Un metodo efficiente per quantitativa, analisi singola cella della cromatina Cambiamento e architettura nucleare in tutto il montaggio Ovuli in Arabidopsis

Forniamo qui un protocollo efficiente e affidabile per immunoistochimica, ibridazione in situ fluorescente, colorazione del DNA seguita da quantitativa, immagini ad alta risoluzione di tutto il montaggio di Arabidopsis thaliana ovuli. Questo metodo è stato utilizzato con successo per analizzare modificazioni della cromatina e architettura nucleare.

L'obiettivo generale di questa procedura è quello di preparare Arabidopsis Vues per l'ibridazione dell'intera montatura e l'immunocolorazione. Ciò si ottiene fissando prima i boccioli dei fiori freschi nella soluzione fissativa. Il secondo passo consiste nel sezionare e incorporare accuratamente le vue in tamponi di acrilammide miniaturizzati direttamente sui vetrini per microscopia.

Il successivo trattamento dei tessuti consente la chiarificazione e la permeazione dei tessuti. La fase finale consiste nell'incubare i campioni trattati con una soluzione anticorpale per l'immunocolorazione o una sonda marcata per l'ibridazione fluorescente in C due. In definitiva, l'imaging confocale ad alta risoluzione seguito dalla ricostruzione tridimensionale, consente l'analisi quantitativa nell'intera montatura a livello di singola cellula.

Questo metodo è stato inizialmente impiegato per fornire informazioni sull'organizzazione della TC nella vista, ma potrebbe anche essere applicato per analizzare altri compartimenti cellulari in altri tessuti del tuffo e in altri organismi modello. In provette micro fuge riempite con tampone BBO appena fatto raffreddato su ghiaccio a 20-30 carpali per provetta impostare le provette a oscillare delicatamente a temperatura ambiente per mezz'ora. Quindi, centrifugare le provette per un minuto a 400 Gs.Quindi aspirare con cura i surnatanti, scartarli e aggiungere un millilitro di PBT ai carpi. Posizionare i tubi sul ghiaccio per ogni tubo di carpo da montare.

Preparate sul ghiaccio. Cinque tubi da 200 microlitri. Una miscela di acrilammide al 5% appena fatta.

Cinque vetrini super frost puliti etichettati con una matita, un pensiero Eloqua di 20% a PS e un pensiero Eloqua di 20% NAPS da un tubo di carpale. Prendine quattro o cinque con una punta tagliata e posizionali ciascuno su un vetrino. Rimuovere il liquido in eccesso pipettando con cura con aghi sottili.

Praticare dei tagli longitudinali nei carpali e togliere le pareti carpali per rilasciare le file di vues. Questo passaggio richiederà pratica. Evitare che le vue si secchino aggiungendo fino a 10 microlitri di PBS, quindi a un tubo per microfughe contenente la miscela di acrilammide.

Aggiungere rapidamente 12 microlitri di NAPS e 12 microlitri di PS. Mescolare bene la soluzione con il pipettaggio e aggiungere rapidamente 30 microlitri di questa acrilammide attivata. Mescolare su un vetrino con vue sezionate. Posizionare delicatamente un piccolo vetrino coprioggetti sul preparato e lasciare che la soluzione polimerizzi a temperatura ambiente per circa un'ora.

Prepara ogni diapositiva in questo modo in un secondo momento. Usa una lama di rasoio per scheggiare i vetrini coprioggetti. I campioni possono essere conservati per una notte a quattro gradi Celsius in un barattolo coplan con PBS o procedere direttamente con l'elaborazione.

Generalmente la lavorazione deve essere effettuata in barattoli coplan con 80 millilitri di soluzione. E sotto la cappa aspirante. Iniziare chiarendo i tessuti attraverso l'incubazione in una serie di soluzioni di metanolo etanolo, una soluzione uno-a-uno di etanolo xilene e di nuovo in etanolo e poi metanolo.

Ogni bagno dura cinque o 30 minuti. Vedi il protocollo di testo. Successivamente, utilizzare una soluzione di metanolo PBT uno a uno con il 2,5% di formaldeide per 15 minuti.

Quindi sciacquare il fazzoletto in PBT due volte per 10 minuti per bagno. Successivamente, i vetrini possono essere conservati durante la notte a quattro gradi Celsius, se necessario. Quindi, prendi fino a sei vetrini dal barattolo e scolare il liquido in eccesso.

Mettili su una carta velina e aggiungi rapidamente 100 microlitri di un enzima per la digestione della parete cellulare raffreddata. Mescolare sui tamponi. Quindi coprire i vetrini con vetrini coprivetrini grandi.

Incubare i vetrini per due ore a 37 gradi Celsius in una camera umida. È importante ottimizzare la temperatura di digestione del CO per ogni nuova soluzione enzimatica perché questo passaggio è fondamentale per una colorazione omogenea in seguito. Lavare i vetrini due volte con PBT per cinque minuti per lavaggio.

Quindi scolare i vetrini ora su ogni vetrino. Aggiungere 100 microlitri di RNA A in PBS completati con l'1%tween e incubare i vetrini per un'ora a 37 gradi Celsius in una camera umida dopo l'incubazione, lavare i vetrini due volte con PBT come prima, quindi fissare nuovamente il tessuto incubando i vetrini in un bagno di PBTF appena fatto per 20 minuti. Risciacquare il PBTF con un lavaggio in PBT per 10 minuti.

Quindi procedere alla permeazione dei tessuti incubando i vetrini in PBS con il 2%tween per due ore a quattro gradi Celsius. Utilizzare due lavaggi in PBT ciascuno di cinque minuti per rimuovere la soluzione permeabile. Quindi procedere con la colorazione immunoidraulica.

Iniziare con l'incubazione dei vetrini nell'anticorpo primario di interesse. Applicare 100 microlitri di aliquote di anticorpo diluito in PBS e con lo 0,2% tra ogni vetrino. Trasferire i vetrini in una camera umida e incubarli a quattro gradi Celsius per 12-24 ore.

Lavare i vetrini in un bagno di PBT per due-quattro ore con un leggero dondolio a temperatura ambiente. Successivamente, aggiungere 100 microlitri di anticorpo secondario diluito da uno a 200 in PBS con 0,2% tra 20 e incubare i vetrini per 24 ore a quattro gradi Celsius. Un bagno di un'ora in PBT con un leggero dondolio è sufficiente per lavare i vetrini dall'anticorpo secondario non legato.

Quindi controcolorare il DNA con una soluzione di 10 microgrammi per millilitro di ioduro di propidio in PBS. Lasciare proseguire la colorazione per 15 minuti e poi lavare i vetrini con PBT con un leggero dondolio per 15 minuti a temperatura ambiente. Montare ora i vetrini con un mezzo anti-sbiadimento integrato con 10 microgrammi per millilitro di ioduro di propidio.

Dopo aver lasciato in posa per un'ora, l'immagine dei vetrini su un microscopio confocale utilizza una lente ad immersione in glicerolo 63x. Pertanto, durante l'acquisizione delle immagini, è fondamentale mantenere le impostazioni di scansione identiche tra i campioni per consentire la quantificazione comparativa e utilizzare una modalità di rilevamento lineare. Successivamente ricostruire le immagini seriali in strutture tridimensionali, segmentare ogni nucleo di interesse e utilizzare il software di elaborazione delle immagini 3D per quantificare i segnali.

Utilizzando questo robusto protocollo di preparazione su larga scala, l'intero Monte Vue manterrà la sua struttura tridimensionale. Le strutture subcellulari diventano visibili con un alto dettaglio come si vede con la cromatina. Quando si colora il DNA, l'eterocromatina appare come un focolaio luminoso e ben definito senza la necessità di applicare la deconvoluzione.

Questo protocollo consente l'immunocolorazione parallela con diversi anticorpi in un unico ciclo. Ad esempio, il marcatore permissivo associato alla cromatina U, H tre trimm di lisina metilata quattro e il marcatore associato all'eterocromatina H tre monometil lisina 27 sono stati entrambi rilevati in un esperimento su vetrini replicati distinti per analizzare la dinamica della cromatina. Un'altra tecnica compatibile è l'ibridazione fluorescente C 2 o pesce pesce a 45 s.Ribosomiale.

Le ripetizioni del DNA sono state utilizzate per definire le regioni dell'organizzazione nucleare. La sonda è stata etichettata direttamente con Alexa 4 88 e il DNA è stato colorato con contatori Per l'analisi di ificazione, è molto importante testare diverse diluizioni e tempi di incubazione del corpo per identificare le condizioni che danno un segnale robusto e hogene con il più basso possibile. E la contrizione del corpo.

Poiché questo metodo consente di ottenere un'eccellente conservazione del tessuto e una permeazione ottimale per l'analisi di singole cellule dell'organizzazione della cromatina, apre la strada agli scienziati nel campo della biologia cellulare vegetale o dell'epigenetica delle piante per studiare l'organizzazione nucleare o subcellulare a livello di singola cellula e nell'intero contesto umano.