Co-espressione delle proteine chimeriche fluorescenti Fusion Multiple in modo efficiente nelle piante

Abbiamo sviluppato un nuovo metodo per cheesprimono più proteine di fusione fluorescenti chimerico in piante per superare le difficoltà dei metodi convenzionali. Essa si avvale dell'utilizzo di un plasmide di espressione singola che contiene più proteine funzionalmente indipendente esprimendo cassette per ottenere co-espressione della proteina.

Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo della biologia molecolare e cellulare delle piante, come ad esempio, come possiamo utilizzare le proteine nella cellula. Il vantaggio principale di questa tecnica è l'elevata efficienza di co-esprimere proteine di fusione cellulare in un unico vettore di espressione. A dimostrare la procedura sarà Guitao Zhong, uno studente laureato del nostro laboratorio.

Per iniziare, progettare i primer per la clonazione molecolare di frammenti di DNA come descritto nel protocollo di testo. Amplificare i frammenti di DNA necessari per la costruzione delle cassette di espressione proteica semi-indipendenti mediante reazioni PCR standard con i relativi primer e polimerasi ad alta fedeltà. Questi includono il promotore, il reporter fluorescente, il gene bersaglio e il terminatore.

Esaminare la qualità dei prodotti PCR del primo ciclo cercando la degradazione e la contaminazione del DNA con l'elettroforesi del DNA utilizzando un gel di agarosio all'1%. Quantificare i prodotti PCR con uno spettrofotometro. Il rapporto tra le letture a 260 e 280 nanometri dei prodotti PCR dovrebbe essere compreso tra 1,6 e 1,8.

Mescolare i frammenti di DNA progettati per la stessa cassetta di espressione proteica in una provetta per PCR fino a un volume finale di cinque microlitri. Informazioni sulla combinazione di DNS da diversi dati di cassette di espressione. Poiché uguale riduce l'efficienza dell'assemblaggio del DNA, a causa del numero crescente di molecole di DNA che devono essere collegate.

Ora, aggiungi 15 microlitri di miscela master 2x alla miscela di DNA da 5 microlitri e incuba a 50 gradi Celsius per 60 minuti. Amplificare l'intera cassetta di espressione proteica semi-indipendente con un secondo ciclo di PCR. Utilizzare da 0,5 a un microlitro di prodotto dalla prima reazione di assemblaggio isotermico del round come dima nei primer più esterni.

Utilizzare un'unità di polimerasi ad alta fedeltà in un volume di reazione di 50 microlitri per 30 cicli, seguita da un'estensione finale a 68 gradi Celsius per cinque minuti. Successivamente, linearizzare il vettore portante finale dell'espressione proteica POC 18 e il vettore CAMBIA 1300, aggiungendo quattro unità di piccolo in un volume di reazione finale di 10 microlitri. Questi vettori sono progettati per l'espressione transitoria delle proteine e la trasformazione genetica.

Incubare il digestato di restrizione per una o due ore a 25 gradi Celsius. Dopo la digestione, inattivare l'enzima di restrizione incubando a 65 gradi Celsius per 20 minuti. Successivamente, mescolare le molecole di DNA equimolare delle cassette di espressione proteica e il vettore finale linearizzato in un volume di reazione finale di cinque microlitri.

Infine, eseguire il secondo ciclo di ricombinazione del DNA mescolando la reazione con 15 microlitri di tampone master 2x e incubando a 50 gradi Celsius per 60 minuti. Per preparare le cellule in sospensione di tabacco BY-2 per il bombardamento, filtrare e raccogliere 30 millilitri di cellule BY-2 coltivate per 3 giorni su un pezzo di carta da filtro autoclavata da 70 millilitri tramite una pompa a vuoto, impostando la pressione del vuoto a 40 millibar. Nel frattempo, aggiungere diverse gocce di terreno di coltura liquido per cellule BY-2 in una capsula di Petri.

Trasferire la carta da filtro con le celle BY-2 nella capsula di Petri. Per preparare le piante giovanili di arabidopsis per il bombardamento, preparare piante campione di sette giorni come descritto nel protocollo di testo. Quindi, trasferiscili in un rettangolo al centro di una nuova piastra media MS a mezza forza per aumentare l'efficienza del bombardamento.

Fare attenzione a evitare di sovrapporre le piante durante il trasferimento e il posizionamento sul piatto. Aggiungere diverse gocce di mezzo liquido MS a metà forza sulla superficie delle piante o dei tessuti per preservare l'umidità ed evitare che le piante si secchino durante i passaggi rimanenti. Per rivestire le particelle d'oro con DNA plasmidico, prima agitare accuratamente la soluzione di microcarrier d'oro per tre minuti.

Ora, aggiungi 25 microlitri di particelle d'oro a un nuovo tubo da 1,5 millilitri e agita per 10 secondi. Aggiungere 10 microlitri di spermidina da 25,46 milligrammi per litro e agitare per 10 secondi. Quindi, aggiungi cinque microlitri di un microgrammo per microlitro di DNA plasmidico e agita per tre minuti.

Infine, aggiungere 25 microlitri di soluzione di cloruro di calcio da 277,5 milligrammi per litro e agitare per un minuto. Centrifuga i microcarrier d'oro utilizzando una centrifuga da banco alla massima velocità per cinque secondi. Dopo la centrifugazione, convogliare con cura il surnatante senza disturbare il pellet.

Successivamente, lavare il pellet con 200 microlitri di etanolo assoluto e risospendere il pellet agitandolo per cinque-10 secondi. Una volta guadagnato, fai girare i microcarrier d'oro alla massima velocità per cinque secondi e rimuovi l'etanolo. Risospendere le particelle d'oro in 18 microlitri di etanolo assoluto.

Quindi, aliquotare sei microlitri di sospensione di particelle al centro di tre microvettori e lasciarli asciugare all'aria. Per trasferire il DNA nelle cellule e nelle piante tramite bombardamento di particelle, impostare prima il sistema di consegna delle particelle come descritto nel protocollo di testo. Quindi, bombardare le cellule o le piante sulla piastra agromedium per tre volte in tre diverse posizioni.

Tenere le cellule e le piante bombardate al buio nella camera di crescita delle piante per sei-72 ore prima dell'osservazione dei segnali fluorescenti. Imposta la camera di crescita delle piante a 24 ore di buio e 22 gradi Celsius. Trasferire le piante giovani o le cellule in sospensione su un vetrino convenzionale e posizionare delicatamente un vetrino di copertura sulla parte superiore per l'imaging con microscopia a scansione laser confocale standard.

Utilizzando le impostazioni elencate nel protocollo di testo, eccita le proteine marcate GFP a 485 nanometri e rileva la fluorescenza a 525 nanometri. Per le proteine marcate RFP, eccitare a 585 nanometri e rilevare a 608 nanometri. Infine, calcolare il rapporto di collocalizzazione dei segnali fluorescenti come descritto nel protocollo di testo.

La co-espressione di arabidopsis VSR-2 e arabidopsis SCAMP4 nelle cellule BY-2 del tabacco è stata ottenuta tramite bombardamento di particelle e ha mostrato localizzazioni corrette. RFP arabidopsis VSR-2 mostra un pattern puntato, che era distinto dalla localizzazione della membrana plasmatica di arabidopsis SCAMP4-GFP, con alcuni punti puntati citosolici. Inoltre, le piante transgeniche di arabidopsis che co-esprimono arabidopsis SCAMP4-GFP e RFP arabidopsis VSR-2 sono state generate tramite trasformazione mediata da agrobatteri.

Viene mostrata la localizzazione subcellulare della co-espressione delle due proteine chimeriche nelle cellule ciliate della radice e della radice. Coerentemente con gli studi precedenti, il trattamento dell'arabidopsis transgenica ha causato compartimenti prevacualari marcati con RFP arabidopsis VSR-2, formando una piccola struttura ad anello. Mentre il trattamento con prefoldina A ha indotto l'arabidopsi SCAMP GFP marcato con l'aggregazione della rete G transgold.

Come controllo negativo, si osserva un piccolo segnale autofluorescente nelle cellule BY-2 del tabacco e nelle cellule ciliate della radice e della radice dell'arabidopsi applicando le stesse impostazioni di raccolta delle immagini. Questo metodo può fornire informazioni sulla localizzazione subcellulare delle proteine. Può anche essere applicato allo studio delle proteine in direzione.

Dopo il suo sviluppo, questa tecnica ha aperto la strada ai ricercatori nel campo della biologia delle cellule vegetali. Per esportare convenientemente le localizzazioni subcellulari e l'interazione spaziale delle proteine nella cellula vegetale vivente. Seguendo questa procedura, è possibile eseguire altri metodi come la trasformazione mediata dalla PET e l'incrocio genetico per rispondere a ulteriori domande come la co-espressione di diverse proteine di fusione nelle piante.

Non dimenticare che lavorare con il bombardamento può essere estremamente pericoloso e che durante l'esecuzione di questa procedura è necessario prendere sempre precauzioni come le protezioni per gli occhi.