Microscopia a fluorescenza-Screening e sequenziamento di prossima generazione: Strumenti utili per l'identificazione di geni coinvolti in organelli Integrity

Lo scopo di questo esperimento è identificare il gene o i geni responsabili dell'integrità morfologica e funzionale degli organelli vegetali. Questo viene ottenuto innanzitutto aggiungendo il solfato di etile metano come agente chimico per indurre mutagenesi su semi atropi portatori di un marcatore fluorescente per l'organello. Il secondo passaggio consiste nel raccogliere i semi da piante singole della prima generazione mutagena per coltivare linee della successiva generazione mutante M2.

Successivamente, i semi mutagenizzati di Eliana vengono osservati mediante microscopio confocale o fluorescente per identificare il fenotipo aberrante degli organi. L'ultimo passaggio consiste nel generare la terza generazione mutagena e confermare la presenza del fenotipo mutante. In definitiva, la mutazione recessiva può essere mappata ricorrendo a strumenti di sequenziamento di nuova generazione.

Una volta identificata la posizione del gene mutato, la trasformazione con il gene di tipo selvatico dovrebbe ripristinare il fenotipo organellare aberrante. Questo metodo può contribuire a rispondere a domande fondamentali riguardo al mantenimento dell'integrità morfologica e funzionale degli organelli vegetali. Il trattamento con sulfonato di atil metano dei semi atop sta induce cambiamenti di citosina da timina nel genoma, risultando in una conversione da guanina a timina.

Aggiunta di mutazioni. Il trattamento con EMS è un passaggio fondamentale in questo protocollo per garantire un rapporto di mutazione ottimale negli individui di tipo M due. Per iniziare, ottenere semi di Arabidopsis del tipo selvatico Columbia Ecotipo che siano stati precedentemente modificati geneticamente per esprimere un marcatore fluorescente per un organulo rilevante.

Trasferire 0,8 grammi o circa 40.000 semi in un tubo falcon da 50 millilitri. Aggiungere quindi 25 millilitri di acqua distillata e 0,2% di etil metanosolfonato. Incubare la miscela per 16 ore su un agitatore per mutagenesi a bassa velocità; al termine dell'incubazione, aspirare il liquido e smaltirlo in un flacone contenente idrossido di sodio uno molare.

Per inattivare l'EMS, aggiungere 25 millilitri di acqua nel tubo Falcon contenente i semi. Chiudere il tubo e capovolgerlo cinque volte per lavare i semi. Dopo che tutti i semi si sono depositati, aspirare l'acqua e smaltirla nel matraccio contenente idrossido di sodio uno molare.

Ripetere questo passaggio di lavaggio fino a 10 volte dopo l'ultimo lavaggio, quindi trasferire i semi con il minimo quantitativo di acqua. Procedere alla sterilizzazione dei semi aggiungendo 25 millilitri di candeggina al 10% e agitando vigorosamente per 30 secondi. Una volta che i semi si saranno depositati sul fondo, versare via la candeggina e risciacquare con 25 millilitri di acqua sterile.

Dopo aver rimosso l'acqua sterile, aggiungere 25 millilitri di etanolo al 70%. Agitare i tubi per 30 secondi e lasciare sedimentare i semi sul fondo. Versare via l'etanolo e risciacquare con 25 millilitri di acqua sterile.

Ripetere il lavaggio con acqua sterile due volte. Quindi versare i semi in una piastra di Petri di plastica contenente carta da filtro da tre mm. Lasciare asciugare i semi sotto la cappa dopo averli incubati per due giorni a quattro gradi Celsius.

Posizionare i semi in una piastra di Petri da 150 millimetri con circa 250-300 semi per piastra in mezzo Magi e Scoog contenente gel di fighter. Utilizzando il gel come agente solidificante, far crescere i semi della generazione M1 su piastre per due settimane. Trapiantare le piantine nel terreno e lasciare che le piante continuino a svilupparsi.

Dopo 30-45 giorni, le piante raggiungeranno la fase matura in cui i cosiddetti "leaks" possono essere osservati chiaramente. A questo punto, raccogliere due semi M da singole piante M1 per generare 1000 linee M2 indipendenti. Per osservare le piantine mediante microscopio confocale o a fluorescenza, far crescere 60 semi per ciascuna linea M2 per un periodo di sette-dieci giorni su piastre di Petri in plastica contenenti metà.

Coltivare anche cinque piantine del controllo non trattato con EMS su una stessa piastra contenente terreno Moreish e scoog con gel di fighter. Una volta sviluppate le piantine, montare da cinque a dieci protoplasti con il lato del sigillo ABAC rivolto verso l'obiettivo 40x su un vetrino da microscopio e coprire con un coprioggetto; osservare ciascun oleina dalla regione corticale a quella mediale per rilevare alterazioni nella distribuzione subcellulare del marcatore degli organelli. Dopo il trapianto delle piante positive nel terreno e la coltivazione delle piantine come appena descritto, verificare che il fenotipo mutante sia presente nella generazione M3.

Rimuovere le mutazioni di fondo interferenti mediante incrocio ripetuto almeno tre volte con un genoma di tipo selvatico contenente il marcatore fluorescente organellare desiderato, come descritto nel protocollo scritto. Per iniziare il mappaggio, utilizzare il kit cogen DN Easy Z plant mini per estrarre circa tre microgrammi di DNA genomico da M3, che rappresenta il DNA omozigote di Columbia. Inviare questo DNA per il sequenziamento mediante Illumina genome analyzer 2 14.

Il passaggio successivo consiste nell'incrociare il mutante zago Colombia con Las Berger per generare la progenie ottenuta dopo l'autofecondazione, nella quale può verificarsi la combinazione desiderata. La generazione di piante mutanti sarà così ottenuta e servirà infine come popolazione di mappatura contenente il gene di interesse responsabile della mutazione. Confrontando il DNA genomico di questa popolazione con quello di piante di tipo selvatico, sarà possibile identificare la posizione della mutazione nel genoma.

Dopo la crescita delle piante F2, raccogliere tra 70 e 100 individui F2 che mostrano il fenotipo aberrante e lo stesso numero di piante F2 con fenotipo di tipo selvatico, prelevando un disco fogliare da ciascuna pianta mediante un perforatore circolare. Il disco fogliare deve essere prelevato da foglie della stessa età. Per garantire quantità simili di DNA, i campioni possono essere sottoposti a estrazione genomica separatamente o in gruppi.

In questo caso, è possibile raccogliere da cinque a 10 campioni per ogni provetta Eppendorf, riducendo così il numero di provette da cui deve essere estratto il DNA genomico. Utilizzare il kit di purificazione del DNA da foglie di piante Master Pure per estrarre il DNA genomico. Il DNA genomico ottenuto da ciascun campione può quindi essere quantificato mediante NanoDrop.

Quindi, combinare quantità uguali di DNA da ciascun campione fino a un totale di 300 nanogrammi, mantenendo separati i campioni mutanti e quelli di tipo selvatico per preparare la reazione di marcatura; aggiungere 60 microlitri di soluzione di primer random 2,5 x e 42 microlitri di acqua. Dopo aver denaturato il DNA a oltre 95 gradi Celsius per cinque-dieci minuti, raffreddare i campioni sul ghiaccio per denaturare il DNA. Aggiungere 15 microlitri di 10 X DN tps.

Mescolare con DCTP biotinilato e portare a volume con tre microlitri. Glen polimerasi. Incubare i campioni tutta la notte a 25 gradi Celsius.

Il giorno seguente, aggiungere 15 microlitri di acetato di sodio tre molare e 400 microlitri di etanolo freddo al 100%. Incubare i campioni miscelati a meno 80 gradi Celsius per un'ora dopo la centrifugazione a 20.500 ×g per 15 minuti. Lavare il pellet con 500 microlitri di etanolo freddo al 75% successivamente a una seconda centrifugazione.

Asciugare i pellet di DNA a 37 gradi Celsius per 10 minuti. Ri-sospendere i pellet in 100 microlitri di acqua ed utilizzare cinque microlitri per verificare resa e qualità su un gel bio. Le reazioni di marcatura casuale sono state caricate su un gel ad agarosio all'1% proveniente da un pool di piante F2 di tipo selvatico e da un pool di piante F2 mutanti.

Come passo finale, inviare 95 microlitri della reazione di marcatura del tipo selvatico e del mutante per l'ibridazione con il chip genetico Arabidopsis ATH1 Genome Array. Dopo la scansione con l'eraser, i file puntini CL risultanti ottenuti vengono analizzati utilizzando il nostro software. Dopo aver installato il nostro software, aprire il programma e incollare la stringa Bioconductor riportata nella procedura scritta.

Quindi premere il tasto Invio, che installerà i pacchetti standard di BIOCONDUCTOR dall'array, dal sito web di genotipizzazione e di mappatura. Scaricare e decomprimere i file elencati nel testo in una nuova cartella sul desktop. Mantenere i dati ottenuti dall'esperimento con il gene chip per il tipo selvatico C, L e il mutante C. Ora copiare i dati del gene chip per il tipo selvatico C e il mutante C nella cartella.

Successivamente, aprire R su un PC. Fare clic su File e quindi su Modifica directory. Selezionare la cartella contenente i file, fare clic su Carica spazio di lavoro da file, quindi selezionare A one V five R data open read C do R utilizzando il Blocco note e copiare l'intero testo in R; per un Mac, fare clic su Mis e quindi su Modifica directory di lavoro.

Selezionare la cartella contenente i file. Fare clic su workspace load workspace file e selezionare il file ATH one V five R data. Analogamente, aprire sia SFP R che MAP R utilizzando un editor di testo, copiare il testo e incollarlo nella console di R.

Apparirà un messaggio per cercare geni nella risorsa informativa sull'Arabidopsis o TAIR. Copiare e incollare il collegamento presente nel testo nel browser internet. Apparirà una finestra che chiederà di aprire o salvare il file.

Selezionare Salva. Scegliere un nome file e aggiungere l'estensione. Eseguire x ls.

Quindi fare clic su salva. Qui viene mostrato un risultato tipico previsto. Dopo l'analisi dei dati ottenuti dal chip genico Arabidopsis H one genome array, questa figura rappresenta un esempio di mappatura della mutazione Columbia zero mediante il chip genico Arabidopsis, un'ibridazione H one genome, in cui le barre orizzontali rappresentano le soglie di rilevamento.

La mutazione in questo esempio si trova sul cromosoma uno, delimitata da barre verticali. Aprire il file dot XLS per trovare le coordinate della mutazione all'interno dell'area mappata. Nelle letture assemblate del genoma mutante, identificare specifiche transizioni EMS tra i polimorfismi a singolo nucleotide.

Una volta padroneggiato l'approccio, il metodo descritto in questo protocollo può essere utilizzato per mappare geni in un periodo di tempo brevissimo rispetto al metodo classico di mappatura.