Name: Co-espressione delle proteine chimeriche fluorescenti Fusion Multiple in modo efficiente nelle piante (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-07-01T12:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 45 s
Description: Scopri un metodo efficiente per co-esprimere proteine fluorescenti chimeriche nelle piante utilizzando un singolo vettore di espressione. Questa tecnica avanzata facilita lo studio delle interazioni proteiche in vivo.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ringraziamo i membri del laboratorio Wang per utili discussioni e commenti. Questo lavoro è supportato dal National Foundation Natural Science of China (NSFC, grant No. 31570001) e Fondazione di scienze naturali della provincia di Guangdong e città di Guangzhou (concedere 201707010024 e n. 2016A030313401) di H.W.

1. primer Design strategia e amplificazione del DNA
<ol><li>Progettare il primer per clonazione molecolare dei frammenti del DNA. I primer comprendono 20 sequenze di legame specifico gene bp e 20 a 25 bp 5'-fine sbalzo sequenze, che sono la sequenza complementare sovrapposta di molecole di DNA adiacenti (Vedi tabella 1 per esempio). Nota: Il successivo assemblaggio di ogni DNA frammenti, sollevatore di cassette di espressione di diverse proteine, e integrazione con il vettore di espressione finale tutti dipendono dal riconoscimento delle sequenze sovrapposte adiacente.</li>
	<li>Amplificare i frammenti di DNA, compreso il promotore, reporter fluorescente, gene bersaglio e terminator, che sono necessari per la costruzione di cassette espressione proteina semi-indipendente di reazioni di PCR standard con i loro corrispondenti primer e di alta polimerasi di fedeltà. Nota: I modelli utilizzati in questo studio per l'amplificazione del DNA sono derivati da precedenti studi15,22,23. La temperatura di annealing e l'estensione ora le reazioni di PCR sono primer e genica dipendente.</li>
</ol>2. DNA frammento assemblaggio e costruzione di cassette di espressione della proteina
<ol><li>Esaminare la qualità dei prodotti di PCR di primo turno tramite l'elettroforesi del DNA e quantificare mediante lo spettrofotometro. Verifica se degradazione del DNA e la contaminazione si sono verificati mediante elettroforesi su gel di agarosio 1%. Il OD260/OD280 dei prodotti di PCR dovrebbe essere tra 1.6 e 1.8.</li>
	<li>Mescolare diversi frammenti di DNA (0.05 - 0.1 pmol per ogni frammento) in una nuova provetta PCR ad un volume finale di 5 µ l. Nota: Molecole di DNA Mix progettato per la stessa cassetta di espressione della proteina insieme in una provetta PCR. Evitare di mescolare DNAs da cassetta di espressione diversi insieme, poiché ridurrà l'efficienza dell'Assemblea del DNA dovuto i numeri aumentanti di molecole di DNA che devono essere collegati. Nota: Il protocollo può essere messo in pausa qui.</li>
	<li>Preparare buffer stock x ISO 5: 500 mM Tris-HCl, pH 7.5; 50 mM MgCl2; 1 mM deossinucleotidi (dNTP); 50 mM dithiothreitol; 25% di polietilenglicole (PEG) 8000; e 5mm nicotinamide adenina dinucleotide (NAD).</li>
	<li>Fare 1 mL 2 x master composto da 400 µ l 5 x buffer stock ISO, 7,5 unità di T5 esonucleasi, 62,5 unità di alta fedeltà della polimerasi del DNA, 5.000 unità di Taq polimerasi (Vedi Tabella materiali), e sterilizzato doppio distillato H2O. Nota: Questo è adattato da precedenti studi24,25,26; questi volumi dovrebbero essere ottimizzati.</li>
	<li>Aliquotare e 100 µ l di 2 x master miscela per tubo e conservare a-20 ° C. Attenzione: Frequenti di congelamento e scongelamento 2 miscela master x può causare bassa efficienza di assemblaggio di DNA.</li>
	<li>Aggiungere 15 µ l di 2 x master miscela al 5 µ l DNA composto e incubare a 50 ° C per 60 min.</li>
</ol>3. costruzione del vettore per la co-espressione delle proteine chimeriche fluorescenti Fusion Multiple nelle piante
<ol><li>Amplificare la cassetta di espressione intera proteina semi-indipendente di un secondo turno PCR utilizzando il prodotto (0,5 - 1,0 µ l) dalla reazione isotermica Assemblea primo turno come il modello e i primer più esterno (ad es., 1-FP35S e 1-RNOS per espressione cassetta 1).<ol>
<li>Uso 1 unità della polimerasi di alta fedeltà in un volume di reazione di 50 µ l seguita da 30 cicli (94 ° C per 30 s, 55 ° C per 30 s e 68 ° C per 2 min), seguito da un'estensione finale a 68 ° C per 5 min.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Linearizzare la proteina finale espressione spina dorsale vettori pUC18 e pCAMBIA1300, che sono progettati per espressione transitoria della proteina e trasformazione genetica, rispettivamente, con l'aggiunta di 4 unità Sma ho in un volume di reazione finale di 10 µ l e incubare per 1 - 2 ore a 25 ° C. Inattivare l'enzima di restrizione incubando a 65 ° C per 20 min.</li>
	<li>Mix di molecole di DNA equimolare di cassette di espressione della proteina e vettore linearizzato finale in un volume di reazione finale di 5 µ l. Quindi, eseguire la ricombinazione del DNA secondo turno mescolando con 15 µ l 2 x master buffer e incubando a 50 ° C per 60 min.</li>
	<li>Utilizzare i prodotti finali della reazione isotermica ricombinazione secondo turno per trasformare competente Escherichia coli cellule (ad es., DH5α) secondo le procedure standard27. Doppio controllo colonie positive di sequenziamento del DNA e di PCR di Colonia. Estrarre i plasmidi positivi da e. coli utilizzando un kit di estrazione mini plasmide e conservare a-80 ° C. Attenzione: Per l'archiviazione a lungo termine, plasmidi disciolto in buffer di TE o doppio distillata H2O sono più stabili di tenerli in ceppi di Escherichia coli .</li>
</ol>4. Biobalistica-bombardamento mediata transitoria co-espressione delle proteine chimeriche fluorescenti Fusion Multiple nelle piante
<ol><li>Preparare il tabacco BY-2 cellule in sospensione e giovanile piante di Arabidopsis per il bombardamento.<ol>
<li>Cultura BY-2 cellule in medium di Murashige e Skoog (MS) con subcoltura due volte alla settimana a 25 ° C in un agitatore a 130 rpm. Filtrare le cellule BY-2 raccogliere 30 mL 3 d coltivate su un pezzo di carta da filtro in autoclave-70mm tramite una pompa di vuoto impostando la pressione di vuoto a 40 mbar.</li>
		<li>Al fine di impedire alle cellule di asciugarsi durante la procedura seguente, aggiungere qualche goccia di terreno cultura liquido di BY-2 delle cellule in una capsula Petri prima di mettere la carta da filtro (passo successivo).</li>
		<li>Trasferire la carta da filtro con le cellule BY-2 su di esso una nuova capsula Petri (85 mm x 15 mm).</li>
		<li>Superficie sterilizzare semi di Arabidopsis thaliana (Col-0) nel Vortex una miscela con etanolo al 70% (v/v) contenente 0,05% Tween 20 per 10 min.</li>
		<li>Rotazione verso il basso i semi utilizzando una centrifuga superiore panchina a velocità max per 2 s, eliminare il surnatante e lavare i semi con etanolo al 100% una volta per 30 s. pipetta fuori i semi su una nuova carta da filtro sterile in una cappa sterile. Quindi, asciugare i semi e spargerli su piastre di agar ½ MS.</li>
		<li>Conservare le piastre a 4 ° C per 48 ore prima del loro trasferimento in una camera di crescita della pianta con le seguenti impostazioni: 16 h chiaro scuro 8h baseaintensitàmoderata 120-150 µm m-2 s-1 , 22 ° C.
</li>
		<li>Trasferire 7 - giorno vecchie piante di campione in un cerchio del diametro di 30 mm al centro di un nuovo piatto medio ½ MS per aumentare l'efficienza di bombardamento. Attenzione: Evitare di sovrapporre le piante durante il trasferimento e metterli sulla piastra di nuovo ½ MS.</li>
		<li>Aggiungere qualche goccia di ½ MS mezzo liquido sulla superficie delle piante o dei tessuti per preservare l'umidità ed evitare di seccare le piante fuori durante la procedura seguente.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Cappotto di particelle d'oro con DNA plasmidico.<ol>
<li>Vortice microcarrier oro soluzione accuratamente, per un minimo di 3 preparare una nuova provetta da 1,5 mL.</li>
		<li>Aggiungere in sequenza le seguenti soluzioni nel tubo e vortice: 25 µ l (1,5 mg) oro particelle, vortice 10 s; 10 µ l di spermidina 25,46 mg/L, vortice 10 s; 5 µ l di DNA plasmidico di 1 µ g / µ l, vortex 3 min; 25 µ l di soluzione di CaCl2 277,5 mg/L, vortex 1 min. Attenzione: Tenere Vortex durante questo passaggio.</li>
		<li>Rotazione verso il basso il microcarriers oro utilizzando una centrifuga superiore panchina a velocità max per 5 s e attentamente pipetta fuori il sopranatante senza disturbare il pellet. Lavare con 200 µ l di etanolo assoluto e risospendere il pellet Vortex per 5-10 s. Spin giù alla massima velocità per 5 s e Rimuovi l'etanolo.</li>
		<li>Risospendere le particelle d'oro in 18 µ l di etanolo assoluto e aliquota 6 sospensione di particelle di µ l in mezzo di tre macrocarriers. Lasciarli asciugare all'aria.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Trasferimento del DNA nelle piante tramite bombardamento di particelle.<ol>
<li>Impostare il sistema di consegna di particelle come segue: 1100 psi, 28 mm Hg vuoto, 1 cm di distanza e distanza di volo delle particelle 9 cm.</li>
		<li>Bombardare le cellule/piante sulla piastra agar media per tre volte in tre posizioni diverse e quindi mantenere le cellule/piante buio immediatamente dopo il bombardamento. Attenzione: Indossare occhiali di sicurezza durante il funzionamento il sistema di consegna delle particelle a causa dell'associazione di gas ad alta pressione e particelle ad alta velocità con il sistema.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Mantenere bombardate cellule/piante al buio nella camera di crescita di pianta per 6 a 72 ore prima dell'osservazione dei segnali fluorescenti. La camera di crescita di pianta impostata 24h scuro e 22 ° C. Attenzione: L'efficienza di espressione e l'intensità del segnale fluorescente sono promotore-, gene- e pianta/tessuto-dipendente.</li>
</ol>5. generazione di Arabidopsis transgenico stabile cheesprimono più proteine chimeriche fluorescenti da Agrobacterium-mediata trasformazione.
<ol><li>Scongelare le cellule competenti di Agrobacterium (PMP90) sul ghiaccio e aspettare 30 minuti, quindi aggiungere 2 µ l vettore binario (100-200 ng) (preparato in precedenza) nelle cellule competenti. Sedersi la miscela sul ghiaccio per 10 min.</li>
	<li>Trasferire il composto in una cuvetta di elettroporazione pre-refrigerati 0,1 cm. Inserire la provetta nel sistema di elettroporazione ed eseguire elettroporazione con le seguenti impostazioni: 1.6 kV, 600 ohm, 25 µF.</li>
	<li>Aggiungere 1 mL di terreno liquido SOC nella cuvetta immediatamente dopo l'elettroporazione, dispensare le cellule in una nuova provetta da 1,5 mL e incubare a 28 ° C in un agitatore orbitale orizzontale a 200 giri/min per 120 min.</li>
	<li>Centrifugare le cellule a 2.348 x g a temperatura ambiente per 5 min, scartare la maggior parte del surnatante, delicatamente risospendere le cellule pellettate con una pipetta, allarga le gambe su un piatto LB contenenti 50 mg/L igromicina B e incubare a 28 ° C per 2-3 giorni.</li>
	<li>Trasformare piante Col-0 Arabidopsis thaliana con l' agrobatterio, che contiene il vettore binario pCAMBIA1300 integrato con cassette più espressione di una proteina, mediante il metodo di28 floreale dip come descritto in precedenza per generare piante transgeniche stabile.</li>
	<li>Sterilizzare la superficie dei semi transgenici Arabidopsis mescolandole con etanolo al 70% (v/v) contenente 0,05% Tween 20. Vortexare per 10 min. Spin giù i semi utilizzando una centrifuga superiore panchina a velocità max per 2 s, eliminare il surnatante e lavare i semi con etanolo al 100% una volta per 30 s.</li>
	<li>Pipettare i semi su una carta da filtro sterile in una cappa sterile. Da allora in poi, aria secca e spargerli sulle piastre di agar ½ MS contenente Hygromycin B per lo screening positivi progenie.</li>
	<li>Incubare le piastre a 4 ° C per 2 giorni. Poi, trasferirli nella camera di crescita della pianta e nella cultura per 7 giorni.</li>
	<li>7 - giorno-vecchio sopravvivenza giovanile piante selezionate controllando per segnali fluorescenti sotto il microscopio a fluorescenza, quindi trasferire le piante nel terreno per ulteriori controlli di piante omozigoti.</li>
</ol>6. trattamenti farmaceutici
<ol><li>Per trattamenti farmaceutici, diluire ogni droga nel mezzo liquido di MS per le concentrazioni adeguate di lavoro prima dell'incubazione con le cellule o piante.<ol>
<li>Wortmannin trattamento: preparare 1 mM soluzioni di riserva di wortmannin sciogliendo wortmannin polvere in DMSO e conservare le scorte a-20 ° C. Trasferire cellule vegetali o piante giovanile nel liquido di coltura MS contenente 16,5 µM wortmammin ed incubare per 30-45 min prima di formazione immagine.</li>
		<li>Trattamento di brefeldina A (BFA): preparare 1 mM soluzioni di riserva di BFA sciogliendo polvere BFA in DMSO e conservare le scorte a-20 ° C. Trasferire cellule vegetali o piante giovanile nel liquido di coltura MS contenente 10 µ g/mL BFA per 30-45 min prima di formazione immagine.</li>
	</ol>
</li>
</ol>7. analisi di co-localizzazione subcellulare microscopio confocale Imaging e proteina
<ol><li>Trasferire le piante giovanile o cellule in sospensione su una lastra di vetro convenzionale e delicatamente messo una diapositiva di copertina in alto a sinistra per l'imaging da standard a scansione laser confocale. Utilizzare le seguenti impostazioni: 63 X acqua obiettivo (Nardi 1.4), sfondo 0, guadagno 700, dimensione pixel 0,168 mm e fotomoltiplicatore tubo rivelatore. Eccitare GFP-etichettato proteine a 485 nm e rilevare la fluorescenza a 525 nm. Per proteine RFP-etichettate, eccitare a 514 nm e rilevare a 575 nm.</li>
	<li>Calcolare il rapporto di co-localizzazione dei segnali fluorescenti utilizzando software Image J (https://imagej.nih.gov/ij/) con il plug-in come descritto in precedenza8co-localizzazione Pearson-Spearman correlazione (PSC). Coefficienti di correlazione di Pearson o coefficienti di correlazione di Spearman rank sono mostrati nei risultati (Figura 4). I valori di r prodotte saranno da -1 a 1. 0 non dimostra nessun rilevabile correlazione di due segnali, mentre + 1 e -1 mostrano correlazione completa positiva e negativa, rispettivamente, di due segnali.</li>
</ol>

<ol><li>Tsien, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+green+fluorescent+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Biochem%22%5BJournal%5D)">The green fluorescent protein.</a> Annu Rev Biochem. 67, 509-544 (1998).</li>
<li>Tsien, R. Y., Miyawaki, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Seeing+the+machinery+of+live+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Seeing the machinery of live cells.</a> Science. 280 (5371), 1954-1955 (1998).</li>
<li>Wang, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualizing+Plant+Cells+in+a+Brand+New+Way%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Plant%22%5BJournal%5D)">Visualizing Plant Cells in a Brand New Way.</a> Mol Plant. 9 (5), 633-635 (2016).</li>
<li>Zhang, J., Campbell, R. E., Ting, A. Y., Tsien, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Creating+new+fluorescent+probes+for+cell+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Creating new fluorescent probes for cell biology.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 3 (12), 906-918 (2002).</li>
<li>Lippincott-Schwartz, J., Snapp, E., Kenworthy, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Studying+protein+dynamics+in+living+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Studying protein dynamics in living cells.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 2 (6), 444-456 (2001).</li>
<li>Tse, Y. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+multivesicular+bodies+as+prevacuolar+compartments+in+Nicotiana+tabacum+BY-2+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">Identification of multivesicular bodies as prevacuolar compartments in Nicotiana tabacum BY-2 cells.</a> Plant Cell. 16 (3), 672-693 (2004).</li>
<li>Wang, H., Zhuang, X., Cai, Y., Cheung, A. Y., Jiang, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Apical+F-actin-regulated+exocytic+targeting+of+NtPPME1+is+essential+for+construction+and+rigidity+of+the+pollen+tube+cell+wall%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+J%22%5BJournal%5D)">Apical F-actin-regulated exocytic targeting of NtPPME1 is essential for construction and rigidity of the pollen tube cell wall.</a> Plant J. 76 (3), 367-379 (2013).</li>
<li>Wang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Distinct+Pathway+for+Polar+Exocytosis+in+Plant+Cell+Wall+Formation%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiol%22%5BJournal%5D)">A Distinct Pathway for Polar Exocytosis in Plant Cell Wall Formation.</a> Plant Physiol. 172 (2), 1003-1018 (2016).</li>
<li>Canto, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transient+Expression+Systems+in+Plants%3A+Potentialities+and+Constraints%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Exp+Med+Biol%22%5BJournal%5D)">Transient Expression Systems in Plants: Potentialities and Constraints.</a> Adv Exp Med Biol. 896, 287-301 (2016).</li>
<li>Ishida, Y., Hiei, Y., Komari, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Agrobacterium-mediated+transformation+of+maize%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Agrobacterium-mediated transformation of maize.</a> Nat Protoc. 2 (7), 1614-1621 (2007).</li>
<li>Li, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimization+of+agrobacterium-mediated+transformation+in+soybean%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Plant+Sci%22%5BJournal%5D)">Optimization of agrobacterium-mediated transformation in soybean.</a> Front Plant Sci. 8, 246(2017).</li>
<li>Manavella, P. A., Chan, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transient+transformation+of+sunflower+leaf+discs+via+an+Agrobacterium-mediated+method%3A+applications+for+gene+expression+and+silencing+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Transient transformation of sunflower leaf discs via an Agrobacterium-mediated method: applications for gene expression and silencing studies.</a> Nat Protoc. 4 (11), 1699-1707 (2009).</li>
<li>Martin, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transient+expression+in+Nicotiana+benthamiana+fluorescent+marker+lines+provides+enhanced+definition+of+protein+localization%2C+movement+and+interactions+in+planta%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+J%22%5BJournal%5D)">Transient expression in Nicotiana benthamiana fluorescent marker lines provides enhanced definition of protein localization, movement and interactions in planta.</a> Plant J. 59 (1), 150-162 (2009).</li>
<li>Miao, Y., Jiang, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transient+expression+of+fluorescent+fusion+proteins+in+protoplasts+of+suspension+cultured+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Transient expression of fluorescent fusion proteins in protoplasts of suspension cultured cells.</a> Nat Protoc. 2 (10), 2348-2353 (2007).</li>
<li>Wang, H., Jiang, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transient+expression+and+analysis+of+fluorescent+reporter+proteins+in+plant+pollen+tubes%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Transient expression and analysis of fluorescent reporter proteins in plant pollen tubes.</a> Nat Protoc. 6 (4), 419-426 (2011).</li>
<li>Yoo, S. D., Cho, Y. H., Sheen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Arabidopsis+mesophyll+protoplasts%3A+A+versatile+cell+system+for+transient+gene+expression+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Arabidopsis mesophyll protoplasts: A versatile cell system for transient gene expression analysis.</a> Nat Protoc. 2 (7), 1565-1572 (2007).</li>
<li>Candat, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Experimental+determination+of+organelle+targeting-peptide+cleavage+sites+using+transient+expression+of+green+fluorescent+protein+translational+fusions%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Biochem%22%5BJournal%5D)">Experimental determination of organelle targeting-peptide cleavage sites using transient expression of green fluorescent protein translational fusions.</a> Anal Biochem. 434 (1), 44-51 (2013).</li>
<li>Giepmans, B. N., Adams, S. R., Ellisman, M. H., Tsien, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+fluorescent+toolbox+for+assessing+protein+location+and+function%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">The fluorescent toolbox for assessing protein location and function.</a> Science. 312 (5771), 217-224 (2006).</li>
<li>Binder, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+modular+plasmid+assembly+kit+for+multigene+expression%2C+gene+silencing+and+silencing+rescue+in+plants%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">A modular plasmid assembly kit for multigene expression, gene silencing and silencing rescue in plants.</a> PLoS One. 9 (2), e88218(2014).</li>
<li>Engler, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+golden+gate+modular+cloning+toolbox+for+plants%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Synth+Biol%22%5BJournal%5D)">A golden gate modular cloning toolbox for plants.</a> ACS Synth Biol. 3 (11), 839-843 (2014).</li>
<li>Forner, J., Binder, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+red+fluorescent+protein+eqFP611%3A+Application+in+subcellular+localization+studies+in+higher+plants%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Plant+Biol%22%5BJournal%5D)">The red fluorescent protein eqFP611: Application in subcellular localization studies in higher plants.</a> BMC Plant Biol. 7, 28(2007).</li>
<li>Wang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vacuolar+sorting+receptors+%28VSRs%29+and+secretory+carrier+membrane+proteins+%28SCAMPs%29+are+essential+for+pollen+tube+growth%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+J%22%5BJournal%5D)">Vacuolar sorting receptors (VSRs) and secretory carrier membrane proteins (SCAMPs) are essential for pollen tube growth.</a> Plant J. 61 (5), 826-838 (2010).</li>
<li>Wang, H., Zhuang, X. H., Hillmer, S., Robinson, D. G., Jiang, L. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vacuolar+sorting+receptor+%28VSR%29+proteins+reach+the+plasma+membrane+in+germinating+pollen+tubes%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Plant%22%5BJournal%5D)">Vacuolar sorting receptor (VSR) proteins reach the plasma membrane in germinating pollen tubes.</a> Mol Plant. 4 (5), 845-853 (2011).</li>
<li>Chen, W. X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+in+vitro+splicing+of+coding+sequences+from+genomic+DNA+by+isothermal+recombination+reaction-based+PCR%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnology+%26+Biotechnological+Equipment%22%5BJournal%5D)">Rapid in vitro splicing of coding sequences from genomic DNA by isothermal recombination reaction-based PCR.</a> Biotechnology & Biotechnological Equipment. 30 (5), 864-868 (2016).</li>
<li>Zhu, Q. L., Yang, Z. F., Zhang, Q. Y., Chen, L. T., Liu, Y. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Robust+multi-type+plasmid+modifications+based+on+isothermal+in+vitro+recombination%5BTitle%5D)+AND+%22Gene%22%5BJournal%5D)">Robust multi-type plasmid modifications based on isothermal in vitro recombination.</a> Gene. 548 (1), 39-42 (2014).</li>
<li>Torella, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+construction+of+insulated+genetic+circuits+via+synthetic+sequence-guided+isothermal+assembly%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Rapid construction of insulated genetic circuits via synthetic sequence-guided isothermal assembly.</a> Nucleic Acids Res. 42 (1), 681-689 (2014).</li>
<li>Siguret, V., Ribba, A. S., Cherel, G., Meyer, D., Pietu, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+plasmid+size+on+transformation+efficiency+by+electroporation+of+Escherichia+coli+DH5+alpha%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">Effect of plasmid size on transformation efficiency by electroporation of Escherichia coli DH5 alpha.</a> Biotechniques. 16 (3), 422-426 (1994).</li>
<li>Zhang, X., Henriques, R., Lin, S. S., Niu, Q. W., Chua, N. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Agrobacterium-mediated+transformation+of+Arabidopsis+thaliana+using+the+floral+dip+method%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Agrobacterium-mediated transformation of Arabidopsis thaliana using the floral dip method.</a> Nat Protoc. 1 (2), 641-646 (2006).</li>
<li>Lam, S. K., Cai, Y., Hillmer, S., Robinson, D. G., Jiang, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SCAMPs+highlight+the+developing+cell+plate+during+cytokinesis+in+tobacco+BY-2+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiol%22%5BJournal%5D)">SCAMPs highlight the developing cell plate during cytokinesis in tobacco BY-2 cells.</a> Plant Physiol. 147 (4), 1637-1645 (2008).</li>
<li>Lam, S. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rice+SCAMP1+defines+clathrin-coated%2C+trans-golgi-located+tubular-vesicular+structures+as+an+early+endosome+in+tobacco+BY-2+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">Rice SCAMP1 defines clathrin-coated, trans-golgi-located tubular-vesicular structures as an early endosome in tobacco BY-2 cells.</a> Plant Cell. 19 (1), 296-319 (2007).</li>
<li>Jiang, L., Rogers, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integral+membrane+protein+sorting+to+vacuoles+in+plant+cells%3A+evidence+for+two+pathways%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Integral membrane protein sorting to vacuoles in plant cells: evidence for two pathways.</a> J Cell Biol. 143 (5), 1183-1199 (1998).</li>
<li>Fernandez-Abalos, J. M., Fox, H., Pitt, C., Wells, B., Doonan, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plant-adapted+green+fluorescent+protein+is+a+versatile+vital+reporter+for+gene+expression%2C+protein+localization+and+mitosis+in+the+filamentous+fungus%2C+Aspergillus+nidulans%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Plant-adapted green fluorescent protein is a versatile vital reporter for gene expression, protein localization and mitosis in the filamentous fungus, Aspergillus nidulans.</a> Mol Microbiol. 27 (1), 121-130 (1998).</li>
<li>Bruening, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plant+gene+silencing+regularized%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Plant gene silencing regularized.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 95 (23), 13349-13351 (1998).</li>
<li>Wassenegger, M., Pelissier, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+model+for+RNA-mediated+gene+silencing+in+higher+plants%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">A model for RNA-mediated gene silencing in higher plants.</a> Plant Mol Biol. 37 (2), 349-362 (1998).</li>
<li>Dehio, C., Schell, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+plant+genetic+loci+involved+in+a+posttranscriptional+mechanism+for+meiotically+reversible+transgene+silencing%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Identification of plant genetic loci involved in a posttranscriptional mechanism for meiotically reversible transgene silencing.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 91 (12), 5538-5542 (1994).</li>
<li>Zhong, G., Zhu, Q., Li, Y., Liu, Y., Wang, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Once+for+all%3A+A+novel+robust+system+for+co-expression+of+multiple+chimeric+fluorescent+fusion+proteins+in+plants%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Plant+Sci%22%5BJournal%5D)">Once for all: A novel robust system for co-expression of multiple chimeric fluorescent fusion proteins in plants.</a> Front Plant Sci. 8, 1071(2017).</li>
<li>Li, X. T., Xie, Y. Y., Zhu, Q. L., Liu, Y. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+genome+editing+in+genes+and+cis-regulatory+regions+improves+qualitative+and+quantitative+traits+in+crops%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Plant%22%5BJournal%5D)">Targeted genome editing in genes and cis-regulatory regions improves qualitative and quantitative traits in crops.</a> Molecular Plant. 10 (11), 1368-1370 (2017).</li>
<li>Zhu, Q. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+%26%2334%3Bpurple+endosperm+rice%27%27+by+engineering+anthocyanin+biosynthesis+in+the+endosperm+with+a+high-efficiency+transgene+stacking+system%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Plant%22%5BJournal%5D)">Development of &#34;purple endosperm rice'' by engineering anthocyanin biosynthesis in the endosperm with a high-efficiency transgene stacking system.</a> Molecular Plant. 10 (7), 918-929 (2017).</li>
<li>Tang, H. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multi-step+formation%2C+evolution%2C+and+functionalization+of+new+cytoplasmic+male+sterility+genes+in+the+plant+mitochondrial+genomes%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Research%22%5BJournal%5D)">Multi-step formation, evolution, and functionalization of new cytoplasmic male sterility genes in the plant mitochondrial genomes.</a> Cell Research. 27 (1), 130-146 (2017).</li>
</ol>

Gli autori non hanno nulla a rivelare.

Qui abbiamo dimostrato un metodo novello per robustamente co-esprimono proteine chimeriche fluorescenti fusione nelle piante. Esso può essere utilizzato per l'espressione transitoria e la trasformazione genetica ed è compatibile con corrente fluorescenti su base proteica bio-imaging, molecolari e biochimici applicazioni e tecnologie9,10,13 . Inoltre, essa supera le difficoltà dei metodi convenzionali che utilizzano diversi plasm...

Proteine chimeriche fluorescenti fusione sono stati considerati come strumenti utili per studiare dinamiche intracellulare e della localizzazione subcellulare e comprendere ulteriormente le loro funzioni fisiologiche e lavoro meccanismi1,2, 3 , 4. è particolarmente utile per proteine di reporter ben noto organello co-express con la proteina in questione per illustrare meglio il suo spatiotemporal rationale, distribuzione e funzioni all'interno del sistema di endomembrane in cellule4 , 5 , 6 , 7 , 8.
Una proteina di fusione fluorescenti chimerico può essere espresso in piante tramite espressione transiente e stabile trasformazione genetica, che hanno i loro rispettivi vantaggi e limitazioni9,10,11. L'espressione transitoria di una proteina è un approccio conveniente che comprende Biobalistica bombardamento-, polietilenglicole (PEG)-, o elettroporazione-mediata DNA espressione transiente in protoplasti e Agrobacterium-mediata infiltrazione di foglia in cellule vegetali intatto, come mostrato in Figura 1A, B12,13,14,15,16. Tuttavia, la co-espressione delle proteine chimeriche fluorescenti fusione multiple in una cella singola pianta richiede una miscela di diversi plasmidi di espressione indipendente. Così, gli svantaggi di impiegare più plasmidi per la co-espressione della proteina nelle piante sono più bassi livelli di co-espressione dovuto drasticamente riducono il rischio di diversi plasmidi entrano contemporaneamente le stesse cellule rispetto ad un plasmide singolo e la variazioni dei livelli di espressione della proteina causati dalla quantità incontrollabile casuale di ogni tipi di plasmide viene trasferito nella cella17,18. Inoltre, è tecnicamente impegnativo per introdurre diversi plasmidi di espressione indipendente in un singolo Agrobacterium per proteina co-espressione9,10,11. Di conseguenza, Agrobacterium-mediata della proteina espressione transitoria da infiltrazione del tabacco lascia solo è capace di esprimere un plasmide in un momento, come mostrato in Figura 1B. Al contrario, generazione di piante transgeniche che esprimono le proteine di fusione fluorescente viene solitamente ottenuta da Agrobacterium che trasporta un vettore di trasformazione binario. Tuttavia, il vettore binario che media il trasferimento genico e inserimento nei genomi delle piante è solo capace di esprimere una singola fusione fluorescenti della proteina (Figura 1B)9,10,12. La generazione di una pianta transgenica che esprime contemporaneamente diverse proteine chimeriche fluorescenti richiede più cicli di incrocio genetico e selezione, che può durare da mesi ad anni in base ai numeri dei geni di essere co-espressi.
L'occupazione di che un vettore di espressione singola per co-espressione delle proteine multiple in pianta è stato segnalato da alcuni precedenti studi19,20,21. Tuttavia, vari cicli di digestione enzimatica e legatura del DNA di molecole di DNA e vettori di spina dorsale sono solitamente richiesti per la generazione del plasmide finale per co-espressione della proteina o sovra-espressione. Qui, abbiamo sviluppato un metodo nuovo e robusto per cheesprimono più proteine chimeriche fluorescenti nelle piante. È un metodo altamente efficiente e conveniente che raggiunge più co-espressione della proteina nelle piante per sia l'espressione transitoria e trasformazione stabile in maniera "classica". Impiega un singolo vettore che contiene più cassette di espressione di proteine funzionalmente indipendente per co-espressione della proteina e quindi sormonta gli svantaggi dei metodi convenzionali. Inoltre, è un sistema altamente versatile nel cui DNA manipolazioni e l'assemblaggio vengono raggiunti da una reazione di uno stadio semplice ottimizzato senza passaggi aggiuntivi di digestione del DNA e la legatura. Il principio di funzionamento è illustrato nella Figura 2. Inoltre, è pienamente compatibile con approcci attuali cellulari, biochimici e molecolari che sono basati su proteine chimeriche fluorescenti fusione.

<table><tbody><tr><td>KOD-FX Polimerasi</td><td>TOYOBO</td><td>KFX-101</td><td></td></tr><tr><td>Sma I</td><td>NEB</td><td>R0141L/S/V</td><td></td></tr><tr><td>Tris-HCl</td><td>BBI</td><td>A600194-0500</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>BBI</td><td>A601336-0500</td><td></td></tr><tr><td>dNTP</td><td>NEB</td><td>#N0447V</td><td></td></tr><tr><td>DTT</td><td>BBI</td><td>C4H10O2S2</td><td></td></tr><tr><td>PEG 8000</td><td>BBI</td><td>A100159-0500</td><td></td></tr><tr><td>NAD</td><td>BBI</td><td>A600641-0001</td><td></td></tr><tr><td>Esonucleasi T5</td><td>Epicentro</td><td>T5E4111K</td><td></td></tr><tr><td>Phusion DNA polimerasi ad alta fedeltà</td><td>NEB</td><td>M0530S</td><td></td></tr><tr><td>Taq DNA polimerasi</td><td>NEB</td><td>B9022S</td><td></td></tr><tr><td>Murashige e Skoog Miscela di sali basali (MS)</td><td>Sigma</td><td>M5524</td><td></td></tr><tr><td>Etanolo</td><td>BBI</td><td>A500737-0500</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>BBI</td><td>A600560-0500</td><td></td></tr><tr><td>Agar</td><td>BBI</td><td>A505255-0250</td><td></td></tr><tr><td>Spermidina</td><td>BBI</td><td>A614270-0001</td><td></td></tr><tr><td>Particelle microcarrier d'oro</td><td>Bio-Rad</td><td>165-2263</td><td>1.0 &; m</td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>BBI</td><td>CD0050-500</td><td></td></tr><tr><td>Macrocarrier</td><td>Bio-Rad</td><td>165-2335</td><td></td></tr><tr><td>Disco di rottura</td><td>Bio-Rad</td><td>165-2329</td><td></td></tr><tr><td>Schermo di arresto</td><td>Bio-Rad</td><td>165-2336</td><td></td></tr><tr><td>Triptone</td><td>OXOID</td><td>LP0042</td><td></td></tr><tr><td>Estratto di lievito</td><td>OXOID</td><td>LP0021</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>BBI</td><td>A610476-0001</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>BBI</td><td>A610440-0500</td><td></td></tr><tr><td>Glucosio</td><td>BBI</td><td>A600219-0001</td><td></td></tr><tr><td>Igromicina B</td><td>Genview</td><td>AH169-1G</td><td></td></tr><tr><td>Wortmannin</td><td>Sigma</td><td>F9128</td><td></td></tr><tr><td>Brefeldin A</td><td>Sigma</td><td>SML0975-5MG</td><td></td></tr><tr><td>Dimetilsolfato (DMSO)</td><td>BBI</td><td>A600163-0500</td><td></td></tr><tr><td>T100 Termociclatore</td><td>Bio-Rad</td><td>1861096</td><td></td></tr><tr><td>Camera di crescita</td><td>Panasonic</td><td>MLR-352H-PC</td><td></td></tr><tr><td>PSD-1000/He Sistema di erogazione di particelle</td><td>Bio-Rad</td><td>165-2257</td><td></td></tr><tr><td>Gene Pulser</td><td>Bio-Rad</td><td>1652660</td><td></td></tr><tr><td>Cuvette</td><td>Bio-Rad</td><td>1652083</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuga da banco</td><td>Eppendorf</td><td>5427000097</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio confocale</td><td>Zeiss</td><td></td><td>LSM 7 DUO (780& Spettrofotometri 7Live)</td></tr><tr><td>NanoDrop 2000/2000c</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>ND-2000</td><td></td></tr><tr><td>EPS-300 Alimentatore</td><td>Tanon</td><td>EPS 300</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio fluorescente</td><td>Mshot</td><td>MF30</td><td></td></tr><tr><td>Agrose</td><td>BBI</td><td>A600234</td><td></td></tr><tr><td>Ampicillina</td><td>BBI</td><td>A100339</td><td></td></tr><tr><td>Etilene diammina Tetraacetie Acid</td><td>BBI</td><td>B300599</td><td></td></tr></tbody></table>

co-espressione delle proteine chimeriche fluorescenti fusion multiple in modo efficiente nelle piante

Co-expression of Multiple Chimeric Fluorescent Fusion Proteins in an Efficient Way in Plants

Informazioni sulla localization(s) spatiotemporal subcellulare di una proteina sono fondamentale per capire le sue funzioni fisiologiche nelle cellule. Proteine fluorescenti e generazione delle proteine di fusione fluorescenti sono stati selvaggiamente utilizzati come strumento efficace per visualizzare direttamente la localizzazione della proteina e la dinamica in cellule. È particolarmente utile per confrontarli con gli indicatori ben noto organello dopo co-espressione con la proteina di interesse. Tuttavia, approcci classici per la co-espressione della proteina nelle piante solitamente coinvolgono più plasmidi di espressione indipendente e quindi hanno svantaggi che includono tempo alta efficienza bassa co-espressione e variazione del livello di espressione dispendio in genetica crossing e di screening. In questo studio, descriviamo un metodo robusto e romanzo per la co-espressione di più proteine chimeriche fluorescenti nelle piante. Presenta le limitazioni dei metodi convenzionali utilizzando un vettore di espressione singola che è composto di più cassette di espressione semi-indipendente. Ogni cassetta di espressione della proteina contiene i propri elementi di espressione funzionale della proteina, e pertanto può essere regolato in modo flessibile per soddisfare la domanda di espressione diversi. Inoltre, è facile e conveniente per eseguire l'assembly e manipolazione del DNA frammenti nel plasmide di espressione utilizzando una reazione ottimizzata One-Step senza ulteriore digestione e passi di legatura. Inoltre, è pienamente compatibile con le attuali tecnologie di bio-imaging fluorescente proteine derivate e applicazioni, ad esempio FRET e BiFC. Come una convalida del metodo, abbiamo impiegato questo nuovo sistema a co-express fluorescente fusa vacuolar ordinamento recettore e proteine di membrana del trasportatore secretiva. I risultati mostrano che la sua localizzazione subcellulare di prospettiva sono gli stessi come in precedenti studi di espressione transitoria sia trasformazione genetica nelle piante.

Abbiamo sviluppato un metodo robusto e altamente efficiente per la co-espressione delle proteine chimeriche fluorescenti fusione multiple nelle piante. Attraversa le barriere del convenzionale approcci utilizzano più plasmidi separati per co-espressione della proteina, come mostrato in Figura 1A, B, via espressione transitoria o stabile trasformazione genetica. In questo nuovo metodo, generiamo un vettore di espressione singola che è...

Abbiamo sviluppato un nuovo metodo per cheesprimono più proteine di fusione fluorescenti chimerico in piante per superare le difficoltà dei metodi convenzionali. Essa si avvale dell'utilizzo di un plasmide di espressione singola che contiene più proteine funzionalmente indipendente esprimendo cassette per ottenere co-espressione della proteina.

Co-espressione delle proteine chimeriche fluorescenti Fusion Multiple in modo efficiente nelle piante

Information about the spatiotemporal subcellular localization(s) of a protein is critical to understand its physiological functions in cells. Fluorescent ...

Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo della biologia molecolare e cellulare delle piante, come ad esempio, come possiamo utilizzare le proteine nella cellula. Il vantaggio principale di questa tecnica è l'elevata efficienza di co-esprimere proteine di fusione cellulare in un unico vettore di espressione. A dimostrare la procedura sarà Guitao Zhong, uno studente laureato del nostro laboratorio.Per iniziare, progettare i primer per la clonazione molecolare di frammenti di DNA come descritto nel protocollo di testo. Amplificare i frammenti di DNA necessari per la costruzione delle cassette di espressione proteica semi-indipendenti mediante reazioni PCR standard con i relativi primer e polimerasi ad alta fedeltà. Questi includono il promotore, il reporter fluorescente, il gene bersaglio e il terminatore.Esaminare la qualità dei prodotti PCR del primo ciclo cercando la degradazione e la contaminazione del DNA con l'elettroforesi del DNA utilizzando un gel di agarosio all'1%. Quantificare i prodotti PCR con uno spettrofotometro. Il rapporto tra le letture a 260 e 280 nanometri dei prodotti PCR dovrebbe essere compreso tra 1,6 e 1,8.Mescolare i frammenti di DNA

co-expression-multiple-chimeric-fluorescent-fusion-proteins-an

Research

Ricerca

JoVE Journal

Chemistry

Chimica

Abbiamo sviluppato una tecnica per testare interazioni proteina-proteina in pianta. Una proteina fluorescente gialla (YFP) è divisa in due frammenti non si sovrappongono. Ogni frammento viene clonato in-frame ad un gene di interesse attraverso il sistema Gateway, consentendo l'espressione di proteine ​​di fusione. Ricostituzione del segnale YFP si verifica solo quando le proteine ​​interagiscono inchiesta.

Rilevamento delle interazioni proteiche in pianta utilizzando un gateway compatibile complementazione fluorescenza biomolecolare (BiFC) Sistema

Piante offrono un sistema innovativo per la produzione di proteine ​​farmaceutiche su scala commerciale che è più scalabile, economica e sicura rispetto paradigmi attuale espressione. In questo studio, riportiamo un approccio semplice e conveniente, ma scalabile per introdurre target-gene...

Agroinfiltration efficiente di impianti di alto livello espressione transiente di proteine ​​ricombinanti

Questo lavoro descrive un nuovo metodo per selettivamente organelli subcellulari nelle piante, saggiata usando l'BioRad Gene Gun.

Transient espressione genica in tabacco con all&#39;Assemblea Gibson e Gene Gun

Formazione di complessi proteici in vivo può essere visualizzato da bimolecular fluorescenza complementazione. Partner di interazione sono fusi a parti complementari tag fluorescenti e transitoriamente espressi in foglie di tabacco, risultando in un segnale fluorescente ricostituito upon vicinanza delle due proteine.

Interazioni proteina-proteina visualizzati tramite bimolecular complementazione fluorescenza in protoplasti di tabacco e foglie

Dalla scoperta del gene della proteina fluorescente verde, le proteine fluorescenti hanno avuto un impatto sulla biologia cellulare molecolare. Questo protocollo descrive come l'espressione di proteine fluorescenti distinte attraverso l'ingegneria genetica viene utilizzata per il barcoding di singole cellule. La procedura consente di tracciare popolazioni distinte in una miscela di cellule, ideale per applicazioni multiplexate.

Barcoding genetica con proteine ​​fluorescenti per applicazioni multiplexati

L'imaging del comportamento dinamico degli organelli e di altre strutture subcellulari in vivo può far luce sulla loro funzione in condizioni fisiologiche e patologiche. Qui, presentiamo metodi per marcare geneticamente due organelli, centrosomi e mitocondri, e per l'imaging delle loro dinamiche in embrioni di zebrafish viventi utilizzando la microscopia a campo largo e confocale.

Imaging strutture subcellulari nell&#39;embrione Living Zebrafish

Connessioni intercellulari di pianta, la Plasmodesmi (Pd), giocano un ruolo centrale nella pianta interazioni pianta-virus e di fisiologia. Critica ai trasporti Pd sono smistamento segnali che indirizzano proteine al Pd. Tuttavia, la nostra conoscenza di queste sequenze è ancora nella sua infanzia. Descriviamo una strategia per identificare i segnali di localizzazione di Pd in proteine Pd-mirati.

Identificazione di sequenze di localizzazione Plasmodesmal in proteine In Planta

Nonlytic sistemi di espressione di cellule di insetto sono sottoutilizzate per la produzione, il traffico cellulare / localizzazione, e analisi funzionale proteina ricombinante. Qui, descriviamo metodi per generare vettori di espressione e successiva espressione proteica transiente in cellule lepidotteri disponibili in commercio. La co-localizzazione di Bemisia tabaci acquaporine con proteine marker fluorescenti subcellulare è anche presentato.

Espressione transitoria e Localizzazione cellulare di proteine ​​ricombinanti in cellule in coltura per insetti

Approcci basati sulla proteina fluorescenti per monitorare gli effettori secernuti dai batteri nelle cellule ospiti sono impegnativi. Ciò è dovuto all'incompatibilità tra proteine fluorescenti e il sistema di secrezione di tipo III. Qui, un sistema GFP superfolder ottimizzato split viene utilizzato per la visualizzazione degli effettori secernuta dai batteri nella cellula della pianta ospite.

Proteina fluorescente verde sistema di visualizzare gli effettori consegnati dai batteri durante l'infezione Split

Descriviamo qui un metodo semplice per l'espressione, l'estrazione e la purificazione dell'IgG umano ricombinante fuso a GFP a Nicotiana benthamiana. Questo protocollo può essere esteso alla purificazione e visualizzazione di numerose proteine che utilizzano la cromatografia delle colonne. Inoltre, il protocollo è adattabile al laboratorio di insegnamento universitario di persona e virtuale, fornendo esplorazione basata su progetti.

Produzione di proteine di fusione IgG espresse transitoriamente in Nicotiana benthamiana

Il trasferimento di energia di risonanza di fluorescenza (FRET) è una tecnica di imaging per rilevare le interazioni proteiche nelle cellule viventi. Qui viene presentato un protocollo FRET per studiare l'associazione di enzimi modificanti gli istoni con fattori di trascrizione che li reclutano nei promotori bersaglio per la regolazione epigenetica dell'espressione genica nei tessuti vegetali.

Studio delle interazioni tra enzimi modificanti gli istoni e fattori di trascrizione in vivo mediante trasferimento di energia di risonanza di fluorescenza

Scopri un metodo efficiente per co-esprimere proteine fluorescenti chimeriche nelle piante utilizzando un singolo vettore di espressione. Questa tecnica avanzata facilita lo studio delle interazioni proteiche in vivo.

Co-espressione delle proteine chimeriche fluorescenti Fusion Multiple in modo efficiente nelle piante

Esplora altri video