Un metodo efficiente per quantitativa, analisi singola cella della cromatina Cambiamento e architettura nucleare in tutto il montaggio Ovuli in

L'obiettivo generale di questa procedura è preparare le vues di Arabidopsis per l'ibridazione su preparato intero e la colorazione immunoistochimica. Questo viene ottenuto fissando innanzitutto i boccioli floreali freschi nella soluzione fissante. Il secondo passaggio consiste nell'accurata dissezione e inclusione delle vues in cuscinetti miniaturizzati di acrilamide direttamente su vetrini per microscopia.

La successiva lavorazione del tessuto consente la chiarificazione e la permeazione del tessuto. L'ultimo passaggio consiste nell'incubare i campioni trattati con una soluzione di anticorpi per la colorazione immunoistochimica o con una sonda marcata per l'ibridazione fluorescente in C due. Infine, un'analisi confocale ad alta risoluzione seguita da ricostruzione tridimensionale permette l'analisi quantitativa in preparati interi a livello di singola cellula.

Questo metodo è stato inizialmente impiegato per ottenere informazioni sull'organizzazione del CT nella vista, ma potrebbe anche essere applicato per analizzare altri compartimenti cellulari in altri tessuti del campione e in altri organismi modello. In provette microcentrifuga riempite con tampone BBO appena preparato e raffreddato in ghiaccio, aggiungere da 20 a 30 carpali per provetta, quindi posizionare le provette su un agitatore delicato a temperatura ambiente per mezz'ora. Successivamente, centrifugare le provette per un minuto a 400 G. Quindi aspirare con attenzione i soprannatanti, scartarli e aggiungere un millilitro di PBT ai carpali. Collocare le provette in ghiaccio per ogni provetta di carpali da montare.

Preparare sul ghiaccio. Cinque provette contenenti 200 microlitri. Una miscela di acrilamide al 5% appena preparata.

Cinque vetrini puliti di tipo Super Frost etichettati con una matita, un'equazione Eloqua al 20% di PS e un'equazione Eloqua al 20% di NAPS da un tubo di carpali. Prelevarne quattro o cinque con una punta tagliata e posizionarli singolarmente su ciascun vetrino. Rimuovere il liquido in eccesso aspirandolo con cura mediante aghi fini.

Eseguire incisioni longitudinali nei carpali ed eliminare le pareti carpali per liberare le file di vues. Questo passaggio richiederà pratica. Evitare che le vues si secchino aggiungendo fino a 10 microlitri di PBS, quindi trasferirle in una provetta microcentrifuga contenente la miscela di acrilammide.

Aggiungere rapidamente 12 microlitri di NAPS e 12 microlitri di una PS. Mescolare bene la soluzione mediante pipettaggio e aggiungere rapidamente 30 microlitri di questa acrilamide attivata. Mescolare su un vetrino con vues dissezionate. Posizionare delicatamente una piccola lamella sulla preparazione e lasciare polimerizzare la soluzione a temperatura ambiente per circa un'ora.

Preparare ogni vetrino in questo modo in un secondo momento. Utilizzare una lametta per rimuovere i coprioggetti. I campioni possono essere conservati durante la notte a quattro gradi Celsius in un barattolo coplan contenente PBS oppure possono essere sottoposti direttamente alla lavorazione.

Generalmente, l'elaborazione deve essere eseguita in barattoli coplan con 80 millilitri di soluzione e sotto cappa. Iniziare chiarificando i tessuti mediante incubazione in una serie di soluzioni di metanolo ed etanolo, una soluzione uno a uno di etanolo e xilene, e nuovamente in etanolo e quindi in metanolo.

Ogni bagno dura cinque o trenta minuti. Consultare il protocollo scritto. Successivamente, utilizzare una soluzione di PBT in metanolo al rapporto uno a uno con il 2,5% di formaldeide per 15 minuti.

Quindi sciacquare il tessuto in PBT due volte per 10 minuti per ogni bagno. Successivamente, i vetrini possono essere conservati tutta la notte a quattro gradi Celsius se necessario. Successivamente, prelevare fino a sei vetrini dal barattolo e far scolare il liquido in eccesso.

Posizionarli su un foglio di carta da filtro e aggiungere rapidamente 100 microlitri di un enzima per la digestione della parete cellulare, precedentemente raffreddato. Mescolare sulle piastre. Quindi coprire i vetrini con grandi lamelle.

Incubare i vetrini per due ore a 37 gradi Celsius in una camera umida. È fondamentale ottimizzare la temperatura di digestione del CO per ogni nuova soluzione enzimatica, poiché questo passaggio è cruciale per una colorazione omogenea in un momento successivo. Lavare i vetrini due volte con PBT per cinque minuti per ogni lavaggio.

Quindi asciugare leggermente i vetrini, aggiungendo su ciascun vetrino 100 microlitri di RNAsa in PBS integrato con il 1% di Tween. Incubare i vetrini per un'ora a 37 gradi Celsius in una camera umida. Al termine dell'incubazione, lavare i vetrini due volte con PBT come in precedenza, quindi fissare nuovamente il tessuto incubando i vetrini in un bagno di PBTF appena preparato per 20 minuti. Rimuovere il PBTF con un solo lavaggio in PBT della durata di 10 minuti.

Procedere quindi alla permeabilizzazione del tessuto incubando i vetrini in PBS con Tween al 2% per due ore a quattro gradi Celsius. Utilizzare due lavaggi in PBT, ciascuno di cinque minuti, per rimuovere la soluzione permeabilizzante. Procedere quindi con la colorazione immunoistochimica.

Iniziare incubando i vetrini nell'anticorpo primario di interesse. Applicare 100 microlitri di aliquote di anticorpo diluito in PBS e con lo 0,2% di Tween su ciascun vetrino. Trasferire i vetrini in una camera umida e incubarli a quattro gradi Celsius per 12-24 ore.

Lavare i vetrini in un bagno di PBT per due o quattro ore con movimento lento a temperatura ambiente. Successivamente, aggiungere 100 microlitri di anticorpo secondario diluito uno a 200 in PBS con 0,2% compreso tra 20 e incubare i vetrini per 24 ore a quattro gradi Celsius. Un bagno di un'ora in PBT con movimento lento è sufficiente per lavare i vetrini dall'anticorpo secondario non legato.

Quindi eseguire la controcolorazione del DNA con una soluzione di 10 microgrammi per millilitro di ioduro di propidio in PBS. Lasciare procedere la colorazione per 15 minuti, quindi lavare i vetrini con PBT agitando delicatamente per 15 minuti a temperatura ambiente. Montare ora i vetrini con un mezzo antiossidante integrato con 10 microgrammi per millilitro di ioduro di propidio.

Dopo aver lasciato riposare per un'ora, acquisire le diapositive al microscopio confocale utilizzando un obiettivo a immersione in glicerolo da 63x. Durante l'acquisizione delle immagini, è fondamentale mantenere invariati i parametri di scansione tra i diversi campioni per consentire una quantificazione comparativa e utilizzare una modalità di rilevamento lineare. Successivamente, ricostruire le immagini seriali in strutture tridimensionali, segmentare ciascun nucleo di interesse e utilizzare un software di elaborazione delle immagini 3D per quantificare i segnali.

Utilizzando questo protocollo robusto di preparazione su larga scala, i preparati interi in montaggio conservano la loro struttura tridimensionale. Le strutture subcellulari diventano visibili con un elevato dettaglio, come nel caso della cromatina. Durante la colorazione del DNA, l'eterocromatina appare come fuochi luminosi e ben definiti, senza la necessità di applicare deconvoluzione.

Questo protocollo consente una colorazione immunoistochimica parallela con diversi anticorpi in un unico ciclo. Ad esempio, il marcatore permissivo associato alla cromatina U, la lisina 4 trimetilata dell'istone H tre, e il marcatore associato all'eterocromatina, la lisina 27 monometilata dell'istone H tre, sono stati entrambi rilevati in un unico esperimento su diversi vetrini replicati per analizzare la dinamica della cromatina. Un'altra tecnica compatibile è l'ibridazione fluorescente in situ o FISH per il ribosomiale 45 s.

I ripetuti di DNA sono stati utilizzati per definire le regioni dell'organizzazione nucleare. La sonda è stata direttamente marcata con Alexa 488 e il DNA è stato controcolorato. Per l'analisi di identificazione, è molto importante testare diverse diluizioni dell'anticorpo e tempi di incubazione al fine di individuare le condizioni che producono un segnale robusto e omogeneo con il minimo possibile di legame non specifico dell'anticorpo.

Dato che questo metodo consente un'eccellente conservazione del tessuto e una permeabilizzazione ottimale per l'analisi a singola cellula dell'organizzazione della cromatina, apre la strada ai ricercatori nel campo della biologia cellulare vegetale o dell'epigenetica vegetale per studiare l'organizzazione nucleare o subcellulare a livello di singola cellula e in tutto il contesto dell'organismo.