Microscopia a fluorescenza-Screening e sequenziamento di prossima generazione: Strumenti utili per l'identificazione di geni coinvolti in organelli Integrity

Lo scopo di questo esperimento è quello di identificare il gene o i geni responsabili dell'integrità morfologica e funzionale degli organelli vegetali. Ciò si ottiene aggiungendo prima l'etel metano solfonato come agente chimico ai semi di atopia mutagena che trasportano il marcatore fluorescente dell'organello. Il secondo passo consiste nel raccogliere semi da singole piante della prima generazione mutagena per far crescere le linee della successiva generazione mutante M due.

Successivamente, i semi di mutageno a Eliana vengono osservati utilizzando un microscopio confocale o fluorescente per identificare il fenotipo organolare aberrante. Il passo finale consiste nel generare la terza generazione mutagena e confermare la presenza del fenotipo mutante. In definitiva, la mutazione recessiva può essere mappata utilizzando strumenti di sequenziamento di nuova generazione.

Una volta identificata la posizione del gene mutante, la trasformazione con il gene wild type dovrebbe ripristinare il fenotipo organolare aberrante. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel mantenimento dell'integrità morfologica e funzionale degli organelli vegetali. I metani atil, il trattamento con solfonato di semi in cima allo sta, inducono cambiamenti di temporizzazione della citosina nel genoma con conseguente citosina gwan alla tempistica.

Aggiunta di mutazioni. Il trattamento EMS è un passo fondamentale in questo protocollo per garantire una mutazione del rapporto perfetto all'interno degli individui M two. Per iniziare, ottieni semi di Arabidopsis del tipo selvatico Columbia Ecotype che sono stati precedentemente progettati per trasportare un marcatore fluorescente di organelli rilevante.

Trasferisci 0,8 grammi o circa 40.000 semi in un tubo di falco da 50 millilitri. Quindi aggiungere 25 millilitri di acqua distillata e lo 0,2% di Ethel metano solfonato. Incubare la miscela per 16 ore su un miscelatore mutante a bassa velocità dopo l'incubazione, aspirare il liquido e gettarlo in un flacone contenente un idrossido di sodio molare.

Per inattivare l'EMS, aggiungere 25 millilitri di acqua al tubo Falcon contenente i semi. Chiudere il tubo e capovolgerlo cinque volte per lavare i semi. Dopo che tutti i semi si sono depositati, aspirare l'acqua e gettarla nel pallone di idrossido di sodio a un molare.

Ripeti questa fase di lavaggio fino a 10 volte dopo il lavaggio finale, Reese trascorre i semi in una quantità minima di acqua. Procedere alla sterilizzazione dei semi aggiungendo 25 millilitri di candeggina al 10% e agitando energicamente per 30 secondi. Una volta che i semi si sono depositati sul fondo, versare la candeggina e risciacquare con 25 millilitri di acqua sterile.

Dopo aver rimosso l'acqua sterile, aggiungere 25 millilitri di etanolo al 70%. Agitare i tubi per 30 secondi e lasciare che i semi si depositino sul fondo. Versare l'etanolo e sciacquare con 25 millilitri di acqua sterile.

Ripetere il lavaggio con acqua sterile due volte. Quindi versare i semi su una capsula di Petri di plastica contenente carta da filtro da tre mm. Lascia asciugare i semi sotto il cofano dopo averli incubati per due giorni a quattro gradi Celsius.

Mettere i semi in una capsula di Petri da 150 millimetri a circa 250-300 semi per piatto in mezzo Magi e scoog medium contenente gel combattente. Come agente gelatinoso, coltiva i semi della generazione M1 su piatti per due settimane. Trapiantare le piantine nel terreno e lasciare che le piante continuino a crescere.

Dopo 30-45 giorni, le piante raggiungeranno lo stadio maturo in cui maturano, quindi le perdite possono essere viste chiaramente. A questo punto, raccogli M due semi dalle singole piante M1 per generare 1000 M indipendenti due linee. Per osservare le piantine con un microscopio confocale o a fluorescenza, coltivare 60 semi da ciascuna linea M due per sette-10 giorni su piastre di Petri di plastica a metà.

Moreish e scoog medium contenenti gel combattente crescono anche cinque piantine del controllo EMS non trattato sulla stessa piastra. Una volta che le piantine sono cresciute, montare da cinque a 10 bocchettoni con il lato del sigillo ABAC verso la lente 40 volte su un vetrino da microscopio e racchiuso con un vetrino coprioggetti sotto fluorescenza, osservare ogni oleina dalla regione corticale a quella mediale per una distribuzione subcellulare alterata del marcatore dell'organello. Dopo il trapianto di piante positive nel terreno e la crescita delle piantine come appena descritto, confermano che il fenotipo mutante è nella generazione M tre.

Rimuovere le mutazioni di fondo contaminanti attraverso il reincrocio almeno tre volte con un genoma wild type contenente il marcatore fluorescente organico desiderato, come descritto nel protocollo scritto. Per iniziare la mappatura, utilizzare il mini kit per piante cogen DN Easy Z per estrarre circa tre microgrammi di DNA genomico da M tre, che rappresenta il DNA mutante omozigote della Columbia. Invia questo DNA per l'analizzatore del genoma Illumina due 14 sequenziamento.

Il prossimo passo è quello di incrociare il mutante zago Colombia sarà Las Berger per generare l'unica progenie dopo l'autoimpollinazione in cui la combinazione può avvenire. La generazione dei denti sordi ne risulterà e alla fine servirà come una popolazione di mappatura contenente il gene di interesse, che sta causando la mutazione. Confrontando il DNA genomico di questa popolazione con il DNA genomico delle piante di tipo well, è possibile identificare la posizione della mutazione nel genoma.

Dopo la crescita delle due piante F, raccogli tra 70 e 100 F due individui che mostrano il fenotipo aberrante e lo stesso numero di F due piante con un fenotipo di tipo selvatico, raccogli un disco fogliare da ogni pianta usando un punzone intero. Il disco fogliare deve essere raccolto da foglie della stessa età. Per garantire quantità simili di DNA, i campioni possono essere elaborati per l'estrazione genomica separatamente o in gruppi.

In questo caso, è possibile raccogliere da cinque a 10 campioni per ogni provetta di orph eend in modo che ci siano meno provette da cui estrarre il DNA genomico. Usa il kit di purificazione del DNA delle foglie di pianta pura master per estrarre il DNA genomico. Il DNA genomico ottenuto da ogni campione può quindi essere quantificato con un NanoDrop.

Quindi, combinando la stessa quantità di DNA da ciascun campione fino a un totale di 300 nanogrammi, mantenendo separati i campioni mutanti e selvatici per effettuare prima la reazione di marcatura, aggiungere 60 microlitri di 2,5 x soluzione di primer casuale e 42 microlitri di acqua. Dopo aver denaturato il DNAA a una temperatura superiore a 95 gradi Celsius per 5-10 minuti, chiamare i campioni sul ghiaccio per denaturare il DNA. Aggiungere 15 microlitri di 10 X DN tps.

Miscelare con biotina DCTP e completare con tre microlitri. Glen polimerasi. Incubare i campioni per una notte a 25 gradi Celsius.

Il giorno seguente, aggiungere 15 microlitri di acetato di sodio a tre molari e 400 microlitri di etanolo freddo al 100%. Incubare i campioni misti a meno 80 gradi Celsius per un'ora dopo la centrifugazione a 20, 500 volte G per 15 minuti. Lavare il pellet con 500 microlitri di etanolo freddo al 75% dopo una seconda centrifuga.

Asciugare i pellet di DNA a 37 gradi Celsius per 10 minuti. Risospendere il pellet in 100 microlitri di acqua e utilizzare cinque microlitri per verificare la resa e la qualità su un gel bio. Le reazioni di marcatura casuale primaria sono state caricate su un gel all'1% di aros da un pool di piante selvatiche di tipo F 2 e da un pool di piante F 2 mutanti.

Come passaggio finale, inviare 95 microlitri del tipo selvatico e della reazione di marcatura mutante per l'ibridazione del gene chip arabidopsis ath one genoma array. Dopo la scansione della gomma, i file CL dot risultanti ottenuti vengono analizzati utilizzando il nostro software. Dopo aver installato il nostro software, apri il programma e incolla la stringa del bioconduttore trovata nella procedura scritta.

Quindi premere il tasto Invio, che installerà i pacchetti BIOCONDUCTOR standard dal sito Web di array, genotipizzazione e mappatura. Scarica e decomprimi i file elencati nel testo in una nuova cartella sul desktop. Rimangono i dati ottenuti dall'esperimento del chip genetico in C, L e C mutante selvatico. Ora copia i dati del chip genetico per C di tipo C e C mutante nella cartella.

Quindi, apri R per un pc. Fare clic su file, quindi su Cambia directory. Selezionare la cartella contenente i file, fare clic sull'area di lavoro di caricamento file, quindi selezionare A uno V cinque R dati aprire leggere C do R utilizzando il blocco note e copiare l'intero testo in R per un mac, fare clic su mis e quindi fare clic su cambia directory di lavoro.

Seleziona la cartella contenente i file. Fare clic sull'area di lavoro, caricare il file dell'area di lavoro e selezionare ATH uno, V, cinque, dati R. Allo stesso modo, aprire sia SFP R che MAP R utilizzando il testo, modificare e copiare il testo in R nella finestra della console.

Apparirà un messaggio per cercare i geni presso la risorsa informativa Arabidopsis o TAIR. Copia e incolla il link trovato nel testo nel browser Internet. Apparirà una finestra che chiederà di aprire o salvare il file.

Seleziona Salva. Scegli un nome per il file e allega l'estensione. Fai x ls.

Quindi fare clic su Salva. Di seguito è riportato un risultato tipico previsto. Dopo aver analizzato i dati ottenuti dal gene chip Arabidopsis H one genome array, questa figura rappresenta un esempio di mappatura della mutazione zero di Columbia utilizzando il gene chip Arabidopsis, un genoma di ibridazione H one, dove le barre orizzontali rappresentano le soglie per la rilevazione.

La mutazione in questo esempio si trova sul cromosoma uno, delimitata da barre verticali. Apri il file punto XLS per trovare le coordinate del mutante all'interno dell'area mappata. Nelle letture Illumina assemblate del genoma mutante, identificare specifiche transizioni EMS tra i polimorfismi a singolo nucleotide.

Una volta padroneggiato, l'approccio che descrive questo protocollo può essere utilizzato per mappare i geni in un breve lasso di tempo di tre volte rispetto al metodo di mappatura classico.