Migliorare il tasso di successo di cristallizzazione della proteina da Random Microseed Matrix Screening

L'obiettivo generale di questa procedura è quello di migliorare il numero e la qualità della diffrazione dei cristalli proteici ottenuti da un esperimento di screening della cristallizzazione. Per fare ciò, un materiale cristallino o precipitato viene identificato da un esperimento di screening di cristallizzazione proteica esistente stabilito utilizzando una proteina bersaglio di interesse, il materiale cristallino o precipitato viene raccolto e quindi utilizzato per generare uno stock di semi cristallini. Successivamente, viene stabilita una serie di schermi di cristallizzazione contenenti sia la proteina bersaglio di interesse che i semi di cristallo.

Infine, gli schermi di cristallizzazione seminati vengono monitorati per la formazione di cristalli e vengono caratterizzati eventuali nuovi cristalli proteici. In definitiva, l'applicazione di questa procedura può portare ad un aumento del numero, delle dimensioni e della qualità di diffrazione dei cristalli proteici ottenuti da esperimenti di screening della cristallizzazione. I principali vantaggi di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti, ad esempio la micro semina tradizionale o la macro semina, sono che può essere eseguita rapidamente, è altamente scalabile e campiona uno spazio di cristallizzazione significativamente maggiore rispetto ad altri metodi di semina.

Un altro vantaggio di questa tecnica è che non richiede l'uso di materiale di partenza cristallino di alta qualità per la produzione di semi. In generale, gli individui che non conoscono questo metodo avranno difficoltà perché è richiesto un grado significativo di destrezza manuale durante le fasi di raccolta e manipolazione dei cristalli. Dimostrazione visiva dell'importanza del metodo se il metodo è fondamentale, poiché la microsemina a matrice casuale si discosta in modo significativo da altri metodi di semina dei cristalli.

Le sottigliezze di questo metodo sono la chiave del successo e alcune di queste sono difficili da comunicare con precisione in forma di testo. Iniziare questa procedura solo con un vassoio di cristallizzazione posizionato utilizzando un microscopio binoculare o un sistema di imaging a cristallo. Ispezionare il vassoio ogni giorno per la prima settimana.

Quindi, una volta alla settimana, prendi nota della dimensione dei cristalli. Non appena non ci sono prove di ulteriore crescita, selezionare uno o più pozzetti appropriati dal vassoio da cui raccogliere il materiale cristallino. Per la generazione di semi, è possibile utilizzare qualsiasi materiale, inclusi aghi sottili, luci spial, micro cristalli e cristalli irregolari e mal formati.

È più probabile che il materiale più vecchio sia parzialmente reticolato ed è meno adatto per l'uso negli esperimenti di semina. Il giorno del raccolto, utilizzare un panino infiammato per realizzare una sonda arrotondata da una pipetta di vetro da pascolo. Per fare ciò, riscalda la pipetta vicino al centro fino a quando non diventa morbida.

Quindi rimuoverlo rapidamente dal fuoco ed estrarlo separando le estremità. Cerca di abbassare il vetro a un diametro inferiore a 0,25 millimetri nel punto in cui è di circa 0,25 millimetri. Rompi il vetro e immergi brevemente l'estremità rotta nella fiamma.

Ripetere questo processo fino a formare una semisfera di vetro all'estremità con un diametro di circa 0,75 millimetri. Metti una provetta da microcentrifuga da 1,5 millilitri contenente una perlina di semi sul ghiaccio. Quindi, aprire il vassoio di cristallizzazione selezionato.

Bene, per 24 vassoi di gocce ben appesi. Usa un paio di pinzette per rimuovere il vetrino coprioggetti. Quindi capovolgere il vetrino coprioggetto e posizionarlo su una superficie stabile e pulita.

Per 96 vassoi a goccia ben seduti. Usa un bisturi per tagliare intorno alla pellicola di plastica del soffitto sulla parte superiore del pozzetto selezionato, quindi rimuovi la parte asportata della pellicola del soffitto usando un paio di pinzette. Rimuovere 50 microlitri della soluzione del serbatoio e trasferire questo liquido nella provetta da microcentrifuga contenente la perlina di semi, assicurandosi che la provetta rimanga sul ghiaccio per tutto il tempo. L'aspetto più difficile di questa procedura è la preparazione del brodo di semi.

È importante eseguire questa operazione esattamente come descritto e il più rapidamente possibile. Fare attenzione a frantumare accuratamente il materiale del seme con la sonda e recuperare il più possibile mentre si osserva il campione al microscopio. Utilizzare la sonda di vetro preparata in precedenza per schiacciare completamente i cristalli sul coperchio.

Scivola gocce. I piccoli cristalli possono richiedere diversi minuti per frantumarsi completamente. I cristalli facili da frantumare non sono reticolati e non sono cristalli di sale.

Mentre i cristalli di sale producono un clic caratteristico che può essere sentito e sentito quando vengono schiacciati. Quindi, rimuovere cinque microlitri della soluzione del serbatoio dal tubo della perlina del seme e trasferirli nel pozzetto secondario equivalente per un esperimento a goccia seduta o in un vetrino coprioggetti per un esperimento a goccia sospesa contenente il materiale cristallino da raccogliere. Pipettare questo liquido su e giù cinque o sei volte per risospendere il più possibile il contenuto del sottopozzetto o del vetrino coprioggetti.

Rimetti la sospensione nel tubo della perlina e ripeti questo passaggio altre due volte, assicurandoti che venga raccolto quanto più materiale cristallino possibile. Vortex, la perlina per due minuti, fermandosi ogni 30 secondi per raffreddare il tubo con ghiaccio. In provette da 1,5 millilitri contenenti la soluzione del serbatoio.

Effettuare una serie di diluizioni per archiviare la diluizione del ceppola di semi nella soluzione del serbatoio di un fattore da quattro a 10 in ogni fase. Se il seme, il brodo e le diluizioni non verranno utilizzati immediatamente, mettere aliquote da 10 a 20 microlitri in un congelatore a 20 gradi Celsius negativi o a 80 gradi Celsius per la conservazione. Una volta congelati, i ceppi di semi possono essere conservati a tempo indeterminato fino al momento del bisogno.

screening della cristallizzazione RMMS può essere eseguito utilizzando vassoi da 24 pozzetti che utilizzano il metodo di diffusione del vapore a goccia sospesa o vassoi da 96 pozzetti che utilizzano il metodo di diffusione del vapore a goccia seduta. Per eseguire il nostro screening MMS in 24 vassoi di gocce sospesi, utilizzare una pipetta per trasferire manualmente 300 microlitri di ciascuna condizione da uno schermo di cristallizzazione a 96 condizioni in 10 millilitri. Formato provetta singola per ogni pozzetto di 4 24.

I vassoi di cristallizzazione ben pre-ingrassati di ciascun serbatoio da 300 microlitri trasferiscono un microlitro di ciascuna condizione di cristallizzazione sulla superficie di un corrispondente vetrino di copertura in plastica da cui sono state rimosse le strisce di supporto protettive anteriori e posteriori su un microlitro. Sul vetrino coprioggetti, aggiungere un microlitro di soluzione proteica, quindi 0,5 microlitri di brodo di semi di cristallo. Nel primo ciclo di RMMS, è importante non utilizzare la soluzione madre di semi diluita.

Poiché maggiore è la concentrazione di semi, maggiori saranno i colpi di cristallizzazione. Capovolgere ciascun vetrino coprioggetto in modo che la goccia di liquido sia rivolta verso il basso e posizionarla sopra quella appropriata. Premere bene verso il basso il vetrino coprioggetti, comprimendo il grasso del soffitto e formando una tenuta sicura.

Una volta che tutte le 96 gocce sono state stabilite, trasferire il vassoio in un incubatore a una temperatura compresa tra quattro e 18 gradi Celsius o in una stanza a temperatura costante per la conservazione. Per eseguire la nostra proiezione MMS in 96, ben seduti vassoi di goccia. Utilizzare un robot di cristallizzazione o una pipetta a otto canali per trasferire da 20 a 50 microlitri di ciascuna condizione da un vaglio di cristallizzazione a 96 condizioni in formato blocco di pozzetti profondi in ciascun pozzetto corrispondente del vassoio di cristallizzazione.

Successivamente, trasferisci 1,0 microlitri di soluzione proteica, 1,0 microlitri di condizione di cristallizzazione e 0,5 microlitri di brodo di semi nelle gocce. Sigillare il vassoio utilizzando un foglio trasparente per controsoffitti e trasferirlo in un incubatore a una temperatura compresa tra quattro e 18 gradi Celsius o a temperatura costante. Gli esperimenti devono essere ispezionati una volta ogni 24 ore per cinque giorni dopo l'istituzione, e poi successivamente una volta ogni sette giorni per un massimo di quattro settimane utilizzando un microscopio binoculare o un sistema di imaging a cristallo. Ispezionare ogni sottopozzetto o vetrino di copertura in sequenza e registrare qualsiasi prova di formazione di cristalli.

Confronta i risultati dei nostri esperimenti di screening MMS con quelli provenienti da screening non ED e registra eventuali differenze. Potrebbero essere necessari più cicli di RMMS osservati. Prima di ottenere una qualità di diffrazione ottimale, i cristalli vengono prodotti per ulteriori cicli.

Utilizzare le scorte di semi diluiti archiviate secondo necessità per controllare il numero di cristalli per pozzetto. Per dimostrare l'efficacia di RMMS. I metodi di screening sono stati applicati alla cristallizzazione dell'henné, del lisozima bianco e del catalizzatore del fegato bovino per ciascuna condizione della proteina 3 96.

Sono stati utilizzati schermi di cristallizzazione J-C-S-G-P-A-C-T e Morpheus. Quindi, dopo cinque giorni, è stata selezionata e utilizzata una singola condizione di ciascun vassoio che è stata trovata per supportare la crescita del materiale cristallino. Dopo cinque giorni, i vassoi di cristallizzazione sono stati ispezionati ed è stato registrato il numero di gocce con cristalli.

Questa figura riassume i risultati di questo esperimento e fornisce un'analisi quantitativa per il lisozima dell'albume d'uovo di gallina. Quando RMMS è stato applicato a questa proteina, è stato osservato un aumento da quattro a dieci volte del tasso di successo della cristallizzazione rispetto ai vassoi non ED. In particolare, per la catalasi epatica bovina, è stato riscontrato che solo una singola condizione nello schermo Morpheus produce cristalli, rispetto alle 55 condizioni identificate in seguito all'uso di RMMS.

Inoltre, c'è stato un aumento di tre e due volte del tasso di successo della cristallizzazione delle lattine di fegato bovino utilizzando rispettivamente gli schermi JCSG e PACT in tutti i casi e, indipendentemente dallo schermo di cristallizzazione utilizzato, il nostro screening MMS ha prodotto un numero totale di cristalli significativamente maggiore rispetto allo screening non RMMS. Concludiamo che il nostro MMS è un approccio semplice ma potente, che può aumentare significativamente il tasso di successo degli esperimenti di screening della cristallizzazione delle proteine. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come eseguire un esperimento di screening casuale di matrici seminate con micros dall'identificazione e raccolta di materiale cristallino attraverso la preparazione del ceppo di semi di cristallo e, infine, l'istituzione della cristallizzazione seminata Una volta padroneggiata.

Questa tecnica può essere eseguita in meno di un'ora. Per esperimenti di screening di micro semina a matrice casuale eseguiti utilizzando un robot per la manipolazione di liquidi o in circa tre ore per esperimenti eseguiti a mano. Durante il tentativo di questa procedura, è importante assicurarsi che tutti i filtri di cristallizzazione seminati siano ben sigillati prima dello stoccaggio.