Fluorescenza separazione delle cellule attivate delle protoplasti impianto

Questa procedura si basa su piante che esprimono GFP in tipi cellulari specifici, i quali possono quindi essere isolati dal resto delle cellule della pianta mediante il sorting cellulare attivato da fluorescenza o FACS. Questo esempio utilizza due linee marcatrici che esprimono in tipi cellulari specifici di Arabidopsis. Le piantine con radici di Arabidopsis vengono coltivate in vassoi fito o su piastre in agar.

Le loro radici vengono raccolte e trattate con enzimi digerenti la parete cellulare. Dopo un'ora, la soluzione viene filtrata per rimuovere i detriti più grandi. Successivamente, la soluzione viene centrifugata e il soprannatante viene eliminato.

I protoplasti positivi per GFP vengono successivamente separati mediante FACS. Il materiale ordinato può essere utilizzato per analisi specifiche del tipo cellulare, come profili trascrizionali su scala genomica. Ciao, sono Basian Barman del laboratorio di Ken Birnbaum del Dipartimento di Biologia della New York University.

Oggi vi mostreremo un procedimento per la sorta cellulare attivata da fluorescenza di protoplasti vegetali. In questo esempio, separeremo due tipi cellulari specifici nella radice di Arabidopsis. Utilizziamo questo procedimento nel nostro laboratorio per studiare profili trascrizionali specifici per tipo cellulare.

Iniziamo. Per iniziare questa procedura, coltivare piantine di tipo selvatico e piantine che esprimono in modo specifico per tipo cellulare la GFP. Il promotore di scarecrow che guida l'espressione della GFP marca l'endoderma radicale e il centro di quiescenza in un gruppo di piantine.

E in un altro gruppo, il centro di quiescenza radicale è marcato dal promotore walks five che esprime GFP. Le piantine vengono coltivate in idrocoltura in piastre FIA posizionate sopra un filtro di nylon, che permette alle radici di crescere attraverso il filtro e penetrare nel mezzo di crescita. In alternativa, le piante possono essere coltivate sopra una rete di nylon e su piastre di agar al 1% posizionate in verticale.

Oltre a facilitare il raccolto delle radici, i filtri permettono il trasferimento in massa delle piantine in nuove piastre fito o in piastre di agar, dove possono essere aggiunti un catalizzatore di interesse. Questa procedura può essere effettuata per studiare le risposte trascrizionali specifiche per tipo cellulare a nutrienti, ormoni o trattamenti di stress. Verificare al microscopio a fluorescenza che il marcatore fluorescente sia espresso come previsto.

Assicurarsi che il profilo di espressione del marcatore sia costante nelle condizioni di trattamento applicate, poiché può variare a seguito del trattamento. Procedere con la raccolta e la preparazione dei protoplasti. Iniziare preparando la soluzione di protoplasti.

Combinare 1,25% peso/volume di cellulasi, 0,3% peso/volume di maser zyme, D-mannitolo 0,4 molare, MES 20 millimolare e KCl 20 millimolare in acqua demineralizzata e regolare il pH a 5,7 con Tris-HCl 1 molare a pH 7,5. La soluzione risulterà leggermente torbida. Successivamente riscaldare la soluzione a 55 gradi Celsius per 10 minuti.

La soluzione diventerà limpida; lasciarla raffreddare a temperatura ambiente, quindi aggiungere BSA allo 0,1% peso/volume, cloruro di calcio 10 millimolare e beta-mercaptoetanolo 5 millimolare. Raccogliere seedling di una settimana da un vassoio fito o, nel caso della linea scarecrow GFP, da otto piastre di seedling GFP 5G di quattro giorni. Raschiare le radici dalla maglia di nylon con un bisturi, quindi depositarle in un contenitore con una soluzione di protoplasti.

Utilizzare circa 10 millilitri di soluzione di protoplasti per 1500 piantine. Agitare dolcemente i flaconi a 75 giri al minuto a temperatura ambiente per un'ora. Un tempo di incubazione più lungo potrebbe aumentare il rendimento dei protoplasti, ma accentuerebbe anche l'effetto dei protoplasti stessi sull'espressione genica.

Ora che i protoplasti sono stati rilasciati, utilizzare un filtro cellulare da 40 micrometri per filtrare la soluzione e dividere la sospensione di protoplasti tra provette coniche da 15 ml. È importante ottenere una sospensione di protoplasti pulita, con il minor quantitativo possibile di detriti, per evitare l'intasamento del dispositivo e ridurre al minimo il tempo necessario per ordinare le cellule. Centrifugare le provette in una centrifuga a pendolo a 500 ×g per 10 minuti a temperatura ambiente.

Si noti che la velocità di centrifugazione dipende dalla costituzione della sezione vegetale da cui si ottengono i protoplasti e dalla quantità di detriti cellulari prodotti durante il trattamento enzimatico. Dopo la centrifugazione, rimuovere la maggior parte del soprannatante e risospendere delicatamente il pellet contenente i protoplasti nel piccolo volume residuo di soluzione per protoplasti. Infine, contare i protoplasti utilizzando un emocitometro e determinarne la densità per calcolare il rendimento e stabilire i parametri dell'esperimento successivo.

Dopo il conteggio, ispezionare i protoplasti. Verificare l'integrità, il livello di espressione della GFP e la presenza di detriti cellulari contaminanti. Successivamente, procedere con la fax.

Se non si procede direttamente alla fax, i protoplasti possono essere lavati, risospesi e conservati in una soluzione di incubazione come la soluzione per la protoplatina senza enzimi aggiunti o la soluzione W cinque. Accendere il cell sorter e il computer della stazione di lavoro.

Qui utilizziamo un fria prodotto da Becton Dixon and Company. Utilizzare un XPBS come fluido di guida ed eseguire la procedura di avvio del sistema fluidico. Installare un ugello da 100 micrometri e impostare una pressione del fluido di guida di 20 PSI.

Impostare un flusso stabile e calibrare il ritardo di caduta. Si noti che la calibrazione non è mostrata in questa procedura. Sospensioni di protoplasti con una densità fino a 10 milioni di cellule per mil possono essere ordinate con successo.

Per evitare il sedimentamento dei protoplasti, utilizzare l'opzione di agitazione del campione sul facts. Se si verifica un intasamento del facts, sono disponibili tre possibili passaggi di spurgo. In primo luogo, eseguire un lavaggio inverso della linea del campione.

In secondo luogo, diluire la sospensione di protoplasti per ridurre la densità. In terzo luogo, purificare la soluzione di protoplasti ripetendo il passaggio di filtrazione dopo la centrifugazione e la risospensione. Solo quattro parametri vengono utilizzati per distinguere i protoplasti positivi per GFP da quelli negativi per GFP e dai detriti cellulari dopo l'eccitazione mediante un laser a 488 nanometri: lo scatter in avanti è un indicatore delle dimensioni delle particelle, lo scatter laterale è un indicatore della granulosità delle particelle.

Emissione a 530 nanometri come misura della fluorescenza verde ed emissione a 610 nanometri come misura dell'autofluorescenza nello spettro rosso. Iniziare configurando un diagramma a dispersione per la diffusione in avanti rispetto alla diffusione laterale. Applicare l'impostazione della tensione in modo che gli eventi misurati siano centrati nel grafico.

I PROTOPLASTI positivi per GFP possono essere distinti in base al loro rapporto aumentato tra emissione verde e rossa rispetto agli eventi con autofluorescenza. Impostare esclusivamente un diagramma a dispersione con fluorescenza verde contro autofluorescenza nello spettro rosso. Applicare impostazioni di voltaggio in modo tale che gli eventi misurati generino una singola popolazione diagonale nel grafico.

Quando si osserva una sospensione di protoplasti di tipo selvatico, i PROTOPLASTI positivi per GFP dovrebbero produrre una popolazione chiara di eventi fluorescenti verdi mai osservati nei campioni di tipo selvatico. Impostare i vincoli di compensazione per correggere l'overlap spettrale tra la fluorescenza verde e l'autofluorescenza nello spettro rosso. Utilizzando una sospensione di PROTOPLASTI positivi per GFP, delle corrette impostazioni dei vincoli di compensazione permetteranno una migliore separazione dei protoplasti positivi per GFP dai protoplasti negativi per GFP e dai detriti, consentendo di definire un'area di selezione per identificare gli eventi positivi per GFP.

È consigliabile includere ogni volta protoplasti non GFP durante la preparazione di un esperimento di sorting, per aiutare a definire i limiti della finestra di selezione. Infine, impostare una soglia di cutoff dello scattering anteriore al fine di escludere dalla analisi i detriti di piccole dimensioni. La visualizzazione degli eventi positivi per GFP nel grafico di scattering anteriore rispetto a scattering laterale aiuterà a determinare dove impostare la soglia.

I parametri impostati in questa prima esecuzione di facts possono essere riutilizzati per analisi future. Saranno necessari lievi aggiustamenti per l'uso quotidiano di facts. Per l'estrazione dell'RNA, preparare provette contenenti tampone per l'estrazione di RNA; come guida, utilizzare un volume di analisi di massimo 100 microlitri in 350 microlitri di tampone di estrazione.

20.000 eventi di ordinamento producono un volume totale di circa 100 microlitri. Ora che i parametri del fax e le modalità operative sono stati impostati e che i tubi di raccolta sono pronti, iniziare l'ordinamento dei protoplasti; al termine dell'ordinamento, mescolare i tubi di raccolta del campione poiché la sospensione cellulare può accumularsi in superficie. Già da appena 500 eventi ordinati è possibile effettuare l'analisi con microarray dopo l'estrazione dell'RNA e l'amplificazione del DNA cDNA.

Qui utilizziamo il kit di microestrazione RNEZ, il sistema di amplificazione dell'RNA WT Ovation PICO e il modulo biotina CD NA Fl Ovation V due. Di seguito sono riportati i risultati tipici di un'analisi FACS per protoplasti ottenuti da piantine non GFP Scarecrow, GFP e W 5G FP. Ogni diagramma a dispersione mostra 100.000 eventi, con la fluorescenza verde sull'asse X e la fluorescenza rossa sull'asse Y. Gli eventi compresi nella finestra di selezione GFP sono evidenziati in verde.

Questo è un riassunto della resa tipica di protoplasti ottenuti da piantine che esprimono o la GFP marcata da scarecrow, che evidenzia l'endoderma radicale e il centro di quiescenza, oppure la walks 5G FP, che marca il centro di quiescenza radicale. Il numero di cellule presenti nel centro di quiescenza radicale è inferiore rispetto a quello dell'endoderma radicale. Pertanto, nonostante si parta con un numero maggiore di protoplasti, la resa di cellule che esprimono GFP è minore nel campione ordinato mediante walks 5G FP rispetto a quello ordinato mediante scarecrow GFP. Qui vengono mostrati risultati tipici dell'estrazione di RNA da campioni triplicati.

Ogni campione corrisponde all'RNA estratto da 10.000 eventi. L'RNA estratto viene analizzato mediante bioanalizzatore, che mostra i picchi ribosomiali per i campioni scarecrow GFP nella parte superiore e i campioni walks 5G FP nella parte inferiore. L'RNA estratto può essere ulteriormente utilizzato per l'analisi con microarray. Questo diagramma a dispersione dei livelli di espressione in logaritmo base due dimostra la similarità tra due replicati.

Abbiamo appena mostrato come eseguire la sorta cellulare attivata da fluorescenza di protoplasti vegetali per analisi specifiche del tipo cellulare. Questa tecnica è applicabile a molti tessuti e specie vegetali diversi. Rese elevate con basso contenuto di detriti e protoplasti sani forniranno risultati migliori nelle analisi trascrizionali e in altre analisi.

Ricordare inoltre che è importante mantenere identiche le condizioni di crescita del materiale vegetale per poter confrontare i campioni ordinati. Questo è tutto. Grazie per aver guardato e buona fortuna con i vostri esperimenti.