ghiaccio fino al momento della digestione del tessuto isolato.Successivamente, tagliare la punta di una pipetta P 20 appena sotto il bordo smussato utilizzando una lametta sterile. Immergere la punta nel mezzo di lavaggio in modo che embrioni e frammenti di tessuto isolato non aderiscano alle punte durante il trasferimento tra le soluzioni.Fare lo stesso con la punta di una pipetta P1000 da un accoppiamento programmato. Rimuovere l'utero dalla femmina. Completare la dissezione in DPBS sterile.Sterilizzare gli strumenti da dissezione utilizzando un qualsiasi metodo, come la sterilizzazione termica. Se il DPBS diventa torbido, spostare l'embrione con la pipetta P 1000 tagliata in una nuova piastra contenente DPBS sterile, partendo dal tessuto tagliato. Separare delicatamente il tessuto uterino dalla decidua.Successivamente, rimuovere delicatamente l'embrione all'interno della decidua. La posizione dell'embrione è indicata qui con un disegno schematico. Dopo aver isolato un embrione di 9,5 giorni post fecondazione, rimuovere delicatamente la vescica vitellina utilizzando aghi per insulina.Se il genotipaggio è una parte necessaria del tuo protocollo, lava la vescica vitellina e qualsiasi tessuto embrionale residuo in DPBS pulito e sterile. Posiziona il tessuto in un tubo da 1,5 millilitro e conserva il tubo a 80 gradi Celsius sotto zero fino a quando non sei pronto per isolare il DNA. Familiarizza con l'anatomia dell'embrione.Effettuerai il taglio al livello del codice PLA otico medio nei somiti quattro, 16 e 22. Dovrai regolare la messa a fuoco del microscopio per poter contare i somiti. Esegui il primo taglio al livello del codice PLA otico medio.Usare gli aghi come le lame di una forbice senza danneggiare il resto del tubo neurale. Eseguire il secondo taglio dopo il somite quattro. Successivamente, tagliare fino al somite 15 e recidere immediatamente dopo di esso.Eseguire il taglio finale dopo il somite 22 o l'ultimo somite, se l'embrione è a uno stadio di sviluppo precedente. Questo tessuto contiene il tubo neurale del tronco ed è necessario isolare il tessuto contenente il tubo neurale vagale.Tagliare il cuore lontano dal tessuto compreso tra la piastra otica media e il quarto somite. Osservare la differenza di dimensioni tra i frammenti di tessuto isolato. Il frammento contenente il tubo neurale vagale è più ampio rispetto all'altro.Questa distinzione fisica permette di processare i due frammenti insieme. Utilizzare la punta P 20 per trasferire il tubo neurale nello spazio di dis collagenasi. Il tessuto rimanente può essere conservato per il genotipaggio.Come indicato in precedenza, posizionare i pezzi di tessuto isolato in uno dei pozzetti con collagenasi dis space. Ora a temperatura ambiente. Lasciare in incubazione per 10 minuti.Durante l'incubazione di 10 minuti, è possibile iniziare a dissezionare l'embrione successivo. Dopo 10 minuti, rimuovere il tessuto isolato dal contenitore con collagenasi e lavarlo aspirando e dispensando su e giù nel mezzo di lavaggio, quindi trasferire il tessuto digerito in DPBS. Questo è l'aspetto che il tessuto dovrebbe avere al termine della digestione.Il passo successivo prevede la rimozione dell'ectoderma non neurale e del mesoderma. Innanzitutto, l'ectoderma non neurale viene sollevato dal tubo neurale. Successivamente, il mesoderma può essere rimosso dal tubo neurale.Per dimostrare la rimozione dell'ectoderma non neurale e del mesoderma, ci concentreremo sul tubo neurale vagale. Lo stesso procedimento può essere eseguito con il tubo neurale del tronco. Iniziare tenendo premuto il tessuto non neurale con un ago.Utilizzare l'altro strumento per rimuovere delicatamente il derma non neurale. Successivamente, rimuovere con delicatezza i somiti adiacenti al tubo neurale per eliminare i residui di qualsiasi tessuto non neurale. Ripetere delicatamente con la punta tagliata di una pipetta P20.Lavare il tubo neurale due volte con il mezzo di lavaggio. Posizionare il tubo neurale nel mezzo di auto-riproduzione, quindi seminare in una piastra preparata a quattro pozzetti.Posizionare la piastra a quattro pozzetti in una camera da ipossia. Assicurarsi che la camera sia sigillata. Collegare un analizzatore di ossigeno e accendere la sorgente di gas misto.Utilizzare una miscela di 1% di ossigeno, 6% di anidride carbonica e 93% di azoto. Caricare la camera ipossica fino a raggiungere il 3% di ossigeno. Spegnere il gas misto e posizionare la camera ipossica a 37 gradi Celsius.24 ore dopo. Osservare l'espianto del tubo neurale. Le cellule della cresta neurale dovrebbero essersi migrate dal tubo neurale, delineato con la linea continua, per evitare contaminazione con tessuto non appartenente alla cresta neurale; effettuare il taglio all'esterno del tubo neurale con un ago da insulina.Successivamente, rimuovere il tubo neurale dall'espianto e da tutte le cellule residue non derivate dalla cresta neurale. Sostituire il mezzo con mezzo di autorenovamento fresco e reinserire le piastre nella camera da ipossia. Accenderla e posizionarla a 37 gradi Celsius.Dopo 24 ore di coltura, la cresta neurale migrerà lontano dal tubo neurale. L'estensione dell'espansione è indicata con una linea tratteggiata. Questa espansione della cresta neurale, evidenziata dalle frecce, è approssimativamente al 96% pura e le cellule esprimono P75, SOX10 e FoxD3.Gli esperimenti che possono essere condotti con queste cellule della cresta coltivate includono, ma non si limitano ai seguenti. A volte colture meno ottimali non produrranno espansioni efficienti se ciò dovesse verificarsi. Verificare attentamente le condizioni ipossiche, le concentrazioni di fibronectina e il tempo di digestione del tessuto in collagenasi DYS. Oggi ho dimostrato le basi della coltura della cresta neurale dal tubo neurale.In bocca al lupo per i tuoi esperimenti.

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Isolamento e la coltura delle cellule della cresta neurale da Embryonic Murine tubo neurale

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