Ottimizzazione iterativa di duplex di DNA per cristallizzazione di Seqa-DNA Complessi

Questo esperimento descrive in dettaglio come ottenere cristalli di qualità di diffrazione di una proteina legata al DNA contenente un orlo metilato tandem. GATC. Ripetere per favorire l'impacchettamento cristallino del complesso proteico DNA. Iniziare con la progettazione razionale della lunghezza del DNA, la spaziatura GATC e le estremità del DNA procedere con gli oligonucleotidi complementari a singolo filamento per purificare il DNA e quindi anele per formare il duplex di DNA metilato emi, quindi mescolare il seq A purificato per formare il complesso.

Successivamente, trovare le condizioni ottimali per far crescere cristalli di qualità di diffrazione del complesso proteico DNA con prove di cristallizzazione utilizzando schermi commerciali a matrice sparsa. Risultati dimostrati. Condividi l'effetto della variazione della lunghezza, della spaziatura e delle estremità del DNA sulla qualità della diffrazione dei cristalli di DNA CQ A.

L'obiettivo di questo lavoro è quello di ottenere cristalli di qualità di diffrazione di CK legati al DNA, ma può anche aiutare a comprendere le variabili generali che devono essere considerate quando si progettano duplex di DNA per la cristallizzazione di altri complessi di DNA proteico, dimostrando che questa procedura sarà utilizzata a Chang, A per il dottorando del mio laboratorio. Questo studio utilizza una variante delle proteine regolatrici della replicazione del DNA. Cerca un che formi dimeri stabili e abbia una regione linker accorciata tra i suoi domini di izzazione e di legame del DNA.

Questa variante limita il legame del DNA alle ripetizioni GATC in tandem separate esclusivamente da un giro sulla prima trasformazione del DNA BBL 20 1D tre cellule con il plasmide che codifica DEMETRIC seq A sotto il controllo della piastra del promotore T sette. La reazione di trasformazione su piastre di agar LB contenenti 100 microgrammi per millilitro, ampicillina e collocarla nell'incubatore batterico per una notte. Scegli colonie miste e avvia una cultura notturna su piccola scala.

La mattina successiva inoculatore coltura da un litro con 10 millilitri di inoculo notturno. Quando la coltura è in fase logaritmica, aggiungere due millilitri di IPTG molare 0,5 per indurre la produzione di proteine. Continuare l'incubazione per tre ore in un agitatore orbitale a 37 gradi Celsius.

Quindi raccogliere le cellule mediante centrifugazione a 3.300 g per 10 minuti. Reese, sospendere la tavolozza cellulare in purificazione, tamponare una bugia mediante sonicazione e cancellare il lisato mediante centrifugazione a 39.000 volte G per 40 minuti. Caricare ora il surnatante S su una colonna di eparina bilanciata con tampone di purificazione.

Per eluire la proteina CK. Utilizzare un gradiente lineare a un molare di cloruro di sodio La proteina CK eluisce a circa 0,7 molari di cloruro di sodio. Estrarre il CK contenente frazioni e diluirlo per ridurre la forza ionica del campione.

Quindi caricare il campione in una colonna per cromatografia a scambio cationico E equiparata al tampone di purificazione. Applicare un gradiente lineare di sali per avvolgere la proteina CK pura a circa 0,4 molari di cloruro di sodio. Combina le frazioni contenenti CK.

Concentrare a tre milligrammi per millilitro e conservare in magazzino. Progettazione di tamponi oligonucleotidi complementari non metilati e metilati. Preparare campioni di una micromole di ogni DNA liofilizzato a filamento singolo in 800 microlitri di autoclave, vortice di acqua distillata doppia e mettere da parte per 15 minuti e 800 microlitri.

Hanno preriscaldato due volte il tampone di caricamento su ciascun campione per 20-30 nucleotidi, oligonucleotidi lunghi preparare un grande gel denaturante al 10%. Una volta polimerizzato, rimuovere il pettine e risciacquare accuratamente il pozzetto. Assemblare il gel riempiendo i serbatoi superiore e inferiore con un tampone di corsa TBE una volta.

Pre-esegui il gel a 750 volt per riscaldare il gel a 55 gradi Celsius. Quindi interrompere la corsa e sciacquare accuratamente i pozzetti con un tampone di corsa. Ora riscalda gli oligonucleotidi a 90 gradi Celsius per due minuti.

Vortice e rotazione. I campioni procedono immediatamente al caricamento del gel. Far funzionare il gel a circa 700 volt fino a quando l'oligonucleotide non è migrato.

A metà strada Su un gel di poliacrilammide al 10% blu di alph fenolo co migra con oligonucleotidi lunghi circa 20 basi e xilene sil ff con circa 60 basi di lunghezza. Smontare il gel dall'apparecchio e rimuovere i distanziatori su una superficie piana. Rimuovere una lastra di vetro e coprire il gel con pellicola trasparente.

Quindi capovolgere il gel, rimuovere l'altra lastra di vetro e coprire il gel con pellicola trasparente. Quindi, segna le bande usando la luce UV e una piastra fluorescente dietro il gel. Per vedere l'ombra del DNA con una lama di rasoio, asporta la fascia e tagliala a pezzetti.

Trasferire ogni campione in una provetta sterile da 15 millilitri. Aggiungere nove millilitri di tampone eluciano e diluire per una notte a 37 gradi Celsius agitandosi. Trasferire con cautela la soluzione in una provetta da centrifuga per autoclave utilizzando un puntale per pipetta con caricamento di gel.

Per evitare il trasferimento di pezzi di acrilammide, aggiungere un millilitro di tre millilitri di acetato di sodio a pH sette più 25 millilitri di etanolo refrigerato al 100% incubato a meno 20 gradi Celsius per almeno tre ore. Centrifugare il DNA precipitato. Quindi asciugare i pellet sullo speed vac a fuoco medio, risospendere ogni pellet in 400 microlitri di autoclave, doppia distillazione di acqua e trasferire in un tubo nuovo.

Aggiungere 40 microlitri di acetato di sodio a tre molari a pH sette e un millilitro di vortice di etanolo al 100% e incubare per 30 minuti a meno 20 gradi Celsius dopo la centrifugazione per 15 minuti a 18.000 volte. G, sciacquare i pellet di DNA con 100 microlitri di etanolo freddo al 70% per rimuovere eventuali residui di centrifuga salina per sei minuti a 18.000 volte. G quindi scartare l'etanolo e asciugare il pellet con un aspirapolvere.

Ora rispedire ogni pellet in 100 microlitri di acqua doppia distillata in autoclave. Determinare la concentrazione degli oligonucleotidi mediante spettrometria. Per preparare i duplex di DNA emimetilato, mescolare prima le concentrazioni uguali di molo dei singoli filamenti complementari.

Quindi scaldare le miscele a 95 gradi Celsius a bagnomaria per cinque minuti Per anil i fili. Lasciare raffreddare lentamente i campioni a temperatura ambiente all'interno del bagnomaria. Combina volumi uguali di 81 proteine CQ a purificate micromolari e 81 DNA metilato dell'orlo micromolare.

Quindi incubato a temperatura ambiente per 15 minuti. Conservare a quattro gradi Celsius fino all'utilizzo dello schermo per condizioni di cristallizzazione utilizzando schermi a matrice sparsa commerciali. Una volta identificati i conduttori di cristallizzazione iniziali, ottimizzare le condizioni per far crescere cristalli di qualità di diffrazione per piangere e proteggere i cristalli di DNA CK risultanti.

Aumentare la quantità di PEG 400 presente nella soluzione di cristallizzazione fino a una concentrazione finale del 25% o aggiungere il 20% di glicerolo alla soluzione di cristallizzazione. Estrai i singoli cristalli con la flash ad anello di nylon. Congelare i campioni in azoto liquido.

Ora testa il limite di diffrazione di ciascun cristallo a 100 k. Per ottenere la struttura cristallina del mutante accorciato di CK legato al DNA metilato Hemi, ottimizziamo consecutivamente tre parametri sul DNA, la spaziatura tra le sequenze GATC metilate Hemi, la lunghezza del duplex e l'assenza o la presenza di cinque sporgenze prime. Questo studio utilizza una variante DME di seek a con una mutazione puntiforme nel dominio terminale terminale che impedisce un'ulteriore legamentizzazione e un linker accorciato che limita il legame del DNA al tandem.

Le ripetizioni GATC separate esclusivamente da un giro sul DNA, i saggi di spostamento dell'elettromobilità indicano che la proteina CK modificata lega preferenzialmente le ripetizioni GATC separate da nove a 10 coppie di basi. Pertanto, gli schermi iniziali utilizzano duplex lunghi da 23 a 24 paia di basi contenenti due orli metilati. Ripetizioni GATC separate da nove o 10 coppie di basi.

Tre duplex hanno prodotto cristalli ben modellati. Mentre nessuno dei cristalli si defratta ad alta risoluzione. I dati hanno indicato che la separazione A-G-A-T-C di nove coppie di basi era preferita per la cristallizzazione, migliorando inaspettatamente le interazioni della spina dorsale del solco includendo un dinucleotide CG tra i due siti GATC non ha alterato il limite di diffrazione dei cristalli.

Al contrario, l'ottimizzazione della lunghezza delle sporgenze ha cambiato drasticamente i contatti molecolari e la morfologia dei cristalli. La struttura cristallina di questa proteina CK legata a un duplex di DNA metilato ha confermato che la faccia libera del duplex di DNA non entra in contatto con i cristalli nonostante la dimensione relativa della proteina e del DNA, la maggior parte delle interazioni tra accoppiamenti di simmetria sono mediate da interazioni proteina, proteina e proteina DNA. È interessante notare che, in questo caso particolare, l'effetto benefico di una sporgenza di cinque dinucleotidi primi non è dovuto alla formazione di un DNA pseudo continuo.

Invece, le cinque estremità prime del filamento metilato sporgono lontano dagli assi del DNA e interagiscono con la molecola CK prossimale del complesso, spiegando perché due nucleotidi erano strettamente necessari per modificare l'impacchettamento del cristallo. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come purificare le proteine e progettare duplex di DNA per la cristallizzazione del complesso proteico del DNA. È importante ricordare che, sebbene questo protocollo sia stato utilizzato per cristallizzare il complesso di DNA CK, l'ottimizzazione razionale della lunghezza della sequenza e delle estremità del DNA fornisce un quadro generale per la progettazione di duplex di DNA per la cristallizzazione di altri complessi di DNA proteico.