Preparazione delle cellule acinose pancreatiche per lo Scopo di Imaging di calcio, cellulari lesioni Misure e Infezione Adenoviral

L'obiettivo generale di questa procedura è isolare e infettare il primario as nelle nostre cellule allo scopo di misurare i livelli di calcio citosolico e il danno cellulare. Ciò si ottiene isolando prima il tessuto domestico del topo, del pancreas e tritando il tessuto nel tampone collagenasi. Nella seconda fase, il tessuto macinato viene brevemente incubato in tampone collagenasi a 37 gradi Celsius.

Successivamente, le celle vengono filtrate e quindi risospese. Nei media culturali. Nella fase finale, le cellule vengono piastrate per il danno cellulare, le misurazioni del calcio o l'infezione adenovirale.

In definitiva, perdita di LDH, subcellulare, fluorescenza di calcio e adenovirale. La fluorescenza può essere misurata per determinare la tossicità cellulare, le variazioni rispettivamente dei livelli di calcio e l'efficienza dell'infezione adenovirale. Il vantaggio principale di questa tecnica è che fornisce un metodo sensibile con cui misurare l'ASIN o la citotossicità cellulare e i segnali del calcio.

Inoltre, consente un'infezione affidabile delle nostre cellule pancreatiche con l'adenovirus. Le implicazioni di questa tecnica si estendono alla terapia della pancreatite acuta perché consente uno screening rapido e approfondito di potenziali percorsi biochimici che possono svolgere un ruolo critico nella patogenesi di questa malattia. La dimostrazione visiva di questo metodo è fondamentale poiché le procedure di preparazione cellulare e di misurazione del calcio richiedono una tecnica delicata e precisa, nonché una certa esperienza con la microscopia confocale prima di iniziare l'esperimento.

Per prima cosa, immergere i vetrini coprioggetti da 22 x 22 millimetri in due parti di acido nitrico e una parte di acido cloridrico. Dopo due ore, decantare gli scivoli con l'acqua ionizzata. Dopo l'eutanasia, orientare l'animale in posizione sotterranea e preparare la superficie addominale pulendo con etanolo al 70%.

Eseguire una laparotomia per esporre la cavità addominale, sezionare il pancreas e sciacquare immediatamente in una piccola barchetta di siero di latte contenente sei millilitri di tampone collagenasi e sezionare eventuali pezzi di grasso di grandi dimensioni o vasi sanguigni visibili. Quindi rimuovere cinque millilitri di tampone digestivo collagenasi e aggiungerlo al tubo conico da 15 millilitri. Dopo aver rimosso tutto tranne un millilitro di collagenasi, utilizzare le forbici da dissezione fine per tritare il pancreas fino a quando la soluzione risultante non appare uniformemente dispersa.

Quindi trasferire il prodotto nebulizzato in un pallone di plastica erlenmeyer da 125 millilitri. Agitare il pallone in un bagnomaria a 37 gradi Celsius a 90 RRP M per 30 minuti. Durante questo periodo, sciacquare i vetrini di copertura lavati con acido da 22 x 22 millimetri con acqua ionizzata.

Quindi asciugare i vetrini coprioggetto e posizionarli sopra una superficie piana rivestita da pellicola da laboratorio. Al termine del digestato di 30 minuti, trasferire nuovamente la sospensione nel tubo conico da 15 millilitri. Dopo aver lasciato che le cellule si depositassero con cura, convogliare il tampone di digestione della collagenasi e sostituirlo con sei millilitri di tampone di incubazione dell'albumina sierica bovina appena preparato.

Quindi agitare energicamente la provetta a mano per 10 secondi in modo da disperdere le cellule in grappoli più piccoli. Immediatamente dopo l'agitazione, rimuovere eventuali detriti galleggianti di grandi dimensioni dal mezzo non stabilizzato. Dopo aver lasciato riposare le cellule rimanenti, sostituire il terreno con un tampone di incubazione BSA fresco.

Quindi rimuovere il tampone di incubazione BSA e sostituirlo con un tampone di incubazione di cumuli appena preparato. Ora diluire il colorante di calcio a una concentrazione finale di 7,5 micromolari in tampone di incubazione privo di cumuli BSA appena preparato, quindi piattare 500 microlitri di questa sospensione su ciascuno dei vetrini coprioggetti da 22 x 22 millimetri. Per misurare la concentrazione di calcio nel pancreas, le cellule ASIN R iniziano utilizzando una pinzetta sottile.

Per afferrare con cautela un vetrino coprioggetto contenente la sospensione delle celle sul bordo, inclinare il vetrino coprioggetto con un angolo di 45 gradi, consentendo al tampone in eccesso di defluire. Quindi posizionare il vetrino coprioggetto sopra la guarnizione in gomma con le celle sopra il vetrino copricoperchio e assemblare la camera. Quindi, fissare la camera di perfusione al tavolino e inserire il tubo contenente il tampone nel primo ingresso della camera.

Accendere la siringa contenente il tampone e lasciare che il tampone persi su tutta la superficie del vetrino coprioggetto. Una volta che il tampone ha raggiunto l'estremità opposta della camera, inserire una linea del vuoto nell'ingresso del vuoto. Quindi, per visualizzare le cellule utilizzando un obiettivo ad apertura numerica 200 x o 400 x 1,4 e un laser argonne, eccitare l'influenza oh 4:00 AM die a una lunghezza d'onda di 488 nanometri.

Per preparare le cellule asar del pancreas per i saggi di danno cellulare, inizia trasferendo il pancreas in un piatto pulito. Dopo aver tritato e digerito il tessuto come appena dimostrato, rimuovere il pallone e lasciare che le cellule si depositino brevemente. Quindi sostituire il nat con cinque millilitri di tampone di collagenasi fresca.

Dopo aver agitato il tessuto per altri 35 minuti, utilizzare una pipetta di trasferimento per risospendere vigorosamente il digestato fino a quando la sospensione appare omogenea senza evidenti grumi cellulari. Quindi, pipettare la sospensione cellulare attraverso una rete di nylon pre-bagnata in un pallone conico. Quindi utilizzare altri tre millilitri di terreno D-M-E-M-F 12 fresco con collagenasi per pipettare energicamente la sospensione attraverso la rete per forzare il passaggio di eventuali cellule rimanenti.

Ora aggiungi altri sei-10 millilitri di terreno D-M-E-M-F 12 al pallone. Dopo la sospensione, le cellule in una piastra di terreno D-M-E-M-F 12 fresche, 500 microlitri di sospensione cellulare in ciascun pozzetto di una piastra di coltura tissutale a 48 pozzetti. Le cellule dovrebbero assomigliare alle cellule in queste immagini rappresentative.

Dopo aver lasciato agitare la piastra a bagnomaria per altri cinque minuti, stimolare le cellule con diversi agonisti. Dopo due-quattro ore, rimuovere con cura e congelare rapidamente un eloqua da 100 microlitri di cellule in azoto liquido. Per misurare prima la perdita di lattato deidrogenasi o LDH, costituiamo il substrato LDH fornito nel kit con 12 millilitri del tampone di saggio fornito.

Quindi riscaldare la sospensione cellulare congelata e i campioni di terreno in un bagno d'acqua a temperatura ambiente. Quando i campioni vengono scongelati, la piastra 50 microlitri di ciascun campione di terreno in una piastra a 96 pozzetti diluiscono la sospensione cellulare da 10 x tampone di lisi a una concentrazione finale di uno x. Quindi agitare brevemente la sospensione cellulare e incubare le cellule a 37 gradi Celsius per 60 minuti.

Piastra successiva, 50 microlitri di da una a 10 cellule lisate diluite in ciascun pozzetto di un 96. Piastra a pozzetti: aggiungere 50 microlitri di substrato ricostituito a ciascun pozzetto e incubare la piastra al buio a temperatura ambiente. Dopo mezz'ora, aggiungere 50 microlitri della soluzione di arresto fornita in ciascun pozzetto.

Per fermare la reazione, misurare l'assorbanza a 490 nanometri per infettare le cellule ASIN R del pancreas con l'adenovirus dopo aver filtrato il tessuto pancreatico digerito, ma prima del congelamento rapido, le cellule aggiungono 10 alle sette unità infettive di adenovirus alla sospensione cellulare e incubano la co-coltura per 30 minuti a 37 gradi Celsius. Quindi piastrate uniformemente due millilitri di sospensione cellulare in ciascun pozzetto di una piastra a sei pozzetti. Queste immagini mostrano come nelle nostre celle preparate per le misurazioni del calcio visualizzate con un ingrandimento di 630x.

Le cellule sono state visualizzate per la prima volta al microscopio in campo chiaro. Sono stati quindi caricati con il colorante di calcio influenza oh four e visualizzati utilizzando la microscopia a fluorescenza. Qui viene mostrato un esempio di misurazioni del calcio delle cellule asar in risposta a stimoli fisiologici.

Le cellule asar sono state caricate con il colorante di calcio influenza oh quattro e perfuse con l'analogo dell'acetilcolina carpooling. Le cellule hanno risposto sotto forma di un'onda di calcio che inizia nella regione apicale e si propaga alla regione basolaterale. I tracciati rappresentativi mostrati in questa figura dimostrano il tipico modello di plateau di picco comunemente osservato con un caracol micromolare.

Al contrario, utilizzando dosi submassimali dell'analogo della colecistochinina, Ian produce risposte oscillatorie del calcio. In questa figura, si possono osservare gli aumenti dipendenti dalla concentrazione della perdita di LDH in presenza di carbaholo ceruleo o dell'acido biliare Toro acido litocolico tre solfato o TLCS. Le concentrazioni necessarie per indurre la massima perdita di LDH sono coerenti con quelle necessarie per indurre l'attivazione della proteasi intra ASIN R e la segnalazione patologica del calcio, suggerendo che questi eventi possono portare a lesioni.

In questo esperimento, le cellule ASIN R sono state infettate con un reporter della luciferasi, l'adenovirus, che è guidato dal promotore di un fattore nucleare effettore della calcineurina a valle delle cellule T attivate o nfa. Questi dati rappresentativi convalidano il metodo di infezione, dimostrando aumenti di concentrazione e dipendenti dal tempo nell'attività della luciferasi del grasso N in presenza di TLCS Una volta padroneggiato. Questa tecnica può essere eseguita in quattro-sei ore a seconda delle condizioni testate durante il tentativo di questa procedura.

È importante essere meticolosi. Ciò è particolarmente vero durante la fase di preparazione cellulare per isolare le cellule aser primarie. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come isolare le cellule primarie come iner allo scopo di misurare i livelli di calcio citosolico e il danno cellulare.

Inoltre, dovresti essere in grado di infettare in modo affidabile queste cellule con l'adenovirus.