Isolamento e la coltura delle cellule della cresta neurale da Embryonic Murine tubo neurale

Metti da parte tre ore per eseguire questo protocollo. Una volta che si è esperti, questo protocollo dovrebbe richiedere da un'ora e mezza a due ore per essere completato, a seconda del numero di embrioni sezionati. Questo protocollo descrive come prelevare un embrione post cort di 9,5 giorni tagliato al codice della placca medio-otica e a circa quattro per isolare il tessuto contenente il tubo neurale vagale. Taglio.

A tal punto gli acari 16 e 22 isoleranno il tessuto contenente il tubo neurale del tronco. La cresta neurale vagale migra dal tubo neurale vagale. Mentre la cresta neurale del tronco migra dal tubo neurale del tronco, il tessuto sezionato verrà digerito enzimaticamente in una soluzione di collagenasi dis, l'epiderma e il mesoderma non neurali lavati nello spazio verranno sezionati.

Il tubo neurale isolato verrà lavato altre due volte e quindi placcato in un mezzo di auto-rinnovamento. Sono Elise Graph del Bosky Laboratory della Vanderbilt University. Oggi dimostrerò come isolare la cresta neurale dal tubo neurale nella cultura explan.

Questa tecnica ti permetterà di studiare le caratteristiche della cresta neurale In vitro. Iniziamo. Inizia diluendo 100 microlitri di un mg per mil di fibronectina in 3,2 millilitri di DPBS sterile.

Mettere una quantità sufficiente di soluzione di fibronectina da 30 microgrammi per millilitro per coprire il fondo di ciascun pozzetto di una piastra a quattro pozzetti. Picchiettare delicatamente gli angoli della piastra a quattro pozzetti per assicurarsi che ogni pozzetto sia coperto in modo uniforme. Lascia riposare la piastra mentre prepari e filtri i tuoi supporti.

Il piatto dovrebbe riposare almeno 15 minuti. Raccogli i seguenti reagenti Per preparare il tuo terreno. I terreni sono confezionati in una cabina di biosicurezza freschi prima dell'uso.

Assicurati di utilizzare sempre la tecnica sterile. Togliete il nin di fibra dal piatto a quattro pozzetti e lasciatelo asciugare con il coperchio tolto nella parte posteriore del cappuccio. Ci vogliono circa 15 minuti perché la fibra nin si asciughi.

Una volta che la piastra è asciutta, aggiungere 500 microlitri di terreno autorinnovante a ciascuna. Posizionare bene la piastra a 37 gradi in un incubatore umidificato al 5% di anidride carbonica immediatamente prima di iniziare la dissezione mescolare 50 microlitri di spazio su disco di collagenasi in cinque millilitri di DPBS. Assicurati di aggiungere tutta la collagenasi dispa per garantire una digestione efficiente.

Utilizzare un filtro per siringa da 0,2 micron per filtrare la soluzione di collagenasi dispa in tre pozzetti di una piastra a 12 pozzetti. Ogni pozzetto dovrebbe ricevere un terzo della soluzione da cinque millilitri Pipettare circa un millilitro di terreno di lavaggio in ciascuno dei pozzetti rimanenti. Metti la piastra sul ghiaccio fino a quando non sei pronto per digerire il tessuto isolato.

Quindi, tagliare la punta di una punta per pipetta P 20 appena sotto il bordo smussato con una lama di rasoio sterile. Immergere la punta in un terreno di lavaggio in modo da embrioni e pezzi di tessuto isolato. Non attaccarsi alle punte durante il trasferimento tra le soluzioni.

Fai lo stesso con la punta di un P 1000 da un accoppiamento cronometrato. Rimuovere l'utero dalla diga. Completare la dissezione in DPBS sterile.

Sterilizza i tuoi strumenti di dissezione utilizzando qualsiasi metodo come la sterilizzazione a caldo. Se il DPBS diventa torbido, spostare l'embrione con il taglio P 1000 in un piatto fresco di DPBS sterile iniziando dal tessuto tagliato. Staccare delicatamente il tessuto uterino dalla decidua.

Quindi, rimuovere delicatamente l'embrione dall'interno della decidua. La posizione dell'embrione è indicata qui con un cartone animato. Dopo aver isolato un embrione di 9,5 giorni dopo il coum, rimuovere delicatamente il sacco vitellino con aghi da insulina.

Se la genotipizzazione è una parte necessaria del protocollo, lavare il sacco vitellino e l'eventuale tessuto embrionale rimanente in DPBS pulito e sterile. Metti il tessuto in una provetta da 1,5 millilitri e conserva la provetta a una temperatura negativa di 80 gradi Celsius fino a quando non sei pronto per isolare il DNA. Orientati all'anatomia dell'embrione.

Taglierai il codice PLA medio OTIC in SOMITES quattro, 16 e 22. Dovrai regolare la messa a fuoco del tuo microscopio per contare i somiti. Eseguire il primo taglio in corrispondenza del codice PLA Otic centrale.

Usa gli aghi come le lame delle forbici senza danneggiare il resto del tubo neurale. Fai il secondo taglio dopo, quindi ascigli quattro. Quindi tagliare fino all'acaro 15 e tagliare subito dopo.

Fai il taglio finale Dopo quindi acaro 22 o l'ultimo, quindi acaro. Se l'embrione è precoce dal punto di vista dello sviluppo. Questo tessuto contiene il tubo neurale del tronco per isolare il tessuto contenente il tubo neurale vagale.

Tagliare il cuore dal tessuto tra il piatto otico medio e il quarto acaro. Si noti la differenza di dimensioni tra i pezzi di tessuto isolato. Il pezzo che contiene il tubo neurale vagale è più largo dell'altro.

Questa distinzione fisica consente di elaborare i due pezzi insieme. Utilizzare il taglio P 20 per trasferire il tubo neurale nello spazio della collagenasi. Il tessuto rimanente può essere conservato per la genotipizzazione.

Come detto in precedenza, posizionare i pezzi di tessuto isolato in uno dei pozzetti con lo spazio della collagenasi. Ora a temperatura ambiente. Lasciate riposare per 10 minuti.

Durante l'incubazione di 10 minuti, puoi iniziare a sezionare l'embrione successivo. Dopo 10 minuti, rimuovere il tessuto isolato dallo spazio della collagenasi e lavare pipettandolo su e giù in un mezzo di lavaggio, posizionare il tessuto digerito in DPBS. Ecco come dovrebbe apparire il tessuto dopo la digestione.

Il passo successivo prevede la rimozione del derma e del mesoderma non neurali. In primo luogo, il derma non neurale viene sollevato dal tubo neurale. Successivamente, il mesoderma può essere rimosso dal tubo neurale.

Per dimostrare la rimozione del derma e del mesoderma non neurali, ci concentreremo sul tubo neurale vagale. Lo stesso processo può essere eseguito con il tubo neurale del tronco. Inizia tenendo premuto il tessuto non neurale con un ago.

Usa l'altro per rimuovere delicatamente il derma non neurale. Quindi, rimuovere delicatamente i somiti adiacenti al tubo neurale per rimuovere i resti di qualsiasi tessuto non neurale. Ripetere delicatamente con il puntale della pipetta P 20 cutoff.

Lavare il tubo neurale due volte con il mezzo di lavaggio. Posizionare il tubo neurale nel mezzo di auto-rinnovamento, quindi impiattare in un quattro preparato. Piatto bene.

Mettere la piastra a quattro pozzetti in una camera di ipossia. Assicurarsi che la camera sia sigillata. Collegare un analizzatore di ossigeno e accendere la fonte di gas miscelato.

Usa una miscela di 1% di ossigeno, 6% di anidride carbonica e 93% di azoto. Caricare la camera dell'ipossia fino a quando non raggiunge il 3% di ossigeno. Spegnere il gas miscelato e posizionare la camera di ipossia a 37 gradi Celsius.

24 ore dopo. Guardate la spiegazione del tubo neurale. Le cellule della cresta neurale dovrebbero essere migrate dal tubo neurale delineato con la linea continua per prevenire la contaminazione con il tessuto della cresta non neurale tagliato attorno all'esterno del tubo neurale con un ago da insulina.

Quindi, rimuovere il tubo neurale dall'explan e tutte le cellule della cresta non neurale rimanenti. Sostituire il terreno con un nuovo mezzo di autorinnovamento e rimettere le piastre nella camera di ipossia. Caricalo e posizionalo a 37 gradi Celsius.

Dopo 24 ore in coltura, la cresta neurale migrerà lontano dal tubo neurale. L'estensione dell'escrescenza è mostrata con una linea tratteggiata. Questa crescita della cresta neurale evidenziata dalle frecce è pura per circa il 96% e le cellule esprimono P 75 SOX 10 e Fox D tre.

Gli esperimenti che possono essere condotti con queste cellule cresta in coltura includono, ma non sono limitati a quanto segue. A volte le colture meno ideali non produrranno escrescenze efficienti se ciò si verifica. Ricontrolla le condizioni ipossiche, le concentrazioni di fibronectina e la quantità di tempo in cui il tessuto è stato digerito nella collagenasi DYS Space Oggi ho dimostrato le basi dietro la coltura della cresta neurale dal tubo neurale.

Buona fortuna con i tuoi esperimenti.