Un metodo semplice ed efficace per rilevare l'attivazione del Fattore Nucleare in neutrofili umani mediante citometria a flusso

Questo esperimento utilizza la citometria a flusso per rilevare e quantificare le proteine nucleari in nuclei isolati ed etichettati mediante immunomarcatura provenienti da neutrofili, al fine di purificare i neutrofili dal sangue periferico umano. Rimuovere i globuli rossi con destrina, seguita da centrifugazione su gradiente di densità del plasma. Successivamente, utilizzando anticorpi anti-recettori, stimolare i neutrofili purificati attraverso integrine o recettori Fc.

Procedere all'isolamento dei nuclei e fissare i campioni per l'immunomarcatura con anticorpi specifici contro il fattore nucleare NU di interesse. Ad esempio, NF kappa B, analizzando infine i nuclei mediante citometria a flusso al fine di rilevare piccole variazioni nell'attivazione del fattore nucleare. I risultati ottenuti mostrano che la stimolazione dei neutrofili attraverso i loro integrini porta a un aumento della concentrazione nucleare del fattore di trascrizione N di kappa B. I percorsi di segnalazione che portano all'attivazione del fattore nucleare sono solitamente studiati mediante saggi con geni reporter o mediante saggi di spostamento della mobilità elettroforetica in cellule primarie.

Spesso questi metodi non sono adatti. La citometria a flusso consente un rilevamento rapido e la quantificazione di proteine nucleari in nuclei isolati. Iniziare con 10 millilitri di sangue appena prelevato da volontari adulti sani.

Pipettare due millilitri di soluzione di destrina 6% T 500 in un tubo conico da centrifuga da 15 millilitri. Successivamente, aggiungere 10 millilitri di sangue mescolando capovolgendo il tubo due o tre volte e lasciare sedimentare gli eritrociti per gravità per 45 minuti in un nuovo tubo conico da centrifuga da 15 millilitri. Aggiungere cinque millilitri di fiala FI pack.

Prelevare il plasma ricco di leucociti formatosi sopra gli eritrociti sedimentati. Stratificarlo con attenzione sulla parte superiore del fial pack in modo da formare due fasi, centrifugare a 516 G per 20 minuti a quattro gradi Celsius. Rimuovere il soprannatante e rompere il pellet cellulare battendo il tubo contro il portatubi.

Quindi risospendere le cellule in 10 millilitri di PBS freddo. Trasferire la sospensione cellulare in un tubo conico da 50 millilitri per centrifuga e centrifugare a 290 G per cinque minuti a quattro gradi Celsius. Rompere il pellet cellulare come in precedenza e aggiungere 10 millilitri di soluzione ipotonica fredda per lisare gli eritrociti.

Mescolare ruotando delicatamente il tubo esattamente per un minuto. Successivamente, aggiungere 10 millilitri di soluzione ipertonica fredda e conservare sul ghiaccio. A questo punto, enumerare le cellule dopo aver pellettizzato i neutrofili mediante centrifugazione.

Sospendiamo i PMN a 10^7 cellule per millilitro. Mantenere le cellule sul ghiaccio in PBS freddo. Aliquotare 100 microlitri di sospensione di PMN in provette da 1,5 millilitro.

Quindi aggiungere l'anticorpo monoclonale corrispondente a 10 microgrammi per millilitro e incubare sul ghiaccio per 15 minuti. Per lavare le cellule, aggiungere un millilitro di PBS freddo, centrifugare ed aspirare il soprannatante. Quindi risospendere delicatamente il pellet cellulare e lavare due volte con PBS.

Per rimuovere l'anticorpo non legato, risospendere i neutrofili lavati nel medesimo volume iniziale di PBS caldo contenente 60 microgrammi per millilitro di IgG anti-topo, incubare a 37 gradi Celsius per uno-20 minuti in base al fattore nucleare di interesse. Aggiungere ora un millilitro di PBS freddo. Dopo la formazione del pellet cellulare mediante centrifugazione, rimuovere il soprannatante e congelare immediatamente i pellet cellulari in un bagno di ghiaccio secco ed etanolo. Per ogni campione, rimuovere la provetta dal bagno di ghiaccio secco ed etanolo, pulirla accuratamente e risospendere.

Sospendere i pellet di PMN congelati in 100 microlitri di soluzione ipotonica fredda. Mettere tutti i campioni sul ghiaccio per monitorare l'integrità dei nuclei. Colorare un'aloquota della sospensione nucleare con blu di trian.

Se la sospensione nucleare contiene molte cellule integre o detriti, è preferibile scartare il preparato e iniziare la procedura con un altro campione. Dopo aver centrifugato i nuclei per formare il pellet, rimuovere con attenzione il soprannatante, quindi fissare i nuclei in 100 microlitri di soluzione fredda di paraformaldeide al 4% e incubare i nuclei sul ghiaccio. Dopo aver centrifugato con attenzione i nuclei, rimuovere il soprannatante e aggiungere 100 microlitri di buffer di permeabilizzazione freddo, quindi incubare i campioni sul ghiaccio per 10 minuti.

Quindi raccogliere i nuclei permeabili mediante centrifugazione. A questo punto, i pellet nucleari non aderiscono bene al fondo del tubo. Si raccomanda di centrifugare nuovamente.

Se il pellet si allenta, per bloccare i siti di legame non specifici, sospendiamo i nuclei in 500 microlitri di siero fetale bovino al 4% freddo in PBS e incubiamo sul ghiaccio per 20 minuti. Centrifugare per raccogliere i nuclei in pellet, quindi risospendere i nuclei in 100 microlitri di PBS freddo contenente il 4% di FBS e 2,5 microgrammi per millilitro dell'anticorpo monoclonale contro il fattore nucleare di interesse. Incubare i campioni sul ghiaccio per 20 minuti; dopo aver lavato i campioni due volte con 500 microlitri di PBS freddo con il 4% di FBS, sospendiamo i nuclei in 100 microlitri di PBS freddo contenente il 4% di FBS e 10 microgrammi per millilitro dell'anticorpo secondario marcato con FZ corrispondente; incubare sul ghiaccio per 20 minuti. Dopo due lavaggi, risospendere i nuclei in 400 microlitri di paraformaldeide fredda al 4% in PBS.

Analizzare i nuclei immunoetichettati mediante citometria a flusso, utilizzando un apparecchio come un Fact Scan o uno strumento simile. Regolare le impostazioni di acquisizione con FSC in scala logaritmica a 10 alla meno uno, SSC in scala logaritmica a 196 e selezionare i nuclei in un grafico dot plot. Acquisire 10.000 nuclei per campione.

Quindi analizzare la fluorescenza delle nuclei marcate con il colorante fitsy attraverso il canale FL1 impostato su scala logaritmica a 400. Questo metodo di purificazione dei PMN fornisce in genere neutrofili non stimolati con una purezza superiore al 95%; i nuclei dei PMN vengono isolati con rese elevate e, una volta isolati, possono essere facilmente riconosciuti come una popolazione distinta rispetto ai PMN integri nel citometro a flusso mediante un dot plot dopo stimolazione. Cross-linkando le integrine beta1, NF-kappaB viene traslocato nel nucleo e questo incremento di NF-kappaB nucleare viene rilevato come aumento della fluorescenza.

In modo analogo, la stimolazione dei PMN mediante legame incrociato degli integrini beta due induce anche l'attivazione di NF-kappa B, come indicato da un aumento della fluorescenza. La sensibilità di questo metodo permette di rilevare piccoli cambiamenti nei livelli del fattore nucleare, come dimostrato dal fatto che gli integrini beta uno, che si legano a proteine della matrice extracellulare come la fibronectina, inducono un'attivazione di NF-kappa B più intensa rispetto agli integrini beta due, che si legano a molecole di adesione su altre cellule. Questo metodo offre grande flessibilità poiché possono essere utilizzati molti fluorocromi diversi e consente la preparazione di nuclei da diversi tipi cellulari; è stato quindi adottato questo approccio semplice ed economico per studi di trasduzione del segnale che coinvolgono variazioni nei livelli proteici nel nucleo di una varietà di tipi cellulari.