Isolamento primario delle cellule acinose: un metodo per isolare le cellule acinose dal pancreas di topo

- Una cellula acinare pancreatica è una cellula esocrina che contiene una varietà di enzimi digestivi. A volte, in risposta alla segnalazione oncogenica, la cellula acinare si converte in una cellula duttale. Questa cellula duttale può successivamente diventare cancerosa. Pertanto, è fondamentale isolare le cellule acinose per studiare il loro ruolo nella progressione del cancro al pancreas.

Inizia isolando il pancreas da un topo soppresso. Aggiungere il pancreas a una bilancia contenente una soluzione salina bilanciata integrata con un antibiotico. Tritare il pancreas in piccoli pezzi usando le forbici e aggiungere il tessuto pancreatico in un tubo. Quindi, aggiungere la soluzione di collagenasi ai pezzi di pancreas nel tubo.

La collagenasi digerisce il collagene che tiene insieme il tessuto in modo che il tessuto si rompa in pezzi sottili. Ora, aggiungi il terreno contenente siero al tubo e posiziona il fazzoletto sul ghiaccio. Questo aiuta a fermare l'azione della collagenasi.

Filtrare il tessuto e il terreno due volte, diminuendo progressivamente la dimensione delle maglie del filtro ogni volta per ottenere una sospensione di tessuto fine. Infine, centrifugare la sospensione risultante per raccogliere le cellule acinose nel pellet. Rimuovere il surnatante e conservare le cellule acinose per ulteriori analisi. Nel seguente protocollo, isoleremo le cellule acinose dal pancreas di un topo soppresso.

- Per sezionare il pancreas di un topo soppresso, prima appuntare le zampe del topo al coperchio di polistirolo, orientandolo in modo che la coda sia rivolta verso il ricercatore, e spruzzare l'addome con etanolo al 70%. Usa una pinza autoclavata per sollevare il pelo e la pelle sulla linea mediana e, con le forbici autoclavate, fai un'incisione attraverso il pelo e la pelle dall'apertura uretrale all'area della gabbia toracica del diaframma. Fai ulteriori incisioni a sinistra e a destra per tagliare via il pelo e la pelle, creando una visione chiara della cavità addominale.

Quindi, tagliare il rivestimento peritoneale al centro, a destra e a sinistra ed estrarlo dagli organi. Usa le pinze per sollevare gli intestini e spostarli sul lato sinistro del topo, creando spazio per vedere il pancreas rosa chiaro attaccato alla milza ovale rosso scuro. Il tessuto pancreatico avrà una consistenza morbida e spugnosa. Tagliate il pancreas, che corre lungo lo stomaco, intrecciandosi con l'intestino.

Separare la milza dal pancreas e posizionare il pancreas in una provetta da 50 millilitri contenente 10 millilitri di HBSS con 1X penicillina-streptomicina e trasferirla nella cappa a flusso laminare. Versare il contenuto del tubo in una bilancia vuota e utilizzare una pinza per lavare il pancreas facendolo roteare. Quindi utilizzare la pinza per spostare il pancreas su una seconda bilancia contenente HBSS con penicillina-streptomicina e lavare nuovamente roteando.

Sposta il pancreas sulla terza navicella contenente HBSS con penicillina-streptomicina e inizia a tagliare il pancreas in pezzi di 5 millimetri o più piccoli. Per versare il contenuto della navicella di pesa in un tubo nuovo da 50 millilitri, utilizzare prima la pinza per spostare i pezzi di pancreas nel liquido mentre la barca viene ribaltata. Una volta che i pezzi non sono più attaccati alla barca, versa il suo contenuto nel tubo. Raccogliere i pezzi rimanenti con la pinza e lavare la pinza nel tubo.

Dopo aver centrifugato la provetta a 931 volte la gravità a 4 gradi Celsius per due minuti, utilizzare una pipetta da 5 millilitri per rimuovere l'HBSS e l'eventuale grasso galleggiante. Aggiungere 5 millilitri di collagenasi diluita in HBSS. Chiudere la provetta e assicurarsi che il coperchio sia sigillato avvolgendo la provetta in una pellicola di plastica di paraffina. Mettilo in un'incubatrice, agitando a 220 giri/min a 37 gradi Celsius per 20 minuti, che produrrà una soluzione torbida e pochi pezzi di tessuto rimasti.

Per fermare la dissociazione, posizionare il tubo sul ghiaccio e aggiungere 5 millilitri di HBSS freddo con il 5% di FBS. Dopo aver centrifugato a 931 volte la gravità a 4 gradi Celsius per due minuti, rimuovere il surnatante utilizzando una pipetta da 5 millilitri. Risospendere il pellet in 10 millilitri di HBSS con il 5% di FBS e centrifugare nuovamente a 931 volte la gravità per due minuti a 4 gradi Celsius.

Rimuovere il surnatante utilizzando una pipetta da 5 millilitri e ripetere questo passaggio con altri 10 millilitri di HBSS con il 5% di FBS. Quindi risospendere il pellet in 5 millilitri di HBSS con il 5% di FBS. Utilizzare una pipetta P1000 per filtrare la sospensione cellulare di 1 millilitro alla volta attraverso una rete da 500 micrometri in una provetta da 50 millilitri.

Per lavare le cellule pancreatiche rimanenti attraverso la rete, aggiungere altri 5 millilitri di HBSS con il 5% di FBS. Quindi utilizzare una pipetta P1000 per far passare questo filtrato 1 millilitro alla volta attraverso la maglia da 105 micrometri in una provetta da 50 millilitri. Pipettare delicatamente questa sospensione cellulare in una provetta da 50 millilitri contenente HBSS con il 30% di FBS, che formerà uno strato di sospensione cellulare nella parte superiore.

Centrifugare questa sospensione cellulare a 233 volte la gravità a 4 gradi Celsius per due minuti e rimuovere il surnatante. Risospendere il pellet contenente le cellule acinose nel terreno completo di 1X Waymouth.