Microscopia a scansione laser confocale della dinamica del calcio in fette di tessuto pancreatico di topo acuto

In combinazione con l'imaging del calcio a cellule vive, la tecnica della fetta di tessuto pancreatico acuto consente lo studio delle onde intercellulari e della connettività funzionale multicellulare con un'alta risoluzione per lunghi periodi di tempo. I principali vantaggi di questa tecnica sono che è veloce, preserva l'architettura tissutale e riduce le limitate sollecitazioni enzimatiche e meccaniche mantenendo un'elevata resa di tessuto. Rilevando i cambiamenti funzionali e morfologici durante la progressione della malattia, questa tecnica aiuta la nostra comprensione delle malattie legate al pancreas, come il diabete.

Questa tecnica di fetta di tessuto può essere applicata ai tessuti cerebrali, ipofisari e surrenali con particolare attenzione alla conservazione del contatto intercellulare, delle interazioni paracrine e dell'architettura tissutale. Per prepararsi all'iniezione di agarosio nel pancreas del topo, riempire una siringa da cinque millilitri con agarosio liquido a 40 gradi Celsius e dotare la siringa di un ago da 30 gauge. Dopo aver accuratamente coperto l'ago con un cappuccio, posizionare l'estremità dell'ago della siringa verso il basso, con l'intero volume di agarosio sotto la superficie dell'acqua, a bagnomaria di 40 gradi Celsius.

Bolle una bottiglia di soluzione extracellulare con carbogeno, continuamente su ghiaccio, a 1,5 millilitri al minuto a pressione barometrica e temperatura ambiente per garantire ossigenazione e un pH di 7,4. Per eseguire l'iniezione di agarosio, posizionare un topo adulto eutanasizzato sotto uno stereomicroscopio e accedere all'addome del topo tramite laparotomia. Spostare delicatamente l'intestino sul lato sinistro per esporre il dotto biliare comune e utilizzare una pinza per sollevare leggermente l'estremità duodenale del dotto per individuare la papilla di Vater.

Utilizzare un emostato per bloccare il dotto biliare alla papilla duodenale per prevenire la fuoriuscita dell'agarosio dal dotto nel duodeno e utilizzare una piccola pinza affilata per raggiungere sotto il dotto biliare comune per rompere la membrana che attacca il dotto al tessuto pancreatico. Dopo aver eliminato il più possibile grasso e tessuto connettivo dal condotto, posizionare il dotto perpendicolarmente sulle punte di una coppia di pinze più grandi e premendo saldamente sullo stantuffo della siringa, iniettare l'agarosio liquido viscoso nell'estremità prossimale del dotto biliare comune per 20-30 secondi. Quando il tessuto diventa biancastro e leggermente disteso rimuovere la siringa e versare lentamente 20 millilitri della soluzione extracellulare ghiacciata a bolle sul pancreas per raffreddare il tessuto e indurire l'agarosio.

Per acquisire fette di tessuto pancreatico utilizzare pinze e forbici a taglio fine e duro per trasferire delicatamente il pancreas iniettato di agarosio in una capsula di Petri da 100 millimetri contenente 40 millilitri di soluzione extracellulare ghiacciata. Ruotare il piatto per risciacquare il tessuto e trasferire il pancreas in un secondo piatto di soluzione extracellulare ghiacciata. Utilizzare la pinza e le forbici per tagliare la sezione del pancreas biancastro e ben iniettata in un massimo di sei pezzi da 0,1 a 0,2 centimetri cubici e rimuovere qualsiasi tessuto connettivo e adiposo rimanente dai pezzi di tessuto.

Posizionare i blocchi puliti in una capsula di Petri inferiore non appiccicosa da 35 millimetri contenente circa cinque millilitri di agarosio liquido a 40 gradi Celsius e posizionare immediatamente la capsula di Petri sul ghiaccio. Quando l'agarosio si è indurito, tenere la capsula di Petri a testa in giù sopra il coperchio di una capsula di Petri da 100 millimetri e utilizzare metà di una lama di rasoio per tagliare con cura il margine tra la parete laterale della capsula di Petri e l'agarosio per rimuovere l'agarosio dal piatto. Usa la lama del rasoio per tagliare singoli cubi, ciascuno contenente un blocco di tessuto di agarosio, dall'agarosio liberato e usa la colla cianoacrilata per attaccare i blocchi alla piastra campione di un vibratoma.

Riempire la camera di taglio del vibratoma con 150 millilitri di soluzione extracellulare ghiacciata continuamente bollata con carbogeno. Avvitare la piastra campione sul vibratoma e montare una nuova lama di rasoio. Circondare la camera con ghiaccio e aggiungere due cubetti di ghiaccio da 10 millilitri di volume realizzati con soluzione extracellulare integrata con glucosio millimolare.

Impostare l'affettatrice su 0,05-1 millimetro al secondo e 70 hertz, quindi iniziare a affettare per acquisire fette di agarosio spesse 140 micron con una superficie di 20-100 millimetri quadrati. Utilizzare un pennello fine per trasferire con cura ogni fetta in una capsula di Petri da 100 millimetri riempita con 40 millimetri di tampone HEPES integrato con sei millimolari di glucosio. Per la preparazione del colorante di calcio, sciogliere 50 microgrammi di colorante indicatore di calcio permeabile alle cellule, 7,5 microlitri di DMSO e 2,5 microlitri del poloxamer e 6,667 millilitri di HBS in un tubo con tappo a vite da 15 millilitri.

Utilizzare una pipetta per miscelare accuratamente la soluzione per 20 secondi prima di immergere il tubo in una camera da bagno ad ultrasuoni e vorticare, ciascuno per 30 secondi. Quindi aliquota 3.333 millilitri della soluzione colorante indicatore di calcio risultante in una capsula di Petri da 5 millilitri per 10 fette di tessuto da etichettare. Per il caricamento del colorante, utilizzare un pennello sottile e morbido per trasferire fino a 10 fette di tessuto in ogni piatto di soluzione colorante e posizionare i piatti su uno shaker orbitale per 50 minuti a temperatura ambiente e 40 giri al minuto al riparo dalla luce.

Alla fine dell'incubazione, trasferire fino a 20 fette macchiate in singole piastre di Petri da 60 millilitri riempite con HBS senza coloranti. Per l'imaging del calcio mediante microscopia confocale selezionare un ingrandimento di 20 o 25 volte e impostare la modalità di acquisizione per l'imaging time-lapse, il foro stenopeico da 100 a 200 micron e l'eccitazione e l'emissione per il fluoroforo utilizzato nell'esperimento. Montare la camera di registrazione e il sistema di perfusione sullo stadio a temperatura controllata del microscopio e posizionare l'ingresso e l'uscita sui bordi più lontani della camera di registrazione.

Impostare le velocità di afflusso e deflusso su uno o due millilitri al minuto. Impostare la temperatura del sistema di profusione a 37 gradi Celsius e iniziare la profusione con la soluzione non stimolante. Per registrare la dinamica del calcio del tessuto, posizionare una singola fetta di tessuto nella camera di registrazione e immobilizzare il tessuto con un peso di platino a forma di U con una rete di nylon tesa.

Utilizzare l'opzione del campo luminoso per individuare la struttura di interesse e utilizzare l'imaging dal vivo per posizionare le strutture studiate nel campo visivo. Per ottimizzare il rapporto segnale-rumore, regolare la potenza del laser, l'amplificazione del rilevatore e la media della linea mantenendo la potenza del laser minima. Regolare il piano focale a 15 micron sotto la superficie di taglio per evitare la registrazione da celle potenzialmente danneggiate e acquisire le immagini.

Impostazione della frequenza di campionamento su uno o due hertz per consentire il rilevamento iniziale di singole oscillazioni e la registrazione di un'immagine ad alta risoluzione. Se disponibile, utilizzare un grafico online per ottenere un feedback immediato sulla risposta di preparazione, sull'illuminazione, sul fotosbiancamento e sulla deriva meccanica. Quando tutte le immagini sono state acquisite, salvare i dati per un'analisi successiva.

Qui si può osservare un esempio di una fetta di tessuto ottimale in cui il colorante indicatore di calcio permeabile alle cellule è stato caricato con successo nella fetta di tessuto pancreatico. Al contrario, queste fette di tessuto non sono ottimali per l'imaging a causa di una penetrazione del colorante non riuscita, della mancanza di cellule insulari o di un'abbondanza di tessuto necrotico sulla superficie dei campioni. Le immagini ad alta risoluzione di una fetta di tessuto pancreatico possono essere utilizzate per delineare regioni distinte del tessuto pancreatico, come le isole di Langerhans, il tessuto acinare o il dotto pancreatico.

Gli stimoli possono essere utilizzati per discriminare funzionalmente tra diverse cellule insulari o tra cellule insulari e non insulari. Ad esempio, le cellule beta in genere rispondono a una stimolazione del glucosio a impulsi quadrati esibendo un aumento transitorio del calcio intracellulare seguito da una rapida oscillazione del calcio su un plateau sostenuto. Al contrario, le cellule non beta rispondono con oscillazioni più veloci e irregolari.

È inoltre possibile misurare un ritardo nell'insorgenza dell'aumento del calcio intracellulare dopo la stimolazione, nonché l'eterogeneità e i ritardi tra le singole cellule. Gli stessi parametri possono essere utilizzati per descrivere la fase di disattivazione. Qui si può osservare una presentazione schematica della durata, della frequenza e della percentuale di tempo attivo dell'oscillazione intracellulare del calcio.

Quando si esegue l'imaging a velocità di acquisizione superiori a 10 hertz, le onde di calcio che si diffondono ripetutamente attraverso l'isolotto possono essere chiaramente riconosciute. Bloccare il dotto biliare comune il più vicino possibile al duodeno per evitare di occludere accidentalmente il ramo che sta entrando nel pancreas. Inoltre, non smettere di premere lo stantuffo durante l'iniezione perché l'agarosio si indurirà immediatamente nell'ago.

La tecnica della fetta di tessuto pancreatico acuto del topo può anche essere utilizzata con il metodo patch clamp per studiare le correnti dei canali ionici e accedere alla citosi, nonché studi immunoistochimici e studi di segreteria.