Cella di analisi specifica di Arabidopsis Foglie usando fluorescenza activated cell sorting

L'obiettivo generale di questa procedura è isolare una popolazione di protoplasti specifici per tipo cellulare da una foglia. Ciò si ottiene coltivando per prime le piante che esprimono la GFP in specifici tipi di cellule nella foglia. Il secondo passo consiste nel raccogliere le foglie e generare protoplasti utilizzando una digestione enzimatica.

Successivamente, i protoplasti vengono filtrati e ordinati utilizzando la selezione cellulare attivata dalla fluorescenza o i fatti. Il passaggio finale consiste nel confermare l'accuratezza della selezione utilizzando la microscopia a fluorescenza. In definitiva, i protoplasti selezionati possono essere utilizzati per l'analisi dell'espressione genica specifica del tipo di cellula, l'analisi proteomica o il profilo metabolico.

La selezione cellulare attivata fluorescente è stata precedentemente utilizzata con successo per le radici, ma viene utilizzata per isolare le cellule fogliari. L'etichettatura con GFP prima di questo metodo è stata limitata a causa dell'interferenza della fluorescenza della clorofilla. La dimostrazione visiva di questo metodo è fondamentale in quanto rapida, ma un'attenta preparazione del campione è fondamentale per ridurre al minimo gli ampi cambiamenti fisiologici che possono verificarsi durante lo smistamento cellulare.

In generale, le persone che non conoscono questo metodo avranno difficoltà perché non saranno consapevoli di come impostare il selezionatore di celle o di come confermare un ordinamento accurato. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo della biologia dei sistemi vegetali. Il problema con l'identificazione delle reti di regolazione genica in un complesso organo multicellulare come una foglia, è che diversi tipi di cellule esprimono diversi gruppi di geni.

Queste informazioni genetiche vengono perse nell'analisi della raccolta di un'intera foglia Dimostrando la procedura. Al mio fianco ci saranno Ellison As e Sanjeev Kuma, che forniscono supporto tecnico per questo lavoro nel nostro laboratorio. Per prima cosa, riempire una capsula di Petri rotonda di nove centimetri con 20 millilitri di soluzione A contenente enzimi di protoplaccatura e inibitori trascrizionali e RNA.

Quindi raccogliere il materiale fogliare desiderato per campioni contenenti più di una singola foglia come il campione mostrato qui. Disponi le foglie in una pila di 15 foglie. Quindi usa una lama di rasoio per tagliare le foglie in strisce larghe un millimetro.

Trasferire immediatamente le strisce di foglie nella capsula di Petri utilizzando un paio di pinzette piatte, separare delicatamente le strisce e quindi infiltrarsi nei campioni sottovuoto due volte per cinque minuti ogni volta. Quindi, posizionare la capsula di Petri su un agitatore orbitale impostato a 90 giri/min a temperatura ambiente e prelevare campioni di gesso per tre o quattro ore. Durante l'incubazione, utilizzare le pinzette per separare le strisce di foglie l'una dall'altra a intervalli di mezz'ora.

Dopo la digestione, filtrare delicatamente la soluzione di protoplasti attraverso un colino cellulare da 70 micron in un tubo da 50 millilitri. Per rimuovere le strisce di foglie, le strisce verranno trattenute. I protoplasti filtreranno.

Ora usa quattro millilitri di soluzione A per sciacquare delicatamente le strisce di foglia raccogliendo il lavaggio nel tubo da 50 millilitri. Quindi trasferire la sospensione di protoplasti in provette a fondo tondo e centrifugare i protoplasti per cinque minuti a 300 volte G e temperatura ambiente. Facendo attenzione a non disturbare il pellet, aspirare delicatamente la maggior quantità possibile di natante supino, quindi lavare i protoplasti con cinque millilitri di soluzione A nelle stesse condizioni di centrifuga.

Infine, dopo aver rimosso il natante supino, utilizzare una punta di taglio P 1000 per risospendere i PROTOPLAST in un volume appropriato di soluzione A per la selezione immediatamente prima della cernita. Utilizzare una punta P 1000 non tagliata per disaggregare eventuali grumi nella soluzione di Protoplasts. Dissociare ulteriormente le cellule filtrando i protoplasti in un tubo di approvvigionamento attraverso un filtro fillon da 50 micron.

Quindi diluire la soluzione cellulare in modo appropriato per evitare di intasare l'ugello di approvvigionamento delle celle. Dopo aver determinato le condizioni ottimali di approvvigionamento delle celle, identificare il Proto plus positivo alla GFP con un laser Argonne a 488 nanometri, aumentando l'output del filtro passa-banda 580 a 30 bande rispetto al filtro passa-banda 530 a 40. Si noti che i protoplasti positivi alla GFP appariranno nella popolazione alta 530, bassa 580.

Con i protoplasti non GFP nella popolazione bassa 530, bassa 580, i protoplasti morti morenti e i detriti appaiono nella popolazione alta 580 per la visualizzazione dei protoplasti ordinati mediante microscopia a fluorescenza, ordinano i protoplasti direttamente in almeno otto volumi di soluzione A dopo la selezione del concentrato, i protoplasti mediante centrifugazione possono essere ordinati in otto volumi di soluzione A e raccolti per la visualizzazione su un microscopio a fluorescenza per verificare l'arricchimento. Questa prima immagine mostra un esempio di arricchimento della linea cellulare TP 382, che esprime GFP nelle celle di guardia. In questa tabella sono riassunti esempi di rese ottenute con questo metodo sia prima che dopo l'amplificazione.

Le quantità ottenute tra 500 picogrammi e 50 nanogrammi sono sufficienti per l'amplificazione da parte del sistema ovation PICO WTA e la successiva analisi mediante sequenziamento quantitativo PCR di nuova generazione o microarray. La prossima serie di immagini mostra varie linee cellulari di protoplasti isolate e ordinate con il metodo appena descritto. Questi primi protoplasti sono stati derivati da KC 2 74, lascia una sezione trasversale di un KC 2 74.

La foglia mostra che la GFP è espressa nel sistema vascolare. Questi protoplasti sono stati isolati da foglie di KC 4 64 e una sezione trasversale di una foglia di KC 4 64 mostra che l'espressione di GFP si trova nell'epidermide di A dal. Infine, questi protoplasti sono stati derivati da TP 3 82 foglie in TP 3 82 foglie.

La GFP è espressa nelle celle di guardia qui. Vengono mostrati i tipici dot plot di acquisizione fax che illustrano l'output dei filtri passa-banda 5, 80, 30 nanometri rispetto ai filtri passa-banda 5, 30, 40 nanometri. Le porte di smistamento mostrate sono quelle tipicamente utilizzate durante lo smistamento.

Questo primo appezzamento di protoplasti derivati da quattro foglie di carbone proto intonacati in assenza di inibitori mostra una singola popolazione bassa di 530, bassa 580. Mentre questo dot plot da protoplasti derivati da carbone wild type a quattro foglie protointonacati in presenza di inibitori dimostra lo spostamento della fluorescenza 580 che si verifica a causa dello stress e della colorazione causati dagli inibitori. Questi grafici a punti sono protoplasti derivati da foglie rispettivamente dalle linee KC seven four, KC 4 64 e TP 3 82.

Questi campioni sono stati anche ingessati in presenza di inibitori che mostravano che la GFP era contenuta nelle popolazioni high 530 low 580. Per questo rappresentativo, sono stati prima ottenuti campioni dell'esperimento di PCR quantitativa per ciascun tipo di frazione. I campioni sono stati quindi amplificati utilizzando il sistema ovation PICO WTA e la PCR quantitativa.

Utilizzando primer specifici per GFP. I valori mostrati sono i più alti in rosso e i più bassi in verde, i valori medi o singoli che utilizzano l'actina due come gene di riferimento sono indicati dalle barre gialle orizzontali. I risultati sono una riverifica delle valutazioni ottiche del contenuto di celle GFP nelle frazioni selezionate.

La popolazione alta 530 bassa 580 ha mostrato i più alti livelli misurabili di espressione di GFP. Mentre la popolazione alta 530 alta 580 mostrava un'espressione di GFP circa 1000 volte inferiore, le popolazioni basse 530, basse 580 e basse 530 alte 580 mostravano bassi livelli di espressione di GFP paragonabili a quelli delle popolazioni di controllo di foglia intera e protoplasti non ordinati Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere eseguita in quattro o cinque ore dalla pianta alla popolazione cellulare selezionata se viene eseguita correttamente. Durante l'esecuzione di questa procedura è importante ricordarsi di monitorare costantemente la selezionatrice di celle e di ricalibrarla se necessario per mantenere l'accuratezza della selezione.

Ho trovato questa procedura. Altri metodi, come l'analisi a raggi micro, possono essere eseguiti per confrontare e contrastare i livelli di espressione genica in diversi tipi di cellule. Ora che questa tecnica è stata sviluppata, stiamo analizzando l'espressione genica in specifici tipi di cellule fogliari in diverse fasi di sviluppo e la confronteremo con i dati dell'intera foglia che sono stati generati nel progetto agronomico.

Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come isolare i singoli tipi di cellule di foglie utilizzando la selezione cellulare attivata dalla fluorescenza.