Name: Cella di analisi specifica di Arabidopsis Foglie usando fluorescenza activated cell sorting (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-10-04T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 25 s
Description: Scopri l'isolamento di protoplasti specifici da foglie di Arabidopsis mediante FACS per analisi di espressione genica. Questa tecnica consente lo studio di popolazioni cellulari GFP-positive in biologia vegetale.

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Il lavoro in Buchanan-Wollaston laboratorio sul profilo palco tipo cellulare e di sviluppo specifico è supportato dal AGRON-OMICS progetto (concessione # LSHG-CT-2006-037704) nel quadro Progamme 6 ° della Commissione europea. Il lavoro in laboratorio Gifford sul tipo cellulare specifico profilo è supportato da un nuovo BBSRC Investigator Grant (BB/H019502/1). Le KC274 KC464 e linee di Arabidopsis sono stati ottenuti da AAR Webb (Università di Cambridge).

1. Generazione di protoplasti <ol><li> Raccolta materiale fogliare e tagliarla a strisce di 1 mm di larghezza (Figura 1), con una lama di rasoio. Per campioni contenenti più di una singola foglia fino a 15 fogli possono essere facilmente impilati prima del taglio. </li><li> Trasferire immediatamente strisce foglia in un tondo piatto Petri 9 centimetri contenente 20 ml di soluzione A (400 mM mannitolo, 20 mM MES idrato, 20 mM KCl, 10 mM CaCl 2, 2 mM MgCl2, 0,1% BSA e 2,5 mM β-mercaptoetanolo, pH 5,7) compresi gli enzimi protoplasting (1,2% cellulosa R-10, 0,6% cellulosa RS e 0,4% macerozyme R-10) e RNasi e inibitori trascrizionali (1 × ProtectRNA e 10 ug / ml actinomicina D); separare delicatamente le strisce foglia e vuoto infiltrato per 2 × 5 min. </li><li> Luogo Petri su un agitatore orbitale impostato su 90 min a temperatura ambiente e protoplasti per ora 3-4. <ol><li> Durante l&#39;incubazione le strisce foglia devono essere separate l&#39;una dall&#39;altra, con l&#39;uso di unset di pinzette piatte, ad intervalli di trenta minuti. </li></ol></li><li> Posizionare una cella di filtro 70 micron (Fisher Scientific) in un tubo da 50 ml e delicatamente filtrare la soluzione attraverso protoplasting. Ciò rimuovere le strisce foglia, che saranno trattenuti dal vaglio consentendo i protoplasti di passare attraverso. </li><li> Lavare le strisce foglia con 4 ml di soluzione A e delicatamente filtrare attraverso il setaccio stesso. </li><li> Trasferire i protoplasti in provette a fondo tondo e centrifugare la soluzione protoplasti a 300 xg per 5 minuti a pellet i protoplasti. </li><li> Aspirare delicatamente fuori la maggior quantità di surnatante possibile senza disturbare i protoplasti. </li><li> Lavare i protoplasti con 5 ml di soluzione A e centrifugare a 300 xg per 5 min. Rimuovere il surnatante </li><li> Risospendere i protoplasti in un volume appropriato di soluzione A, con una pipetta Pasteur o un cut-off punta P1000. </li></ol> 2. FACS di protoplasti Leaf </p&gt; <ol><li> Immediatamente prima cernita, risospendere le protoplasti con un (non-taglio) P1000 punta per evitare protoplasti aggregazione insieme. </li><li> Trasferire protoplasti di un tubo di smistamento attraverso un micron 50 Filcon filtro (BD Biosciences) e diluite per evitare l&#39;intasamento dell&#39;ugello del cell sorter. I protoplasti vengono ordinati utilizzando un ugello 100 micron ad una pressione di 20 psi (guaina) e 21-21,5 psi (campione), una frequenza di 39,2 kHz e un tasso di evento di &lt;4000 (queste impostazioni sono ottimali su un cell sorter Influx BD (BD Biosciences). Ottimizzazione su altre macchine di smistamento delle cellule potrebbe essere necessario regolare queste impostazioni). </li><li> Protoplasti GFP positivi sono identificati utilizzando un laser argon 488 nm e riportando l&#39;uscita dal passabanda 580/30 del filtro (arancione) vs il filtro 530/40 passabanda (verde). GFP protoplasti positivi saranno in alta 530/low 580 popolazione, con i non-GFP protoplasti nel basso 530/580 a bassa popolazione e morti / protoplasti muoiono e detriti in alta 580 popolazionemento (Figura 2). <ol><li> Quando si ordina protoplasti da cui saranno estratti RNA, protoplasti dovrebbero essere ordinati direttamente in almeno 4 volumi di un tampone di lisi contenente un agente riducente (ad esempio β-mercaptoetanolo). Inoltre, il tempo di ordinamento di un singolo campione dovrebbe essere limitato a 20-30 min, e un massimo di 2-3 campioni trattati in qualsiasi momento. </li><li> Per la visualizzazione di protoplasti filtrate, i protoplasti dovrebbero essere ordinati direttamente in almeno 8 volumi di soluzione A e successivamente raccolti per centrifugazione a concentrare i protoplasti. </li></ol></li></ol> 3. Risultati rappresentativi Questo protocollo descrive un metodo per ottenere protoplasti da foglie di Arabidopsis, che sono utilizzati per fluorescenza selezione cellulare attivata (Figura 1). Generazione protoplasti in presenza di RNasi e inibitori trascrizionali impedisce f cellulerom montare una risposta trascrizionale. Questo ha la conseguenza di dare luogo a molte protoplasti morti e morenti, che hanno un livello significativo di autofluorescenza. Quando si ordinano i protoplasti preparati con questo metodo è quindi molto comune vedere diverse popolazioni distinte nei grafici dei 580 nm contro 530 nm fluorescenza utilizzati per l&#39;ordinamento. Esempi di questo, insieme con le porte di ordinamento utilizzati in questo protocollo sono mostrati nella Figura 3. Protoplasti possono essere ordinati in 8 volumi di soluzione A e raccolti per la visualizzazione per verificare l&#39;arricchimento. Figura 2G mostra un esempio di questo utilizzando la linea TP382, che esprime GFP nelle cellule di guardia. Esempi di rese ottenute con questo metodo, prima e dopo l&#39;amplificazione, sono mostrati nella Tabella 1. Gli importi ottenuti sono sufficienti per l&#39;amplificazione con il Ovation Pico WTA di sistema (500 pg-50 ng) e quindi sanalisi ubsequent da una qPCR (Figura 4), ​​sequenziamento di nuova generazione o microarray. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/4214/4214fig1.jpg" /> Figura 1. Flusso di lavoro generale per l&#39;esperimento. 1) Raccolta foglie di interesse da una linea che esprime GFP Arabidopsis. 2) rapidamente tagliata a strisce ~ 1 mm di larghezza e di trasferire immediatamente questi in soluzione protoplasting e vuoto infiltrato. 3) Incubare per ora 3-4. 4) delicatamente filtrato soluzione protoplasti al setaccio 70 pm, il trasferimento per arrotondare tubi fondo e protoplasti pellet per centrifugazione. 5) Immediatamente prima cernita, protoplasti risospendere e il trasferimento ad un tubo ordinamento attraverso un filtro di 50 micron. 6) In ordine GFP positive e negative GFP protoplasti vitali. 7) I protoplasti possono essere analizzati visivamente oppure utilizzando tecniche come qPCR, sequenziamento di nuova generazione o microarray. Figura 2. Le linee KC464, KC274 e TP382 utilizzati in questo studio. A) Sezione trasversale di una foglia KC464 che mostra espressione GFP nell&#39;epidermide adaxial. B) protoplasti derivati ​​da KC464 foglie. C) la sezione trasversale di una foglia KC274 mostrando espressione GFP nel sistema vascolare. D) protoplasti derivati ​​da KC274 foglie. E) foglie TP382 mostrando espressione GFP nelle cellule di guardia. F) protoplasti derivati ​​da TP382 foglie. G) Esempio di arricchimento ottenuto mediante FACS di GFP che esprimono cellule di guardia sullo sfondo complesso di celle foglia, mostrando contenente GFP protoplasti dall&#39;alto 530/low 580 popolazione di protoplasti derivati ​​da TP382 foglie. AF: immagini microscopio confocale; G: immagine al microscopio a fluorescenza. Barre di scala all&#39;interno di immagini di 50 micron. <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/4214/4214fig3.jpg" /><html> Figura 3. Tipici FACS trame di acquisizione punto dei prodotti ottenuti dai 580/30 nm (arancione) vs 530/40 nm (verde) filtri passa banda (sorter Afflusso BD cellulare). Le porte di ordinamento indicati sono quelli tipicamente utilizzati durante l&#39;ordinamento. A) dot plot di Col-4 foglia protoplasti derivati, protoplasted in assenza di inibitori, che mostrano un basso singolo 530/low 580 popolazione. B) dot plot da Wt protoplasti Col-4 foglie derivate, protoplasted in presenza di inibitori, che mostrano un cambiamento nella fluorescenza 580 a causa di stress e di colorazione dagli inibitori. CE) Dot trame di foglie protoplasti derivati ​​dalle linee KC74, KC464 e TP382, rispettivamente, protoplasted in presenza di inibitori, mostrando anche la GFP contenente popolazioni del 530/low alta 580 popolazioni. Le percentuali degli eventi nelle 530/low (alta 580) popolazioni GFP sono dati. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/4214/4214fig3large.jpg" target="_blank">Clicca qui per ingrandire la figura</a> . e_content &quot;fo: keep-together.within-page =&quot; always &quot;&gt; <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/4214/4214fig4.jpg" /> Figura 4. Espressione GFP nelle frazioni rappresentative popolazione gated come mostrato in Figura 3. Due replicati biologici sono stati ottenuti per ciascun tipo di frazione, amplificati utilizzando il sistema Ovation Pico WTA e qPCR GFP usando primer specifici (Tabella 2) è stata poi eseguita. I valori indicati sono i più elevati (rosso), i valori più bassi (verde) e media relativi. L&#39;alta 580 popolazione era in questo caso diviso in due, basso 530/low 580 e alta 530/low 580, per il quale un singolo replicato biologico è stato utilizzato in modo che solo il singolo valore viene visualizzato. ACT2 (At3g18780) è stato utilizzato come standard per tutti i campioni. Foglia: foglia intera. Unsorted: protoplasti Unsorted. GFP1: alta 530/low 580 e Rest1: basso 530/low 580, GFP2: 530/high alta 580 e Rest2: basso 530/high 580, come descritto nella Figura 3 e l&#39;inserto. I risultati sono una verifica of valutazioni ottiche del contenuto della cella GFP nelle frazioni ordinati (ad esempio 2G Figura). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/4214/4214fig4large.jpg" target="_blank">Clicca qui per ingrandire la figura</a> . <table border="1"><tbody><tr><td> Campione </td><td> Numero di foglie </td><td> Numero di celle </td><td> RNA resa (Ng) </td><td> RNA resa (Amplificato; ng) </td></tr><tr><td> Una foglia intera Tutta la foglia B </td><td> 1 1 </td><td> - - </td><td> 8001 10525 </td><td> 4623 *** 4572 *** </td></tr><tr><td> Protoplasti Unsorted A Unsorted protoplasti B </td><td> 5 5 </td><td> - - </td><td> 2433 2625 </td><td> 1152 *** 3321 *** </td></tr><tr><td> GFP1 A Rest1 A </td><td> 15 </td><td> 6039 (0,39% *) 55389 (6.40% *) </td><td> - ** - ** </td><td> 861 489 </td></tr><tr><td> GFP1 B Rest1 B </td><td> 15 </td><td> 10.783 (0,63% *) 57.040 (7,49% *) </td><td> - ** - ** </td><td> 537 420 </td></tr><tr><td> GFP2 Rest2 </td><td> 15 </td><td> 18.337 (1,49% *) 62.405 (73,49% *) </td><td> - ** - ** </td><td> 360 411 </td></tr></tbody></table> I campioni Tabella 1. Raccolti con FACS e analizzate qPCR per determinare quale frazione contenuta dal vivo che esprimono GFP-protoplasti. Sono incluse in questa tabella è la resa totale in ng RNA prima e dopo amplificazione con il Pico Ovation WTA System (NuGen). GFP1 frazioni, GFP2, Rest1 e Rest2 sono come mostrato nella inserto in Figura 4. * La percentuale di cellule della corsa totale liste cella è indicato tra parentesi accanto al numero di cellule nella frazione. Queste percentuali non sono correlati adreciprocamente per ogni campione come il tipo FACS corre per frazioni &#39;Rest&#39; stato interrotto prima di GFP per frazioni a causa del numero molto maggiore di cellule raccolte riposo. ** 50 ng utilizzata come input per reazioni di amplificazione, secondo il protocollo del produttore. <table border="1"><tbody><tr><td> Primer </td><td> Sequenza </td></tr><tr><td> mGFP5-ER.fw </td><td> GCCTGAGGGATACGTGCAGGAGA </td></tr><tr><td> mGFP5-ER.rv </td><td> TGGCGGGTCTTGAAGTTGGCT </td></tr><tr><td> ACT2.fw </td><td> GCCATCCAAGCTGTTCTCTC </td></tr><tr><td> ACT2.rv </td><td> GCCATCCAAGCTGTTCTCTC </td></tr></tbody></table> Tabella 2. QPCR primers.

<ol><li>Efroni, I., Eshed, Y., Lifschitz, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Morphogenesis+of+Simple+and+Compound+Leaves%3A+A+Critical+Review%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">Morphogenesis of Simple and Compound Leaves: A Critical Review.</a> Plant Cell. 22, 1019-1032 (2010).</li>
<li>Kleber, R., Kehr, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+and+Quality+Assessment+of+RNA+From+Cell-Specific+Samples+Obtained+by+Laser+Microdissection%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Preparation and Quality Assessment of RNA From Cell-Specific Samples Obtained by Laser Microdissection.</a> Methods Mol. Biol. 323, 367-377 (2006).</li>
<li>Birnbaum, K., Shasha, D. E., Wang, J. Y., Jung, J. W., Lamberts, G. M., Galbraith, D. W., Benfey, P. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Gene+Expression+Map+of+the+Arabidopsis+root%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">A Gene Expression Map of the Arabidopsis root.</a> Science. 302, 1956-1960 (2003).</li>
<li>Warnasooriya, S. N., Montgomery, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Investigating+Tissue-+and+Organ-specific+Phytochrome+Responses+using+FACS-assisted+Cell-type+Specific+Expression+Profiling+in+Arabidopsis+thaliana%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Investigating Tissue- and Organ-specific Phytochrome Responses using FACS-assisted Cell-type Specific Expression Profiling in Arabidopsis thaliana.</a> J. Vis. Exp. (39), e1925(2010).</li>
<li>Beal, R. B., Henikoff, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Simple+Method+For+Gene+Expression+and+Chromatin+Profiling+of+Individual+Cell+Types+Within+a+Tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Cell%22%5BJournal%5D)">A Simple Method For Gene Expression and Chromatin Profiling of Individual Cell Types Within a Tissue.</a> Dev. Cell. 18, 1030-1040 (2010).</li>
<li>Mustroph, A., Zanetti, M. E., Jang, C. J. H., Holtan, H. E., Repetti, P. P., Galbraith, D. W., Girke, T., Bailey-Serres, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Profiling+translatomes+of+discrete+cell+populations+resolves+altered+cellular+priorities+during+hypoxia+in+Arabidopsis%5BTitle%5D)+AND+%22PNAS%22%5BJournal%5D)">Profiling translatomes of discrete cell populations resolves altered cellular priorities during hypoxia in Arabidopsis.</a> PNAS. 106, 18843-18848 (2009).</li>
<li>Brady, S. M., Orlando, D. A., Lee, J. Y., Wang, J. Y., Koch, J., Dinneny, J. R., Mace, D., Ohler, U., Benfey, P. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dominant+Root+Expression+Patterns+Revealed+in+a+High-Resolution+Spatiotemporal+Expression+Map%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Dominant Root Expression Patterns Revealed in a High-Resolution Spatiotemporal Expression Map.</a> Science. 318, 801-806 (2007).</li>
<li>Gifford, M. L., Dean, A., Gutierrez, R. A., Coruzzi, G. M., Birnbaum, K. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-specific+nitrogen+responses+mediate+developmental+plasticity%5BTitle%5D)+AND+%22PNAS%22%5BJournal%5D)">Cell-specific nitrogen responses mediate developmental plasticity.</a> PNAS. 105, 803-808 (2008).</li>
<li>Dinneny, J. R., Long, T. A., Wang, J. Y., Jung, J. W., Mace, D., Pointer, S., Barron, C., Brady, S. M., Schiefelbein, J., Benfey, P. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+identity+mediates+the+response+of+Arabidopsis+roots+to+abiotic+stress%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Cell identity mediates the response of Arabidopsis roots to abiotic stress.</a> Science. 320, 942-945 (2008).</li>
<li>Peterson, S. V., Johansson, A. I., Kowalczyk, M., Makoveychuk, A., Wang, J. Y., Moritz, T., Grebe, M., Benfey, P. N., Sandberg, G., Ljung, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+Auxin+Gradient+and+Maximum+in+the+Arabidopsis+Root+Apex+Shown+by+High-Resolution+Cell-Specific+Analysis+of+IAA+Distribution+and+Synthesis%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">An Auxin Gradient and Maximum in the Arabidopsis Root Apex Shown by High-Resolution Cell-Specific Analysis of IAA Distribution and Synthesis.</a> Plant Cell. 21, 1659-1668 (2009).</li>
<li>Yadav, R. K., Girke, T., Pasala, S., Xie, M., Reddy, G. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+expression+map+of+the+Arabidopsis+shoot+apical+meristem+stem+cell+niche%5BTitle%5D)+AND+%22PNAS%22%5BJournal%5D)">Gene expression map of the Arabidopsis shoot apical meristem stem cell niche.</a> PNAS. 106, 4941-4946 (2009).</li>
<li>Harkins, K. R., Jefferson, R. A., Kavanagh, T. A., Bevan, M. W., Galbraith, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+photosynthesis-related+gene+fusions+is+restricted+by+cell+type+in+transgenic+plants+and+in+transfected+protoplasts%5BTitle%5D)+AND+%22PNAS%22%5BJournal%5D)">Expression of photosynthesis-related gene fusions is restricted by cell type in transgenic plants and in transfected protoplasts.</a> PNAS. 87, 816-820 (1990).</li>
<li>Yang, Y., Costa, A., Leonhardt, N., Siegel, R. S., Schroeder, J. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+a+strong+Arabidopsis+guard+cell+promoter+and+it%27s+potential+as+a+research+tool%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Methods%22%5BJournal%5D)">Isolation of a strong Arabidopsis guard cell promoter and it's potential as a research tool.</a> Plant Methods. 4, 6(2008).</li>
<li>Gardner, M. J., Baker, A. J., Assie, J. -M., Poethig, R. S., Haseloff, J. P., Webb, A. A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GAL4+GFP+enhancer+trap+lines+for+analysis+of+stomatal+guard+cell+development+and+gene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Bot%22%5BJournal%5D)">GAL4 GFP enhancer trap lines for analysis of stomatal guard cell development and gene expression.</a> J. Exp. Bot. 60, 213-226 (2009).</li>
</ol>

Nessun conflitto di interessi dichiarati.

Abbiamo descritto un metodo che permette l&#39;utilizzo di piante di Arabidopsis esprimenti GFP nelle foglie per la generazione di protoplasti e cell sorting successiva utilizzando FACS. Questo metodo produce una quantità sufficiente di RNA per essere utilizzati per l&#39;amplificazione e l&#39;analisi successiva pertanto sia qPCR o microarray. Le frazioni vengono filtrate altamente arricchito per GFP contenenti cellule, come dimostrato da qPCR (Figura 2). Per ottenere rese elevate di protoplasti vivi è fondamentale lavorare rapidamente durante le fasi iniziali della procedura, fino a quando le strisce sono state foglio vuoto infiltrato con l&#39;inibitore soluzione contenente protoplasti. Inoltre, quando si genera uno strisce anta mm è molto importante per affettare o tagliare le foglie anziché &#39;chop&#39; o schiacciare, in quanto questo porta ad un danno eccessivo e quindi un rendimento inferiore protoplasti. Una differenza fondamentale tra il metodo descritto qui e publishe altrimetodi d è l&#39;uso di inibitori di RNasi e inibitori trascrizionali. Molti metodi sono stati sviluppati per radici di Arabidopsis, da cui protoplasti possono essere generate più facilmente. Tuttavia, quando si lavora con foglie, ad eccezione mesofillo, è necessario aumentare il tempo di generazione protoplasti. Pertanto è importante che tali inibitori di protezione contro i cambiamenti nell&#39;espressione genica come risultato del trattamento stesso generazione protoplasti (dati non mostrati). Tuttavia, la presenza degli inibitori porta ad una incapacità di montare una risposta trascrizione, sia attivando geni ON o OFF, che può realizzare i protoplasti più vulnerabili come questo porta ad una perdita di plasticità con cui contrastare le sollecitazioni del protoplasting procedura. Abbiamo utilizzato il metodo descritto qui con successo con un numero di linee esprimenti GFP-Arabidopsis. È importante sottolineare che abbiamo usato questo metodo con le linee che esprime GFP GFP sia fortemente inil nucleo, o molto più debolmente in modo non-localized/diffuse citosolico, come è il caso con i KC464 KC274 e linee utilizzate qui. Entrambi i tipi di linee sono compatibili con il metodo e la resa frazioni altamente arricchito di GFP-esprimenti protoplasti (Figura 2 e 3). Il metodo può essere facilmente adattato per altri fluorofori, sebbene il fluoroforo deve essere selezionato per fluorescenza che è significativamente diversa dalla autofluorescenza di cellule morte / morenti per preservare la capacità di selezionare cellule vive.

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome del reagente </td><td> Azienda </td><td> Numero di catalogo </td></tr><tr><td> Cellulasi R-10 </td><td> Melford </td><td> C8001 </td></tr><tr><td> Cellulase RS </td><td> Melford </td><td> C8003 </td></tr><tr><td> Macerozyme R-10 </td><td> Melford </td><td> M8002 </td></tr><tr><td> BSA </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> A3912 </td></tr><tr><td> ProtectRNA </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> R7397 </td></tr><tr><td> Actinomicina D </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> A1410 </td></tr><tr><td> 70 micron filtro cella </td><td> Pescatore </td><td> FB35181 </td></tr><tr><td> 50 micron Filcon tazza di tipo filtri </td><td> BD Biosciences </td><td> 340630 </td></tr></tbody></table>

cella di analisi specifica di<em&gt; arabidopsis</em&gt; foglie usando fluorescenza activated cell sorting

Cell Specific Analysis of Arabidopsis Leaves Using Fluorescence Activated Cell Sorting

Dopo l&#39;inizio del primordio fogliare, accumulo di biomassa è controllata principalmente da proliferazione cellulare ed espansione nelle foglie 1. Tuttavia, la foglia Arabidopsis è un organo complesso costituito da molti tipi cellulari diversi e strutture diverse. Allo stesso tempo, la foglia crescente contiene cellule a diversi stadi di sviluppo, con le cellule più lontane dal picciolo essere il primo a smettere espansione e sottoposti senescenza 1. Cellule diverse all&#39;interno della foglia sono quindi dividendo, allungando o differenziazione, attivo, stressati o morti, e / o rispondere agli stimoli in sotto-insiemi di loro tipo cellulare in qualsiasi momento. Questo rende lo studio genomico della sfida foglia: ad esempio, l&#39;analisi dei dati di espressione di foglie intere, i segnali provenienti dalle reti genetiche che operano in diverse zone di risposta cellulare o tipi cellulari saranno confusi, con un conseguente profilo impreciso viene generato. Per risolvere questo problema, several metodi sono stati descritti che consentono studi di espressione genica specifica cella. Questi includono la cattura microdissezione laser (LCM) 2 o piante che esprimono GFP utilizzato per la produzione di protoplasti e la successiva selezione di fluorescenza delle cellule attivate (FACS) 3,4, il sistema recentemente descritto intatto per precipitazione nucleare 5 e immunoprecipitazione di polisomi 6. FACS è stata utilizzata per un certo numero di studi, mostrando inoltre che l&#39;identità della cella e della distanza dalla punta della radice avuto un effetto significativo sui profili di espressione di un grande numero di geni 3,7. FACS di linee GFP sono stati utilizzati anche per dimostrare cellule-specifiche regolazione trascrizionale durante risposte azoto radici e lo sviluppo delle radici laterali 8, 9 sale sollecitazioni distribuzione auxina nella radice 10 e per creare una mappa genica della Arabidopsis meristema apicale 11. SebbeneFACS è stata precedentemente utilizzata per ordinare protoplasti derivati ​​foglia Arabidopsis basato su autofluorescenza 12,13, finora l&#39;uso di FACS su linee di Arabidopsis esprimenti GFP nelle foglie è stato molto limitato 4. Nella seguente protocollo si descrive un metodo per ottenere protoplasti di Arabidopsis foglia che sono compatibili con FACS minimizzando l&#39;impatto del regime generazione protoplasti. Dimostriamo il metodo utilizzando la linea KC464 Arabidopsis che esprimono GFP costrutto legato nell&#39;epidermide adaxial 14, il KC274 linea, che esprimono GFP nel tessuto vascolare 14 e la linea di Arabidopsis TP382, che esprimono un GFP doppia ad un segnale di localizzazione nucleare le cellule di guardia (dati non mostrati; Figura 2). Stiamo attualmente utilizzando questo metodo per studiare sia del tipo cellulare specifica espressione durante lo sviluppo e stress, nonché popolazioni cellulari eterogenee in diverse fasi di senescenza.

Un metodo per produrre<em&gt; Arabidopsis</em&gt; Protoplasti foglia che sono compatibili con selezione delle cellule attivate a fluorescenza (FACS), consentendo studi di specifiche popolazioni cellulari. Questo metodo è compatibile con qualsiasi<em&gt; Arabidopsis</em&gt; Riga che esprime GFP in un sottogruppo di cellule.

Cella di analisi specifica di<em&gt; Arabidopsis</em&gt; Foglie usando fluorescenza activated cell sorting

Dopo l'iniziazione del primordio fogliare, l'accumulo di biomassa è controllato principalmente dalla proliferazione e dall'espansione cellulare nelle foglie1. Tuttavia, il...

L'obiettivo generale di questa procedura è isolare una popolazione di protoplasti specifici per tipo cellulare da una foglia. Questo risultato si ottiene innanzitutto coltivando piante che esprimono GFP in tipi cellulari specifici della foglia. Il secondo passaggio consiste nel raccogliere le foglie e generare protoplasti mediante digestione enzimatica.Successivamente, i protoplasti vengono filtrati e separati mediante citometria a flusso attivata da fluorescenza (FACS). L'ultimo passaggio consiste nel confermare l'accuratezza del frazionamento mediante microscopia a fluorescenza. Infine, i protoplasti purificati possono essere utilizzati per l'analisi dell'espressione genica specifica per tipo cellulare, per analisi proteomiche o per profili metabolici.Il sorting cellulare attivato da fluorescenza è stato utilizzato con successo in precedenza per le radici, ma non per l'isolamento di cellule fogliari. L'etichettatura con GFP prima di questo metodo è stata limitata a causa dell'interferenza derivante dalla fluorescenza della clorofilla. Una dimostrazione visiva di questo metodo è fondamentale, poiché una preparazione rapida ma accurata del campione è cruciale per minimizzare i cambiamenti fisiologici estesi che possono verificarsi durante il sorting cellulare.Generalmente, le persone nuove rispetto a questo metodo incontreranno difficoltà perché non sapranno come configurare l'ordinatore cellulare né come verificare un'ordinazione accurata. Questo metodo può contribuire a rispondere a domande fondamentali nel campo della biologia sistemica delle piante. Il problema nell'identificare le reti di regolazione genica in organi multicellulari complessi come una foglia è che diversi tipi cellulari esprimono gruppi differenti di geni.Questa informazione genetica viene persa nell'analisi di raccolta di un'intera foglia che illustra la procedura. Accanto a me ci saranno Ellison As e Sanjeev Kuma, che forniscono supporto tecnico per questo lavoro nel nostro laboratorio. Per prima cosa, riempire una piastra di Petri rotonda da nove centimetri con 20 millilitri di soluzione A contenente enzimi protoplastici e inibitori della trascrizione e degli RNA.Quindi raccogliere il materiale fogliare desiderato per campioni contenenti più di una singola foglia, come il campione mostrato qui. Disporre le foglie in pile di massimo 15 foglie. Successivamente, utilizzare una lametta per tagliare le foglie in strisce larghe un millimetro.Trasferire immediatamente le strisce di foglia nella piastra di Petri utilizzando una pinzetta piatta, separare delicatamente le strisce e quindi infiltrare sotto vuoto i campioni due volte, per cinque minuti ciascuna. Successivamente, posizionare la piastra di Petri su un agitatore orbitale impostato a 90 RPM a temperatura ambiente e incubare i campioni per tre o quattro ore. Durante l'incubazione, utilizzare la pinzetta per separare le strisce di foglia l'una dall'altra a intervalli di mezz'ora.Dopo la digestione, filtrare delicatamente la soluzione di protoplasti attraverso un filtro cellulare da 70 micron in un tubo da 50 millilitri. Per rimuovere le strisce di foglia, le strisce verranno trattenute. I protoplasti passeranno attraverso il filtro.Ora utilizzare quattro millilitri di soluzione A per risciacquare delicatamente le strisce di foglia, raccogliendo il lavaggio nel tubo da 50 millilitri. Successivamente, trasferire la sospensione di protoplasti in provette con fondo rotondo e centrifugare i protoplasti per cinque minuti a 300 ×g e a temperatura ambiente. Avendo cura di non disturbare il pellet, aspirare delicatamente la maggior quantità possibile del sopranatante, quindi lavare i protoplasti con cinque millilitri di soluzione A nelle stesse condizioni di centrifugazione.Infine, dopo aver rimosso il soprannatante, utilizzare una punta tagliata di P 1000 per risospendere i PROTOPLASTI in un volume appropriato di soluzione A per l'ordinamento immediatamente prima dell'ordinamento. Utilizzare una punta non tagliata di P 1000 per disgregare eventuali aggregati nella soluzione di protoplasti. Dissociare ulteriormente le cellule filtrando i protoplasti in una provetta di prelievo attraverso un filtro in fillon da 50 micron.Quindi diluire la soluzione cellulare in modo appropriato per evitare l'occlusione del beccuccio di prelievo delle cellule. Dopo aver determinato le condizioni ottimali di prelievo cellulare, identificare i protoplasti positivi per GFP Proto utilizzando un laser Argonne a 488 nanometri, confrontando l'uscita del filtro passa-banda 580/30 con quella del filtro passa-banda 530/40. Si noti che i protoplasti positivi per GFP appariranno nella popolazione con valori elevati a 530 e bassi a 580.Con i protoplasti non GFP nella popolazione a basso 530, basso 580, i protoplasti morti o in via di morte e i detriti compaiono nella popolazione ad alto 580; per la visualizzazione dei protoplasti ordinati mediante microscopia a fluorescenza, ordinare i protoplasti direttamente in almeno otto volumi di soluzione A dopo la concentrazione; i protoplasti possono essere ordinati in otto volumi di soluzione A e raccolti per la visualizzazione al microscopio a fluorescenza al fine di verificare l'arricchimento. Questa prima immagine mostra un esempio di arricchimento della linea cellulare TP 382, che esprime GFP nelle cellule di guardia. Esempi di rese ottenute con questo metodo, sia prima che dopo l'amplificazione, sono riassunti in questa tabella.Le quantità ottenute comprese tra 500 picogrammi e 50 nanogrammi sono sufficienti per l'amplificazione mediante il sistema ovation PICO WTA e per l'analisi successiva tramite PCR quantitativa, sequenziamento di nuova generazione o microarray. Questa serie di immagini mostra diverse linee cellulari di protoplasti isolate e ordinate con il metodo appena descritto. Questi primi protoplasti sono stati ottenuti da KC 2 74, foglie di una sezione trasversale di un KC 2 74.La foglia mostra che la GFP è espressa nel sistema vascolare. Questi protoplasti sono stati isolati da foglie KC 4 64 e una sezione trasversale di una foglia KC 4 64 mostra che l'espressione della GFP si trova nell'epidermide adassiale. Infine, questi protoplasti sono stati ottenuti da foglie TP 3 82 in foglie TP 3 82.La GFP è espressa nelle cellule di guardia qui. Vengono mostrati tipici grafici a dispersione di acquisizione fax che illustrano l'output dei filtri a banda passante di 5 80 30 nanometri rispetto a quelli di 5 30 40 nanometri. Le porte di selezione mostrate sono quelle comunemente utilizzate durante l'ordinamento.Questo primo diagramma a dispersione di protoplasti derivati da foglie di coal four di protoplasti protoplastificati in assenza di inibitori mostra una singola popolazione a bassa fluorescenza a 530 e bassa a 580. Mentre questo diagramma a dispersione di protoplasti derivati da foglie di tipo selvatico di coal four protoplastificati in presenza di inibitori dimostra lo spostamento della fluorescenza a 580 che si verifica a causa dello stress e della colorazione indotti dagli inibitori. Questi diagrammi a dispersione riguardano protoplasti derivati da foglie delle linee KC seven four, KC 4 64 e TP 3 82 rispettivamente.Anche questi campioni sono stati trattati con il metodo pro in presenza di inibitori, dimostrando che la GFP è contenuta nelle popolazioni alta 530 e bassa 580. Per questo esperimento rappresentativo di PCR quantitativa, i campioni sono stati inizialmente ottenuti per ciascun tipo di frazione. I campioni sono stati quindi amplificati utilizzando il sistema ovation PICO WTA e la PCR quantitativa.È stato eseguito l'uso di primer specifici per GFP. I valori mostrati sono i più alti in rosso e i più bassi in verde; le medie o i singoli valori, normalizzati rispetto al gene di riferimento actina due, sono indicati dalle barre orizzontali gialle. I risultati confermano nuovamente le valutazioni ottiche del contenuto cellulare di GFP nelle frazioni ordinate.La popolazione alta 530 bassa 580 ha mostrato i livelli misurabili più elevati di espressione di GFP. Mentre la popolazione alta 530 alta 580 ha mostrato un'espressione di GFP circa 1000 volte inferiore, le popolazioni bassa 530 bassa 580 e bassa 530 alta 580 hanno mostrato livelli bassi di espressione di GFP paragonabili a quelli delle popolazioni di foglia intera controllo e di protoplasti non ordinati. Una volta acquisita padronanza, questa tecnica può essere eseguita in quattro-cinque ore, dalla pianta alla popolazione cellulare ordinata, se eseguita correttamente. Durante l'esecuzione di questa procedura, è importante ricordare di monitorare costantemente il citofluorimetro e di ricalibrarlo se necessario, al fine di mantenere l'accuratezza del processo di ordinamento.È stato trovato questo procedimento. Altri metodi, come l'analisi con micromatrici, possono essere eseguiti per confrontare i livelli di espressione genica in diversi tipi cellulari. Ora che questa tecnica è stata sviluppata, stiamo analizzando l'espressione genica in specifici tipi cellulari delle foglie in diverse fasi di sviluppo, e confronteremo questi dati con quelli ottenuti dalla foglia intera, generati nel progetto di agronomia.Dopo aver guardato questo video, dovresti avere una buona comprensione di come isolare singoli tipi cellulari delle foglie utilizzando la sorta cellulare attivata da fluorescenza.

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