Analisi quantitativa di autofagia usando 3D avanzato microscopia a fluorescenza

L'obiettivo generale di questa procedura è ottenere immagini quantitative di cellule tumorali della prostata trattate, al fine di misurare il grado e l'estensione dell'autofagia in diversi punti temporali. Questo viene raggiunto innanzitutto trattando le cellule con arginina, dase o altri reagenti sperimentali per indurre l'autofagia e/o la morte cellulare. Il secondo passaggio consiste nel decidere se effettuare l'immagine di cellule vive o di cellule fissate e preparare i campioni di conseguenza.

Successivamente, acquisire immagini fluorescenti tridimensionali di cellule vive o fissate mediante microscopia fluorescente a campo chiaro, deconvoluzione o illuminazione strutturata. L'ultimo passaggio consiste nel raccogliere dati statistici sulla distribuzione dimensionale degli autofagosomi e sulla loro colocalizzazione con altre strutture intracellulari. Utilizzando un software di analisi digitale delle immagini 3D, questo approccio permette di ottenere risultati che mostrano non solo come l'induzione autofagica mediata da arginina degradasi possa indurre la morte delle cellule tumorali della prostata, ma anche come queste cellule presentino cambiamenti strutturali morfologicamente distinti rispetto ai cambiamenti associati all'apoptosi e alla necrosi.

Il principale vantaggio di questa tecnica rispetto ad altri metodi attualmente esistenti è che l'imaging quantitativo 3D può mostrare quando e dove si verifica un determinato evento molecolare all'interno di una cellula vivente, presentandolo successivamente in un formato tridimensionale. Per iniziare, coltivare cellule di carcinoma prostatico umano che esprimono la proteina fluorescente verde, coniugata alla catena leggera tre, in piatti di coltura da 35 millimetri con fondo in vetro rivestito di poli-l-lisina, come descritto nel protocollo testuale. Le cellule devono essere seminate a una densità sufficiente da favorire una rapida proliferazione, ma non eccessiva al punto che risultino sovraconfluenti e aggregate al momento dell'acquisizione delle immagini. Trattare i campioni cellulari selezionati con arginasi o un DI in PBS per esaurire le riserve di arginina libera e indurre stress metabolico nelle cellule tumorali circa un'ora prima dell'acquisizione delle immagini. Diluire 1,5 microlitri di Lyo tracker red con 20 millilitri di RPMI contenente il 10% di FPS e l'1% di antibiotici. Preparare le soluzioni con un DI per i campioni selezionati che sono stati trattati, dopo aver riscaldato tutti i mezzi a 37 gradi Celsius.

Aggiungere il mezzo appropriato a ogni piastra di coltura e incubare le cellule con RPMI contenente LYO Tracker rosso per 15-45 minuti a 37 gradi Celsius, circa 30 minuti prima dell'acquisizione delle immagini. Accendere l'incubatore ambientale della stazione meteorologica e lasciare che raggiunga l'equilibrio a 37 gradi Celsius e 5% di anidride carbonica, lavare le cellule con PBS e sostituire il mezzo con RPMI standard contenente solo 10% di FBS e 1% di antibiotici. Aggiungere un DI ai campioni come indicato.

Montare piatti per colture con fondo in vetro da 35 mm in un adattatore personalizzato. Utilizzare olio di immersione sull'obiettivo con ingrandimento 6 DX e apertura numerica 1,42 e posizionare il piatto per colture montato sul palchetto del microscopio. In questo video, la microscopia 3D viene dimostrata utilizzando il microscopio Delta Vision Personal DV con posizionamento applicato, deconvoluzione e suite applicativa Associated Soft Works.

Per iniziare, accendere il sistema del microscopio, inclusi la stazione di acquisizione e il controllore dello strumento. Aprire l'applicazione di controllo computerizzato Resolve 3D per inizializzare la piastra del microscopio e accendere la sorgente luminosa allo xenon. Attendere 10 minuti affinché la sorgente luminosa si riscaldi e raggiunga condizioni stabili.

Aggiungere una goccia di olio di immersione sull'obiettivo con ingrandimento 6 DX e apertura numerica 1,42 e centrare il campione del vetrino con il coprioggetto rivolto verso il basso rispetto all'obiettivo, utilizzando l'illuminazione a campo chiaro o un'illuminazione esterna, insieme al fuoco grossolano. Ruotare lentamente la manopola di regolazione per sollevare l'obiettivo finché la goccia di olio di immersione non entra in contatto con il coprioggetto capovolto. Da questo punto in poi, lo strato cellulare dovrebbe entrare a fuoco in poche rotazioni della manopola di regolazione del fuoco fine.

Quando si lavora con campioni fissati sui vetrini, si consiglia di evitare le cellule all'interno o vicino a zone con bolle d'aria. Quando si osservano campioni vivi in una piastra con fondo in vetro, evitare di spostare la lente dell'obiettivo al di fuori del limite del coprioggetto in vetro. Selezionare il campo visivo desiderato.

In condizioni ideali, le cellule dovrebbero mostrare un buon segnale fluorescente in tutti i canali appropriati ed essere sufficientemente aderenti e ben espanse sulla superficie del vetrino in modo che il contenuto intracellulare sia facile da visualizzare. Piccoli aggiustamenti laterali del fuoco nei piani X, Y e Z possono essere controllati dal computer utilizzando l'interfaccia di acquisizione 3D. Impostare il binning su uno per uno oppure due per due, a seconda del campo visivo desiderato per una determinata immagine attraverso la sezione mediana di una cellula, e regolare i parametri di esposizione in modo che l'intensità massima del pixel non superi i 3000 conteggi.

Generalmente, la percentuale di trasmissione dovrebbe essere impostata il più bassa possibile senza aumentare il tempo di esposizione corrispondente. Tempo superiore a un secondo. Ripetere questa procedura per ogni colore di fluorescenza da acquisire e per ogni campo visivo separato.

Per ottenere immagini della massima qualità, impostare i limiti superiore e inferiore dello Zack regolando leggermente il fuoco rispettivamente appena sopra e sotto il campione cellulare. Il numero totale di immagini in un dato stack Z sarà quindi determinato da questi limiti e dalla distanza tra i livelli. Per ridurre al minimo gli artefatti di movimento durante l'acquisizione delle immagini, la modalità di acquisizione può essere impostata per lunghezza d'onda.

Quindi stack ZS per campioni fissati e stack ZS seguito da lunghezza d'onda per campioni vivi. Dopo aver impostato tutti i parametri, è possibile acquisire le immagini di fluorescenza. Le immagini di fluorescenza vengono quindi elaborate con Soft Works e successivamente analizzate con Velocity.

La sequenza di immagini mostrata qui illustra i cambiamenti fisici che avvengono nelle cellule cwr 22 durante i primi 80 minuti di induzione dell'autofagia. In queste immagini, la linea tratteggiata bianca rappresenta il contorno della cellula e la regione chiaramente ombreggiata indica la posizione del nucleo. Nel corso di 80 minuti, le immagini mostrano lo spostamento del nucleo rispetto al centro della cellula, la riduzione dei punti di adesione focale e la traslocazione generale di autosomi e lisosomi verso il centro della cellula, mostrati rispettivamente in verde e rosso nei punti temporali successivi.

È stato inoltre osservato un lieve aumento della codistribuzione tra autosomi e lisosomi, indicato dal colore giallo. Successivamente, la suite applicativa per l'elaborazione di immagini digitali Velocity è stata utilizzata per identificare, contare e raccogliere dati statistici sugli autosomi e sui lisosomi marcati nelle immagini delle cellule CWR 22. Qui mostrato, il numero e la dimensione degli autosomi dopo la loro formazione iniziale variano nel tempo.

Dopo 80 minuti di induzione dell'autofagia, si è osservata una graduale diminuzione del numero di autosomi con un corrispondente aumento della dimensione media degli autosomi. Inoltre, si è registrato un aumento misurabile della colocalizzazione tra autosomi e lisosomi, in base all'analisi del coefficiente di correlazione di Pearson. Nel complesso, questi risultati suggeriscono che, in seguito alla stimolazione dell'autofagia, numerosi autosomi di piccole dimensioni si fondono nel tempo per formare autosomi più grandi.

Qui viene mostrato un confronto affiancato di immagini acquisite e ricostruite in modalità DV, deconvoluzione simulata in campo chiaro rispetto alla modalità di illuminazione strutturata. Utilizzando il microscopio OMX, la risoluzione laterale è stata migliorata fino a 120 nanometri, il doppio della risoluzione della microscopia convenzionale limitata dalla diffrazione. La colocalizzazione su piccola scala tra autosomi e lisosomi era chiaramente evidente con la microscopia a super risoluzione, mentre era appena percettibile con l'imaging fluorescente convenzionale.

Uno dei vantaggi dell'utilizzo della microscopia di deconvoluzione è la ricostruzione di tutte le immagini in un modello 3D che rivelerà informazioni spaziali più accurate tra diverse molecole. Qui viene mostrata un'immagine complessiva di una cellula Cwr 22 RV1 in corso di autofagia in un tempo successivo, in cui inizia a verificarsi una significativa colocalizzazione tra autofagosomi e lisosomi. La colorazione coerente indicata in bianco rivela il contorno della cellula bersaglio in questo filmato.

Il modello ricostruito in 3D fornisce maggiori dettagli spaziali sulla fusione tra autosomi e lisosomi. Come indicato in colore giallo, l'interazione tra i segnali verdi della catena leggera tre e i segnali rossi dei lisosomi è evidente in presenza di segnali sovrapposti che producono il giallo. Pertanto, questo approccio affronterà due sfide principali per i ricercatori che studiano l'autofagia.

Prima di tutto, desideriamo mantenere un ambiente privo di stress utilizzando un fluido micro, la camera di perfusione, per mantenere la condizione fisiologica originale sulle piastre del microscopio. La seconda sfida consiste nel raccogliere dati d'immagine quantitativi statisticamente rilevanti; per le cellule fissate, di solito acquisiamo molte immagini da diverse cellule e le compiliamo in informazioni utili. Tuttavia, con le cellule vive, seguiamo semplicemente una singola cellula nel tempo per ottenere informazioni equivalenti.

Pertanto, riteniamo che questa tecnica permetterà ad altri ricercatori di studiare la funzione e il ruolo dell'autofagia in diversi organi e diverse malattie.