Analisi quantitativa di autofagia usando 3D avanzato microscopia a fluorescenza

L'obiettivo generale di questa procedura è ottenere immagini quantitative delle cellule tumorali della prostata trattate per misurare il grado e l'estensione dell'autofagia in diversi punti temporali. Ciò si ottiene trattando prima le cellule con arginina, dase o altri reagenti sperimentali per indurre l'autofagia e/o la morte cellulare. Il secondo passo consiste nel decidere se visualizzare le cellule vive o le cellule fissate e preparare i campioni di conseguenza.

Successivamente, è possibile ottenere immagini a fluorescenza 3D di cellule vive o fisse utilizzando la microscopia a fluorescenza a campo largo, a deconvoluzione o a illuminazione strutturata. Il passo finale consiste nel raccogliere dati statistici sulla distribuzione delle dimensioni degli autofagosomi e sulla colocalizzazione con altre strutture intracellulari. Utilizzando un software di analisi digitale delle immagini 3D, questo approccio può ottenere risultati che mostrano non solo che l'induzione automatica dei fagi da parte dell'arginina dasi può causare la morte delle cellule tumorali della prostata, ma anche che queste cellule mostrano cambiamenti strutturali che sono morfologicamente distinti dai cambiamenti associati all'apoptosi e alla necrosi.

Il vantaggio principale di questa tecnica rispetto ad altri metodi attualmente esistenti è che l'imaging 3D quantitativo può mostrare quando e dove si verifica uno specifico evento molecolare all'interno di una cellula vivente e quindi presentarlo in un formato tridimensionale Per iniziare a crescere cellule tumorali della prostata umana che esprimono la proteina fluorescente verde, catena leggera accoppiata tre su piastre di coltura con fondo in vetro rivestito in polide licena da 35 millimetri come descritto nel protocollo di testo, le cellule devono essere piastrate a densità sufficiente per facilitare una rapida proliferazione, ma non così tanto da far sì che le cellule siano troppo cresciute e raggruppate al momento dell'imaging. Trattare campioni di cellule selezionate con arginina dasi o una DI in PBS per esaurire le cellule di arginina libera e indurre stress metabolico nelle cellule tumorali circa un'ora prima dell'imaging Diluire 1,5 microlitri di Lyo tracker red con 20 millilitri di RPMI contenente il 10% di FPS e l'1% di antibiotici. Preparare le soluzioni con un DI per i campioni selezionati che sono stati trattati dopo aver riscaldato tutti i terreni a 37 gradi Celsius.

Aggiungere il terreno appropriato a ciascuna piastra di coltura incubare le cellule con RPMI contenente LYO Tracker red per 15-45 minuti a 37 gradi Celsius, circa 30 minuti prima dell'imaging. Accendere l'involucro ambientale della stazione meteorologica e consentire l'equilibrio a 37 gradi Celsius e le celle di lavaggio con anidride carbonica al 5% con PBS e sostituire i terreni con RPMI standard contenenti solo il 10% di FBS e l'1% di antibiotici. Aggiungere un'DI ai campioni come indicato.

Monta piastre di coltura con fondo in vetro da 35 millimetri in un adattatore personalizzato. Utilizzare l'olio da immersione sull'obiettivo a sei ingrandimenti DX, apertura numerica 1,42 e posizionare il piatto di coltura montato sul tavolino del microscopio. In questo video, la microscopia 3D viene dimostrata utilizzando il microscopio di posizione applicato Delta Vision Personal IDV, il microscopio a deconvoluzione e la suite di applicazioni Associated Soft Works.

Per iniziare, accendere il sistema del microscopio, compresa la stazione di acquisizione e il controller dello strumento. Aprire l'applicazione di controllo del computer 3D per inizializzare il tavolino del microscopio e accendere la sorgente di luce allo xeno. Attendere 10 minuti affinché la sorgente luminosa si riscaldi e raggiunga condizioni stabili.

Aggiungere una goccia di olio da immersione sull'obiettivo a sei ingrandimenti DX, apertura numerica 1,42 e centrare il campione del vetrino con il vetrino coprioggetto a faccia in giù sopra l'obiettivo utilizzando il campo chiaro o l'illuminazione esterna, nonché la messa a fuoco grossolana. Manopola di regolazione: sollevare lentamente la lente dell'obiettivo fino a quando il battito dell'olio da immersione non entra in contatto con il vetro di copertura invertito. Da questo punto, lo strato di celle dovrebbe essere messo a fuoco entro pochi giri dalla manopola di regolazione della messa a fuoco fine.

Quando si lavora con campioni fissi sui vetrini, si consiglia di evitare le celle all'interno o vicino a qualsiasi area con bolle. Durante la visualizzazione con campioni vivi sul piatto inferiore in vetro, evitare di spostare la lente dell'obiettivo al di fuori del limite del vetrino coprioggetti. Selezionare il campo visivo desiderato.

Idealmente, le cellule dovrebbero mostrare un buon segnale fluorescente in tutti i canali appropriati ed essere sufficientemente attaccate e distribuite sulla superficie del vetrino coprioggetti in modo che il contenuto intracellulare sia facile da visualizzare. Piccole regolazioni della messa a fuoco laterale X, Y e Z possono essere controllate dal computer utilizzando l'interfaccia di acquisizione 3D. Impostare il benning su uno per uno o due per due a seconda del campo visivo desiderato per una data immagine attraverso la sezione centrale di una cella, impostare i parametri di esposizione in modo tale che l'intensità massima dei pixel non superi i 3000 conteggi.

In generale, la percentuale di trasmissione dovrebbe essere impostata al livello più basso possibile senza aumentare l'esposizione corrispondente. Tempo superiore a un secondo. Ripetere questa procedura per ogni colore di fluorescenza da acquisire e per ogni campo visivo separato.

Per ottenere immagini di altissima qualità, impostare i limiti superiore e inferiore dello Zack regolando leggermente la messa a fuoco rispettivamente sopra la parte superiore e inferiore del campione di celle. Il numero totale di immagini in una data pila Z sarà quindi determinato da questi limiti e dalla spaziatura tra i livelli. Per ridurre al minimo gli artefatti di movimento durante l'acquisizione dell'immagine, la modalità di acquisizione dell'immagine può essere impostata sulla lunghezza d'onda.

Quindi lo stack ZS per i campioni fissi e lo stack ZS e la lunghezza d'onda per i campioni dal vivo. Dopo aver impostato tutti i parametri, è possibile acquisire le immagini a fluorescenza. Le immagini a fluorescenza vengono quindi devolute utilizzando lavori morbidi e successivamente analizzate utilizzando la velocità.

La sequenza di immagini mostrata qui mostra i cambiamenti fisici che si verificano nelle cellule cwr 22 durante i primi 80 minuti di induzione dell'autofagia. In queste immagini, la linea tratteggiata bianca rappresenta il contorno della cellula e la regione ombreggiata dalla luce rappresenta la posizione del nucleo. Nel corso di 80 minuti, le immagini rivelano lo spostamento del nucleo lontano dal centro della cellula, la riduzione dei punti focali di adesione e la traslocazione generale di autosomi e lisosomi verso il centro della cellula, visualizzati qui rispettivamente in verde e rosso nei punti temporali successivi.

È stato osservato anche un piccolo aumento della colocalizzazione tra autosomi e lisosomi, come indicato dal colore giallo. La suite di applicazioni di imaging digitale velocity è stata quindi utilizzata per identificare, contare e raccogliere dati statistici su autosomi e lisosomi marcati nelle immagini delle cellule CWR 22. Qui mostrato, il numero e la dimensione degli autosomi dopo la loro formazione iniziale alla comparsa variano nel tempo.

Dopo 80 minuti di induzione dell'autofagia, c'è stata una graduale diminuzione della rete dei bottoni nel numero di autosomi con un corrispondente aumento della dimensione media degli autosomi. Inoltre, c'è stato un aumento misurabile della colocalizzazione degli autosomi e dei lisosomi sulla base dell'analisi del coefficiente di correlazione di Pearson. Insieme, questi risultati hanno suggerito che dopo la stimolazione dell'autofagia, numerosi piccoli autosomi si sono formati per formare autosomi più grandi nel tempo.

Qui viene mostrato un confronto fianco a fianco di immagini acquisite e ricostruite in modalità DV, deconvoluzione a campo largo simulata e modalità di illuminazione strutturata. Utilizzando il microscopio OMX, la risoluzione laterale è stata migliorata fino a 120 nanometri, il doppio della risoluzione della microscopia a diffrazione limitata convenzionale. La colocalizzazione su piccola scala di autosomi e lisosomi era chiaramente evidente con la microscopia a super risoluzione, mentre era difficilmente evidente con l'imaging a fluorescenza convenzionale.

Uno dei vantaggi dell'utilizzo della microscopia a deconvoluzione è quello di ricostruire tutte le immagini in un modello 3D che rivelerà informazioni spaziali più accurate tra diverse molecole. Qui è mostrato un quadro generale di una cellula Cwr 22 RV in fase di autofagia in un momento successivo in cui inizia a verificarsi una quantità significativa di colocalizzazione tra autosomi e lisosomi. La colorazione coerente, come indicato nel colore bianco, rivela il contorno della cellula bersaglio in questo filmato.

Il modello ricostruito in 3D fornisce maggiori dettagli spaziali della fusione tra autosomi e lisosomi. Come indicato nel colore giallo, l'interazione tra i segnali della catena luminosa verde tre e i segnali lisosomiali rossi è evidente nella presenza dei segnali fusi per produrre il giallo. Quindi questo approccio affronterà due grandi sfide per i ricercatori con studi sull'autofagia.

Prima di tutto, vogliamo mantenere un ambiente privo di stress utilizzando il microfluido, la camera di profusione, per mantenere la sua condizione fisiologica originale sui tavolini del microscopio. La seconda sfida è quella di raccogliere dati quantitativi di immagini statisticamente rilevanti e per le celle fisse di solito prendiamo molte immagini da celle diverse e le compiliamo in informazioni utili. Tuttavia, con la cellula vitale, seguiamo semplicemente una cellula nel tempo per acquisire informazioni equivalenti.

Quindi crediamo che questa tecnica consentirà ad altri ricercatori di studiare la funzione e il ruolo dell'autofagia in diversi organi e diverse malattie.