Valutazione della Sensorimotor funzione in modelli murini di malattia di Parkinson

L'obiettivo generale di queste procedure è quello di valutare quantitativamente la funzione del motore del sensore. Nei topi. A tal fine, utilizziamo una serie di test comportamentali sensibili.

Questi includono l'attività spontanea di attraversamento del fascio nel cilindro e il test di rimozione dell'adesivo, noto anche come test DOT. Dopo i test, è possibile valutare le registrazioni video dell'attraversamento del fascio e dell'attività spontanea. In definitiva, questi test possono essere utilizzati per caratterizzare la funzione sensoriale o motoria in nuovi modelli murini genetici, nonché in studi preclinici sui farmaci che studiano potenziali terapie per la malattia.

Quindi il vantaggio principale di questi test rispetto ad altri, in particolare quelli automatizzati, è che li troviamo altamente sensibili alla disfunzione motoria, più sensibili di test come l'asta del rotore. Inoltre, questi test sono in realtà molto convenienti, soprattutto rispetto a quelli automatizzati, che possono costare fino a migliaia di dollari. Questi test possono rispondere a domande chiave nel campo dei disturbi del movimento in generale e sono misure di esito molto utili.

Quando si testano potenziali terapie, il raggio viene impostato invertendo tre gabbie per topi pulite su un tavolo o in una gabbia per topi. Cambiando la cappa aspirante, allineare le gabbie in modo uniforme in modo che possano sostenere la lunghezza di una trave di un metro. Quindi, assembla le quattro sezioni della trave dalla sezione più larga a quella più stretta e posizionale sopra le gabbie del mouse invertite.

Posiziona la gabbia domestica dei topi che intendi testare su un lato all'estremità del raggio in modo che l'estremità più stretta del raggio conduca direttamente nella gabbia domestica. Per iniziare la prova assistita, prendi il primo topo per la base della coda e sostieni gli arti posteriori con il palmo della mano. Posiziona il mouse all'estremità larga della trave e lascia andare la coda e rimuovi la mano.

Lascia che il mouse annusi e si muova per orientarsi meglio verso l'apparato. Se il mouse gira delicatamente, reindirizzarlo nella direzione desiderata. Per incoraggiare il topo lungo il percorso, sollevare la gabbia di casa, mantenendola nella stessa posizione su un lato, e avvicinarla al topo di prova.

Quando il topo inizia a cercare di entrare nella gabbia di casa, spostalo indietro in modo che il topo non entri, ma faccia un passo avanti. Infine, consenti al topo di entrare nella gabbia di casa. Esegui la stessa procedura per ogni topo nella gabbia.

Pulisci accuratamente la trave tra le gabbie con una soluzione per la pulizia della stanza degli animali all'interno di una gabbia. È importante pulire l'urina o i pellet fecali dalla trave prima di eseguire il mouse successivo, poiché ciò distrarrà il topo successivo. Una volta che tutti i topi nella gabbia sono stati sottoposti a una prova assistita, raccogli di nuovo il primo topo e posizionalo all'estremità larga del raggio, se necessario.

Orienta delicatamente il mouse nella direzione desiderata e tocca leggermente il suo retro per incoraggiarlo a muoversi lungo la lunghezza del raggio verso la sua gabbia di casa, correggi il mouse se smette di annusare o si allontana dal raggio. Tieni la mano nelle vicinanze per guidare il mouse fino all'estremità del raggio. Riduci al minimo l'arresto e l'esplorazione mentre sei sul raggio.

Più questo viene fatto durante l'allenamento, meno il mouse tende a farlo. Durante i test, la prova termina quando il topo posiziona uno dei suoi quattro arti nella gabbia domestica, il topo successivo può quindi ricevere la sua seconda prova. I topi ricevono un totale di cinque prove il primo giorno di addestramento, alternandosi tra i topi, in modo che ogni topo abbia un intervallo tra le prove di 30 secondi o più.

Il secondo giorno, esegui altre cinque prove per ogni mouse utilizzando la stessa configurazione del raggio del primo giorno, i topi non dovrebbero aver bisogno di alcuna assistenza, ma potrebbe essere necessario correggerli o toccarli sul retro per evitare di fermarsi o esplorare. 24 ore dopo, inizia il giorno del test. Impostare la trave in modo simile ai due giorni di allenamento precedenti.

Tuttavia, posizionare una griglia mesh che corrisponda a ciascuna larghezza della trave sopra ogni sezione della trave. Usa una videocamera per registrare tutte le prove di attraversamento del raggio prima dell'inizio di ogni prova. Etichetta una scheda con le informazioni essenziali dell'esperimento, come la data, il numero del mouse e il numero di prova, e posizionala davanti alla fotocamera.

Registrare per due o tre secondi prima di ogni prova in modo che sia chiaro quale mouse viene testato e su quale versione di prova si trova. Per ogni test, posizionare il mouse sopra la superficie della griglia nella sezione più larga e registrare mentre si sposta lungo il record della trave in modo che sia visibile l'intera lunghezza del corpo del mouse. La telecamera deve essere posizionata in modo che la griglia si trovi al centro del visualizzatore.

Eseguire il test cinque volte su ogni mouse sulla trave della superficie della griglia, pulendola tra un mouse e l'altro. Per impostare l'esperimento di attività spontanea, disporre due gabbie una accanto all'altra a circa 18 centimetri di distanza in modo che la parte anteriore delle gabbie sia rivolta verso lo sperimentatore. Se necessario, posizionare una gabbia aggiuntiva dietro le altre due gabbie che funga da supporto per lo specchio.

Quindi, posiziona un pezzo di vetro sopra le due gabbie e posizionalo in modo che il vetro sia sostenuto dal bordo esterno delle prime due gabbie. Quindi posiziona un cilindro sopra il vetro e uno specchio ad angolo sotto il vetro. Appoggiato sul retro della terza gabbia.

L'angolo può variare da 30 a 45 gradi, ma soprattutto, la vista dalla telecamera deve includere l'intero diametro del cilindro. Una volta impostato l'esperimento, posiziona la videocamera davanti allo specchio e regola sia lo specchio che la videocamera fino a quando non riesci a visualizzare l'intero diametro del fondo del cilindro. Quindi imposta un timer per tre minuti ed etichetta una scheda con i dettagli importanti dell'esperimento come nel video dell'esperimento precedente.

Registra l'etichetta per due o tre secondi. Poi fermati. Per eseguire l'esperimento, posizionare un mouse nel cilindro.

Premere registra e avviare il timer. Registra il mouse per tre minuti. È importante che l'area di test sia silenziosa poiché rumori forti e conversazioni possono distrarre il mouse e potenzialmente causare un comportamento di blocco.

Durante l'esperimento, usa un contatore manuale per contare il numero di posteriori che il topo fa mentre è nel cilindro. Un movimento posteriore è definito come un movimento verticale con entrambi gli arti che cadono dal pavimento in modo che il topo sia in piedi solo sugli arti posteriori. Una volta scaduto il timer, rimuovi il mouse e rimettilo nella sua gabbia di casa.

Pulisci il cilindro e il vetro con una soluzione detergente per la stanza degli animali tra un mouse e l'altro. Lasciare asciugare la soluzione detergente prima di passare al mouse successivo. Inizia il test di rimozione dell'adesivo posizionando il mouse nella gabbia di casa.

Con il contenitore dell'alimentatore rimosso, consentire ai topi di abituarsi alla sala prove e alla gabbia senza l'alimentatore. Per un'ora per il test, utilizzare una gabbia pulita per posizionare i compagni di gabbia in modo che il topo di prova sia l'unico nella gabbia di casa. Rimuovi tre quarti della lettiera e mettila nella gabbia pulita con i compagni di gabbia nella gabbia di casa.

Posiziona il mouse di prova per trattenerlo usando un paio di piccole pinze, posiziona un'etichetta adesiva sulla slt del mouse. Premere delicatamente l'etichetta sul muso con la pinza e rilasciare il mouse. Posiziona il coperchio sulla gabbia e avvia un cronometro quando il mouse tenta di rimuovere le etichette con i suoi quattro pori.

Registra l'ora se il mouse entra in contatto, ma non rimuove l'etichetta. Registra l'ora, ma mantieni il timer acceso finché non lo fa. Rimuoverlo completamente.

Se il mouse non entra in contatto con l'adesivo o non lo rimuove entro 60 secondi, terminare la versione di prova e rimuovere manualmente l'adesivo. Dopo ogni prova, posiziona il mouse di prova nella gabbia di supporto e inizia a testare il mouse successivo. Tutti i topi ricevono tre prove alternate tra i topi.

Piuttosto che eseguire tutte e tre le prove su un topo contemporaneamente, le prove in cui l'etichetta cade o non è sicura sul muso non vengono conteggiate. L'impegnativa attività spontanea del fascio nel cilindro e i test di rimozione dell'adesivo sono tutti saggi molto utili della funzione motoria del sensore nei topi nel impegnativo test del fascio, i topi TH one alfa-sinucleina commettono significativamente più errori per passo rispetto ai topi wild type. Il numero di errori è aumentato nei topi alfa-sinucleina man mano che il fascio diventa più stretto.

Questo non era il caso dei topi wild type. Questa stessa linea di topi mostra anche una robusta diminuzione dei passi degli arti posteriori nel test del cilindro. Questi risultati mostrano che la sovraespressione dell'alfa umano nel nucleo nei topi mutati porta allo sviluppo di deficit motori dei sensori rilevabili.

Infine, nel test di rimozione dell'adesivo, PITX tre topi akia con una profonda diminuzione dei neuroni dopaminergici nigrostriatali mostrano un tempo di contatto significativamente aumentato rispetto ai controlli wild type. Noi e altri usiamo questi test di routine per valutare il potenziale terapeutico dei trattamenti per il morbo di Parkinson. Questi test possono essere utilizzati anche per caratterizzare modelli murini genetici e per determinare le conseguenze di specifiche mutazioni sulla funzione motoria sensoriale.