Multi-target Parallel Processing Approccio per Gene-to-struttura Determinazione della polimerasi Influenza PB2 subunità

L'obiettivo generale del seguente esperimento è quello di utilizzare un approccio multi-target per la determinazione strutturata di una proteina bersaglio mediante cristallografia a raggi X, iniziando con un solo gene o sequenza genetica nel caso qui presentato. La proteina bersaglio è la subunità PB due polimerasi dell'influenza A, un componente chiave della replicazione virale. L'approccio multi-bersaglio si ottiene progettando e clonando in primo luogo una serie di costrutti genetici in parallelo basati sulla singola sequenza bersaglio e su altre informazioni note sulla proteina.

Il secondo passo consiste nel testare i livelli di espressione per ciascun costrutto e selezionare i migliori per l'espressione proteica su larga scala in coltura cellulare. Il passo successivo richiede la rottura delle cellule aperte per rimuovere le proteine bersaglio dal materiale di espressione e raffinare ciascuna di esse a una purezza molto elevata. Una serie di prove di cristallizzazione vengono quindi impostate con ciascuna proteina per ottenere una forma cristallina adatta agli studi a raggi X.

I dati di diffrazione dei raggi X ad alta risoluzione vengono quindi raccolti su uno o più cristalli e utilizzati per risolvere e perfezionare una mappa di densità elettronica che delinea la struttura di ciascuna proteina bersaglio. Questi risultati consentono il rendering di una struttura tridimensionale della proteina bersaglio basata sulla mappa della densità elettronica. L'elaborazione multi-targett aumenta notevolmente la probabilità di successo nella determinazione strutturata, fornendo alternative praticabili ad ogni potenziale ostacolo nel percorso.

Anche lavorare su più bersagli in parallelo è altamente efficiente, riducendo il tempo e il costo per proteina in ogni fase. Il potenziale di aumentare la velocità con cui viene completata la determinazione strutturata per i bersagli farmacologici consentirà maggiori opportunità di sviluppo di terapie all'anno. Sebbene questo metodo possa fornire preziose informazioni in biologia strutturale, le proteine di alta qualità ottenute attraverso questi metodi possono supportare qualsiasi indagine basata sulle proteine.

Ogni fase del processo ha la sua scienza e richiede le sue competenze, ma l'investimento in persone, strumentazione e know-how può ripagare magnificamente una volta assemblati tutti i pezzi. Una volta selezionato un gene bersaglio e un prodotto genico per l'indagine, il primo passo richiede la progettazione di più varianti o costrutti genetici. Il software di composizione genica viene utilizzato per progettare questi costrutti a livello proteico insieme al codice associato su sequenze geniche sintetiche ingegnerizzate.

Utilizzando il modulo visualizzatore di allineamento e il modulo di progettazione dei costrutti, è possibile confrontare gli allineamenti delle sequenze proteiche e definire i primer o le ampere terminali PCR e PCR vettoriali. Successivamente, utilizzare l'algoritmo da proteina a DNA del compositore genetico per tradurre a ritroso ogni sequenza di amminoacidi in un codice su una sequenza di acido nucleico ingegnerizzata. Utilizzare il codice appropriato nella tabella di utilizzo per ottimizzare la sequenza per l'espressione in una riga cellulare specifica.

In questo caso, i batteri e coli. Una volta che la sequenza genica bersaglio è pronta, clonare virtualmente e inserire il gene in un plasmide vettore adatto per l'espressione batterica. In questo caso un vettore PET 28 modificato.

Questo vettore contiene alcuni componenti necessari per l'espressione e la purificazione delle proteine. Il gene bersaglio viene modificato per incorporare una sequenza di tag di istamina all'estremità N o C della proteina e una sequenza di scissione per consentire la rimozione del tag durante la purificazione. Il vettore possiede anche un gene di resistenza agli antibiotici per i test di espressione e la fermentazione.

Ogni sequenza genetica della proteina bersaglio viene quindi creata con metodi standard di sintesi genica in preparazione al clonaggio in tubo polimerasi Clonaggio di estensione primaria incompleta, o clonaggio in tubo è una strategia di clonazione basata su PCR in cui il gene bersaglio viene amplificato con primer complementari al vettore previsto. Questo metodo sfrutta la natura incompleta della PCR in fase avanzata, che lascia i prodotti PCR con terminali a singolo filamento variabili. Preparo l'inserto PCR o IPCR aggiungendo cinque microlitri ciascuno di primer diretti e inversi a ciascuna reazione.

In una piastra a 96 pozzetti secondo una mappa di piastre, aggiungere due microlitri di ciascun gene sintetico a lunghezza intera al pozzetto appropriato secondo la mappa di piastra. Dopo aver aggiunto 25 microlitri di master mix PFU a ciascuno, eseguire un ciclo di reazioni 25 volte utilizzando le seguenti condizioni di PCR. Denaturare a 95 gradi Celsius per 30 secondi.

Anil a 50 gradi Celsius per 45 secondi ed estendere a 68 gradi Celsius per tre minuti. L'amplificazione dei frammenti è confermata dall'analisi su gel AGROS dei prodotti IPCR. I prodotti IPCR di successo sono rappresentati da bande robuste.

I risultati meno desiderabili sono spesso visti come bande deboli o striscianti in una reazione separata. L'espressione del plasmide è amplificata dalla PCR vettoriale o l'amplificazione dei frammenti VPCR è confermata dall'analisi su gel AROS dei prodotti VPCR. Una volta che i prodotti IPCR e VPCR sono stati amplificati, vengono aggiunti a una piastra di fusione e inseriti in un termociclatore per la reazione di fusione.

I costrutti clonati con successo vengono quindi trasformati in cellule di e coli chimicamente competenti e conservati in steli di glicerolo per iniziare la serie di test di espressione. Una piccola quantità di ciascun campione da uno stock di glicerolo di costrutto clonato su una piastra di agar separata. La piastra è realizzata con brodo nutriente batterico e il marcatore antibiotico Kanamicina codificato nel vettore, incuba per una notte a 37 gradi Celsius il giorno successivo.

Avviare una pre-coltura per ogni campione prelevando una singola colonia dalla piastra di agar appena coltivata. Usa questa colonia per inoculare 1,2 millilitri di brodo TB integrato con micina in lattina e glucosio per la lavorazione parallela. Ogni pre-coltura viene coltivata in un blocco inferiore rotondo da 96 pozzetti.

Coltiva durante la notte a 37 gradi Celsius con agitazione a 220 rotazioni al minuto. Dopo la crescita notturna. Avviare colture a induzione su piccola scala per ogni campione utilizzando 40 microlitri di pre-coltura per l'inoculazione.

1,2 millilitri di brodo per la tubercolosi. Integrato con 50 milligrammi per millilitro di lattina di micina e sistema espresso notturno novagen. Uno, coltivare le colture a induzione a 20 gradi Celsius per 48 ore, agitando a 220 RPM le cellule di raccolta mediante centrifugazione a 4.000 unità GForce per 15 minuti.

Versare il surnatante e conservare i pellet a una temperatura negativa di 20 gradi Celsius per almeno un'ora prima di un'ulteriore lavorazione dopo la purificazione. Analizzare la proteina con e senza reazione di scissione mediante elettroforesi capillare utilizzando un sistema calibro da laboratorio CHIP 90 secondo il protocollo del produttore. Nel caso dell'influenza una PB a due subunità proteiche, 14 dei 34 costrutti hanno portato alla proteina bersaglio solubile e sono entrati nella fase successiva: la fermentazione su larga scala.

Per iniziare una fermentazione su larga scala, inoculare 100 millilitri di brodo di coltura cellulare batterica contenente 50 milligrammi per millilitro. La micina può essere prodotta da una scorta di glicerolo e crescere durante la notte a 37 gradi Celsius? Agitando a 220 giri/min il giorno successivo, espandere la precoltura utilizzando 10 millilitri per inoculare.

Un litro di brodo contenente mezzi di autoinduzione e 50 milligrammi per millilitro può micina in un pallone deflettore da due litri. Agitare le colture espanse a 37 gradi Celsius circa ogni 30 minuti. Controllare la densità ottica della coltura misurando l'assorbanza UV a una lunghezza d'onda di 600 nanometri.

Quando viene raggiunta una densità ottica di 0,6, modificare la temperatura dell'incubatore vibrante a 20 gradi Celsius dopo il tempo di crescita desiderato. Rimuovere un quad di Ali rappresentativo da 10 millilitri da ciascun costrutto per il test di espressione. Raccogliere le cellule mediante centrifugazione a 5.000 unità GForce per 15 minuti.

Versare il surnatante e congelare il pellet cellulare a una temperatura negativa di 80 gradi Celsius. Per iniziare questa procedura, scongelare e risospendere la pasta cellulare nel tampone di lisi con un rapporto di volume master da uno a cinque. Mescolare energicamente per 30 minuti a quattro gradi Celsius.

Usa una spatola pulita per staccare i pezzi dal lato del bicchiere. Lice meccanicamente le cellule sul ghiaccio con un sonicato massonico. Chiarificare il lisato grezzo mediante centrifugazione a 18.000 unità GForce per 30 minuti a quattro gradi Celsius.

Raccogliere il surnatante e conservare una piccola aliquota per l'analisi prima di procedere con la purificazione su larga scala. Confermare l'espressione proteica su larga scala di ciascuna coltura tramite l'analisi del gel della pagina SDS. Questo risultato rappresentativo della pagina SDS mostra una robusta espressione proteica, circa il 50% di solubilità e circa il 50% di scissione.

In questo caso, l'etichetta dell'istidina è stata rimossa insieme a un'etichetta di solubilità proteica aggiunta, che è stata ingegnerizzata nel costrutto originale. La resina di nichel viene utilizzata per separare la proteina bersaglio con l'etichetta unica dell'istamina da tutto il resto del materiale cellulare, comprese le proteine batteriche native. Una colonna di nichel viene preparata mediante lavaggio con quattro volumi di colonna di acqua UE per rimuovere il tampone di stoccaggio, seguita da un volume di colonna di tampone B e cinque volumi di colonna di tampone.

La parallelizzazione dell'equilibrio A per E viene eseguita con il creatore di proteine, che è in grado di eseguire più colonne contemporaneamente. Caricare ogni lisato chiarificato contenente proteina solubilizzata con tag istaminico in una colonna separata a una velocità di due millilitri al minuto, seguito da diversi lavaggi del volume della colonna con il tampone A, raccogliere il flusso attraverso il tampone e salvare per l'analisi. Eluire la proteina legata in una serie di gradienti a gradini con i tamponi A e B a 95 a cinque, da 60 a 40, e infine il 100% di tampone B. I componenti del tampone B competono con l'istamina per la resina di nichel e quindi rimuovono la proteina dalla colonna ad un dato rapporto.

Raccogli ogni frazione di eluizione separatamente. Di seguito è mostrato il risultato di un cromatogramma rappresentativo di una corsa su una colonna di nichel. Analizza le frazioni eluse di nichel, il lisato grezzo, il lisato chiarificato e quello di nichel attraverso la pagina SDS e confronta con l'assorbanza UV a 280 nanometri raccolta durante la purificazione della colonna.

Questo passaggio determina se la purificazione è andata a buon fine. Selezionare e raggruppare le frazioni contenenti la proteina bersaglio da portare avanti per un'ulteriore elaborazione. Calcola la quantità totale di proteine in questa fase con il coefficiente di estinzione teorico della proteina, misurando l'assorbanza UV a 280 nanometri e tenendo conto del volume totale delle frazioni raggruppate.

Salvare un piccolo campione per l'analisi. Il gene per la proteina bersaglio è stato codificato con una sequenza specifica, che è riconosciuta da ULP one come un sito di scissione, quindi l'aggiunta di ULP one provoca la scissione tra il tag istidina e la proteina di interesse. Per iniziare questa procedura, aggiungere un microlitro di ubiquitina come la proteasi, uno per ogni cinque milligrammi di proteine presenti nelle frazioni raggruppate.

A questo punto, la proteina scissa viene trasferita dal tampone B al tampone A per un'ulteriore elaborazione utilizzando un tubo di dialisi, dializzata la proteina contro due litri di tampone, A per quattro ore a quattro gradi Celsius con agitazione. Utilizzare un cutoff di peso molecolare di 10 kilodalton per PB due dopo la dialisi. Eseguire un altro gel di pagina SDS della proteina bersaglio con e senza ULP presente.

Questo determinerà se la scissione ULP one è andata a buon fine e consentirà la selezione delle migliori frazioni da portare avanti per un'ulteriore elaborazione. Mostrati qui i risultati della nostra pagina SDS rappresentativa per tre costrutti della polimerasi pb. Due marcatori di peso molecolare delle subunità si trovano nella corsia uno.

Le corsie due, sei e 10 sono proteine raggruppate da colonne di nichel uno. Le corsie tre, sette e 11 contengono il flusso di proteine scisse nel tampone A dal nichel due e dalle corsie quattro, otto e 12. Mostra la rimozione dell'etichetta dell'istamina nel tampone B dal nichel due.

Dopo la rimozione dell'istamina, si concentrano le frazioni raggruppate dal nichel due. Per iniziare la SEC, la resina appropriata deve essere scelta nuovamente in base al peso molecolare del bersaglio In questo caso, viene utilizzata la colonna acere S 110 su 30 GL ed equilibrata con 200 millilitri di tampone SEC a una velocità di flusso di 0,5 millilitri al minuto utilizzando una siringa da cinque millilitri, caricare il campione in un ciclo di campionamento da 10 millilitri e iniziare la corsa della colonna SEC. Monitora il cromatogramma assorbente UV a 280 nanometri mentre raccogli piccole frazioni di volume.

Esegui tutte le frazioni SEC rilevanti tramite la pagina SDS. L'approccio standard alle prove di cristallizzazione delle proteine è condotto con il metodo della goccia seduta che coinvolge la diffusione del vapore. Non è raro impostare due o più schermi a matrice sparsa fin dall'inizio per ogni proteina bersaglio.

Per avviare questo processo, preriempire ogni serbatoio di una piastra di cristallizzazione junior compatta da 96 pozzetti con 80 microlitri ciascuno, nello schermo di cristallizzazione selezionato, erogare 0,4 microlitri di proteine nel tampone SEC in ciascuno dei 96 pozzetti. Quindi aggiungere 0,4 microlitri del filtro di cristallizzazione, assicurando la completa miscelazione della goccia in ciascuno. Copri bene l'intera banchina con del nastro adesivo per soffitti cristallino, assicurando una tenuta completa su ogni pozzetto, conserva la piastra a 16 gradi Celsius in un luogo indisturbato e privo di vibrazioni ambientali.

Controllare periodicamente la cristallizzazione delle proteine nelle settimane successive al microscopio da dissezione. Se i cristalli proteici non compaiono, posiziona nuove piastre con condizioni diverse e varia la concentrazione proteica nella goccia finale per aumentare la probabilità di successo prima della raccolta. Raffreddare un disco in stile A LS in un doer riempito di azoto liquido e coprire con un coperchio per iniziare la raccolta.

Taglia il nastro trasparente che copre il pozzetto con il cristallo proteico bersaglio fino a un vuoto vicino. Bene aggiungere 1,6 microlitri della condizione cristallizzante corrispondente e combinarla con 0,4 microlitri di glicole etilenico. Una soluzione di glicole etilenico al 20% allo stato cristallizzante protegge il cristallo proteico.

Durante il congelamento criogenico, analizzare il cristallo al microscopio e selezionare un ciclo criogenico adatto per la raccolta, abbinando il diametro interno dell'anello alla larghezza massima del cristallo. Collegare l'anello criogenico a una bacchetta magnetica di cristallo e avvolgere il cristallo direttamente dalla soluzione del pozzetto. Immergere immediatamente il criociclo con il cristallo raccolto in un crioprotettore e poi immergerlo nel disco in stile LS.

Per lampeggiare, congelare il cristallo ripetere per un numero desiderato di cristalli. Una volta completata la raccolta, usa una bacchetta per posizionare un coperchio magnetico sul disco contenente cristalli congelati con lingue piegate. Capovolgi il disco per il passaggio successivo.

Avvita uno spingidisco sul disco, quindi trasferisci il disco all'attore KU e usalo per staccare il coperchio. I cristalli nel disco rimangono congelati in un bagno di azoto liquido fino a quando non sono pronti per gli studi di diffrazione dei raggi X utilizzando il software di acquisizione delle immagini J Director. Impostare i seguenti parametri per la fenditura del fascio di schermatura dei cristalli a 0,5 gradi, la distanza del rivelatore di 50 millimetri, il passo dell'immagine a 70 gradi e la lunghezza dell'esposizione di 30 secondi.

Ecco uno screenshot di esempio dal software di acquisizione delle immagini Mentre un cristallo viene schermato, il pannello centrale mostra la diffrazione di raggi X osservata da un cristallo rappresentativo e raccoglie immagini sufficienti ad alta risoluzione per un set completo di dati necessari per la determinazione della struttura tridimensionale. Le strategie di clonazione e purificazione delle proteine dimostrate in questo video hanno portato a 14 campioni di PB purificati, due campioni da cui nove hanno prodotto cristalli adatti per studi di diffrazione. Il set di dati di diffrazione dei raggi X è stato raccolto su cinque dei nove costrutti con radiazione QK alfa utilizzando un generatore di raggi X ad anodo rotante FRE super luminoso rigaku, dotato di ossec variax hf, ottiche HF e un rivelatore CCD Saturn 944 plus.

Qui è mostrata un'immagine di diffrazione a raggi X della subunità due della polimerasi PB. Ogni set di dati è stato elaborato e sono state determinate un totale di quattro strutture della sottounità PB due. Ogni struttura è stata sottoposta a revisione paritaria e caricata nella banca dati delle proteine per l'accesso pubblico.

Questa figura mostra i diagrammi a nastro delle molecole nell'unità asimmetrica cristallografica. Delle quattro due strutture PB, le strutture secondarie sono colorate in un modello arcobaleno con i corrispondenti codici PDB. In questa tabella è mostrata l'analisi dei risultati per i due bersagli dell'influenza PB con i metodi descritti in questo articolo video.

La pipeline di elaborazione parallela multi targett per la determinazione da gene a struttura è illustrata in cinque fasi: clonazione, solubilità, purificazione, cristallizzazione e determinazione della struttura. I risultati della nostra pipeline di biologia strutturale non solo forniscono la base per la ricerca basata sulla struttura, ma alimentano anche ulteriori studi come saggi funzionali per confermare la funzione delle proteine o lo screening biofisico di nuovi composti mediante MAR o SPR per identificare nuovi punti di partenza per lo sviluppo di farmaci. Questa tecnica e gli strumenti inventati insieme ad essa hanno contribuito a spianare la strada ai biologi strutturali per rilevare molti tipi di indagini basate sulla scoperta, tra cui la progettazione di farmaci basata sulla struttura, che ha avuto un enorme impatto sulla salute e sulle malattie umane.

Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come l'elaborazione parallela multi targett possa aumentare notevolmente il successo della determinazione strutturata. Non dimenticare che lavorare in un laboratorio di biologia strutturale può essere estremamente pericoloso e le dovute precauzioni, come l'uso dei DPI, dovrebbero essere sempre prese durante le attività di laboratorio.