Fluorescenza separazione delle cellule attivate delle protoplasti impianto

Un metodo per isolare specifici tipi cellulari da materiale vegetale è dimostrata. Questa tecnica utilizza le linee marcatore transgenici che esprimono proteine ​​fluorescenti in particolari tipi di cellule, cellulari dissociazione e fluorescenza separazione delle cellule attivate. Inoltre, una configurazione di crescita è stabilito qui che facilita il trattamento delle

Questa procedura si basa su piante che esprimono GFP in specifici tipi di cellule, che possono quindi essere isolate dal resto delle cellule vegetali utilizzando la selezione cellulare attivata dalla fluorescenza o i fatti. Questo esempio utilizza due linee marcatrici che esprimono specifici tipi di cellule dell'Arabidopsis. Le piantine di radice di aliana vengono coltivate in fitovasetti o su piastre di agar.

Le loro radici vengono raccolte e trattate con enzimi che digeriscono la parete cellulare. Dopo un'ora, la soluzione viene filtrata per rimuovere i detriti di grandi dimensioni. La soluzione viene quindi centrifugata e il surnatante viene rimosso.

I protoplasti positivi alla GFP vengono successivamente separati via fax. Il materiale selezionato può essere utilizzato per analisi specifiche del tipo di cellula, come i profili trascrizionali dell'intero genoma. Ciao, sono Basian Barman del laboratorio di Ken Birnbaum presso il Dipartimento di Biologia della New York University.

Oggi vi mostreremo una procedura per la selezione cellulare attivata dalla fluorescenza di protoplasti vegetali. In questo esempio, smisteremo due tipi di cellule specifici nel percorso Arabidopsis. Utilizziamo questa procedura nel nostro laboratorio per studiare i profili trascrizionali specifici del tipo di cellula.

Quindi iniziamo. Per iniziare questa procedura, coltiva piantine di tipo selvatico e piantine che hanno un'espressione specifica del tipo di cellula di GFP. Il promotore dello spaventapasseri che guida la GFP segna l'endoderma radicale e il centro quiescente in un gruppo di piantine.

E in un altro gruppo, il centro di quiescenza della radice è contrassegnato dalle passeggiate cinque promotori che guidano la GFP. Le piantine vengono coltivate in idroponica e i vassoi FIA sono montati su un filtro di nylon, che consente alle radici di crescere nel terreno di coltura. In alternativa, le piante possono essere coltivate su una rete di nylon e su piastre di agar all'1% posizionate verticalmente.

Oltre ad aiutare nella raccolta delle radici, i filtri permettono di trasferire le piantine in massa su nuovi vassoi fitografici o piastre di agar dove possono essere integrate con un catalizzatore di interesse. Questo può essere fatto per studiare le risposte trascrizionali specifiche del tipo di cellula a nutrienti, ormoni o trattamenti di stress. Controllare al microscopio a fluorescenza per verificare che il marcatore fluorescente sia espresso come previsto.

Assicurarsi che il modello di espressione del marcatore sia coerente nelle condizioni di trattamento applicate poiché può cambiare a seguito del trattamento. Procedere alla raccolta e alla preparazione dei protoplasti. Inizia preparando la soluzione di protoplasti.

Combinare l'1,25% in peso per volume di cellulasi 0,3% in peso per volume, maser zima 0,4 molare D mannitolo 20 millimolare, MES e 20 millimolare KCL in acqua demineralizzata e regolare il pH a 5,7 con un tris molare HCL a pH 7,5. Questa soluzione risulterà leggermente torbida. Quindi riscaldare la soluzione a 55 gradi Celsius per 10 minuti.

La soluzione diventerà limpida, la lascerà raffreddare a temperatura ambiente e poi aggiungerà lo 0,1% in peso per volume di BSA 10 millimolari di cloruro di calcio e cinque millimolari di beta me capto etanolo raccoglieranno piantine di una settimana da un vassoio fito. Nel caso dello spaventapasseri linea GFP o otto piastre di piantine 5G FP a piedi di quattro giorni di età. Raschiare le radici dalla rete di nylon con un bisturi, quindi depositarle in un contenitore con una soluzione di protoplasti.

Utilizzare circa 10 millilitri di soluzione di protoplasti per 1500 piantine. Agitare delicatamente i palloni a 75 giri/min a temperatura ambiente per un'ora. Un tempo di incubazione più lungo può aumentare la resa dei protoplasti, ma aumenterà anche l'effetto dei protoplasti stessi sull'espressione genica.

Ora che i protoplasti sono stati rilasciati, utilizzare un filtro cellulare da 40 micrometri per filtrare la soluzione e dividere la sospensione dei protoplasti in tubi conici da 15 mil. È importante generare una sospensione pulita di protoplasti senza troppi detriti per evitare l'intasamento dei fatti e per ridurre al minimo il tempo necessario per smistare le cellule. Centrifugare le provette in una centrifuga a secchio oscillante a 500 G per 10 minuti a temperatura ambiente.

Si noti che la velocità di centrifugazione dipende dalla costituzione della sezione dell'impianto che produce i protoplasti e dalla quantità di detriti cellulari prodotti durante il trattamento enzimatico. Dopo la centrifugazione, rimuovere la maggior parte del surnatante e risospendere delicatamente il pellet contenente i protoplasti nel piccolo volume della soluzione di protoplasti rimanente. Infine, contare i protoplasti utilizzando un emocitometro e determinare la loro densità per calcolare la resa e decidere i parametri di esecuzione dei fatti.

Dopo il conteggio, ispezionare i protoplasti. Verificarne l'integrità, il livello di espressione della GFP e il contenuto di detriti cellulari contaminanti. Quindi, procedi con il fax.

In caso contrario, si procede direttamente al fax. I protoplasti possono essere lavati, risospesi e conservati in una soluzione di incubazione come la soluzione di protoplaccatura senza l'aggiunta di enzimi o la soluzione W five. Accendere l'ordinatore di celle e il computer della workstation.

Qui usiamo una fria prodotta da Becton Dixon and Company. Utilizzare un XPBS come fluido per guaina ed eseguire la procedura di avvio fluidico. Installare un ugello da 100 micrometri e impostare una pressione della guaina di 20 PSI.

Impostare un flusso stabile e calibrare il ritardo di caduta. Si noti che la calibrazione non viene mostrata in questa procedura. Le sospensioni di protoplasti con una densità fino a 10 milioni di cellule per mil possono essere selezionate con successo.

Al fine di prevenire la sedimentazione dei protoplasti, utilizzare l'opzione di agitazione del campione sui fatti. Se l'intasamento dei fatti è un problema, ci sono tre possibili fasi di ripresa. Innanzitutto, eseguire un risciacquo della linea di campionamento.

In secondo luogo, diluire la sospensione di protoplasti per ridurre la densità. In terzo luogo, pulire la soluzione di protoplasti ripetendo la fase di filtrazione dopo la centrifugazione e la sospensione di resus. Vengono utilizzati solo quattro parametri per distinguere i protoplasti positivi GFP dai protoplasti negativi GFP e i detriti cellulari dopo l'eccitazione da parte di un laser a 488 nanometri La dispersione diretta è un indicatore della dimensione delle particelle, la dispersione laterale è un indicatore della granularità delle particelle.

Emissione a 530 nanometri come misura della fluorescenza verde ed emissione a 610 nanometri come misura dell'autofluorescenza dello spettro rosso. Inizia impostando un grafico a punti per la dispersione diretta rispetto alla dispersione laterale. Applicare l'impostazione della tensione in modo che gli eventi misurati siano centrati nel grafico.

I PROTOPLAST positivi alla GFP si distinguono per l'aumento del rapporto tra emissione verde e rossa rispetto agli eventi con autofluorescenza. Imposta solo un grafico a punti con fluorescenza verde e autofluorescenza dello spettro rosso. Applicare le impostazioni di tensione in modo tale che gli eventi misurati diano origine a un'unica popolazione diagonale nel grafico.

Quando si osserva una sospensione di protoplasti wild type, i PROTOPLAST positivi alla GFP dovrebbero produrre una chiara popolazione di eventi fluorescenti verdi mai osservati in campioni wild type. Imposta i vincoli di compensazione per regolare la sovrapposizione spettrale tra la fluorescenza verde e l'autofluorescenza dello spettro rosso. Utilizzando una sospensione PROTOPLAST positiva GFP, le impostazioni dei vincoli di compensazione appropriate consentiranno una migliore separazione dei protoplasti positivi GFP dai protoplasti non GFP e i detriti creano un cancello per identificare gli eventi positivi GFP.

Si consiglia di portare con sé PROTOPLAST non GFP ogni volta che si prepara un esperimento di smistamento per aiutare a definire i confini del cancello. Infine, impostare un cutoff di soglia di dispersione in avanti per lasciare piccoli detriti fuori dall'analisi. La visualizzazione degli eventi positivi GFP nel grafico a dispersione diretta rispetto a quello a dispersione laterale aiuterà a determinare dove deve essere impostata la soglia.

I parametri impostati in questa esecuzione iniziale dei fatti possono essere riutilizzati per ordinamenti futuri. Saranno necessari lievi aggiustamenti per l'uso quotidiano dei fatti. Per l'estrazione dell'RNA, preparare le provette di raccolta contenenti tampone di estrazione dell'RNA, utilizzare al massimo un volume di selezione da 100 microlitri a un tampone di estrazione da 350 microlitri come guida.

20.000 eventi di smistamento producono un volume di smistamento totale di circa 100 microlitri. Ora che i parametri del fax e le modalità operative sono impostati e le provette di raccolta sono pronte, iniziare a smistare i protoplasti quando lo smistamento è completo. Mescolare le provette di raccolta del campione in quanto la sospensione cellulare può accumularsi nella parte superiore, è possibile utilizzare solo 500 eventi ordinati per l'analisi di microarray dopo l'estrazione dell'RNA e l'amplificazione del CD NA.

Qui utilizziamo il kit di microestrazione RNEZ, il sistema di amplificazione dell'RNA WT ovation PICO e il modulo di biotina CD NA V two. Ecco i risultati tipici del fax per protoplasti derivati da piantine di spaventapasseri non GFP, GFP e W 5G FP 100.000 eventi sono presentati in ogni grafico a punti di fluorescenza verde sull'asse x rispetto alla fluorescenza rossa. Sull'asse Y, gli eventi che rientrano nella porta di smistamento GFP sono evidenziati in verde.

Questo è un riassunto della tipica resa dei protoplasti dalle piantine che esprimono lo spaventapasseri GFP che segna l'endoderma radicale e il centro quiescente o cammina 5G FP che segna il centro quiescente della radice. Ci sono meno cellule nel centro quiescente della radice rispetto all'endoderma della radice. Pertanto, nonostante si inizi con un maggior numero di protoplasti, la resa delle cellule che esprimono GFP è inferiore nel tipo 5G FP rispetto al tipo GFP dello spaventapasseri mostrato qui sono i tipici risultati dell'estrazione dell'RNA di campioni triplicati.

Ogni campione corrisponde all'RNA estratto da 10.000 eventi. L'RNA estratto viene analizzato su un bioanalizzatore che mostra i picchi ribosomiali per i campioni GFP dello spaventapasseri in alto e i campioni 5G FP al di sotto dell'RNA estratto possono essere ulteriormente utilizzati per l'analisi di microarray. Questo grafico a dispersione dei livelli di espressione log due dimostra la somiglianza tra due repliche.

Vi abbiamo appena mostrato come eseguire la selezione cellulare attivata dalla fluorescenza di protoplasti vegetali per l'analisi specifica del tipo di cellula. Questa tecnica è applicabile a molti tessuti e specie vegetali diversi. Buone rese con un basso contenuto di detriti e protoplasti sani daranno risultati migliori a valle nelle analisi trascrizionali e di altro tipo.

Ricorda inoltre che è importante mantenere identiche le condizioni di crescita del materiale vegetale per il confronto tra i campioni selezionati. Quindi questo è tutto. Grazie per aver guardato e buona fortuna con i tuoi esperimenti.