Un metodo semplice ed efficace per rilevare l'attivazione del Fattore Nucleare in neutrofili umani mediante citometria a flusso
April 9th, 2013
I neutrofili sono i leucociti più abbondanti nel sangue. Neutrofili possiedono funzioni trascrizionalmente regolate, quali la produzione di citochine pro-infiammatorie e l'inibizione di apoptosi. Queste funzioni possono essere studiati con il metodo presentato qui, che consente il rilevamento e la quantificazione dei fattori nucleari mediante citometria a flusso in nuclei isolati
Questo esperimento utilizza la citometria a flusso per rilevare e quantificare le proteine nucleari in nuclei isolati e immunomarcati da neutrofili per purificare i neutrofili dal sangue periferico umano. Rimuovere i globuli rossi con destrina seguita da centrifugazione in gradiente di densità del plasma. Quindi, utilizzando anticorpi anti recettore, stimolare i neutrofili purificati tramite integrine o recettori FC.
Procedere all'isolamento dei nuclei e fissare i campioni per l'immunomarcatura con anticorpi specifici contro il fattore nucleare NU di interesse. Ad esempio, NF kappa B analizza infine i nuclei mediante citometria a flusso al fine di rilevare piccoli cambiamenti nell'attivazione del fattore nucleare. Si ottengono risultati che mostrano che la stimolazione dei neutrofili attraverso le loro integrine porta ad un aumento della concentrazione nucleare del fattore di trascrizione N dei kappa B. Le vie di segnalazione che portano all'attivazione del fattore nucleare sono solitamente studiate mediante saggi del gene reporter o mediante saggi di spostamento della mobilità elettroforetica nelle cellule primarie.
Spesso questi metodi non sono adatti. La citometria a flusso offre una rapida rilevazione e quantificazione delle proteine nucleari in nuclei isolati. Inizia con 10 millilitri di sangue appena raccolto da volontari adulti sani.
Pipettare due millilitri di soluzione di destrina T 500 al 6% in una provetta da centrifuga conica da 15 millilitri. Quindi aggiungere 10 millilitri di sangue mescolato capovolgendo la provetta due o tre volte e lasciare 45 minuti per la sedimentazione degli eritrociti per gravità in una provetta da centrifuga conica fresca da 15 millilitri. Mettere cinque millilitri di FI fial pack.
Raccogli il plasma ricco di leucociti che si è formato sopra gli eritrociti sedimentati. Sovrapporlo accuratamente alla confezione di fial in modo da formare due fasi, centrifugare a 516 Gs per 20 minuti a quattro gradi Celsius. Rimuovere il surnatante e rompere il pellet della cella battendo la provetta contro la cremagliera.
Quindi risospendere le cellule in 10 millilitri di PBS freddo. Trasferire la sospensione cellulare in una provetta da centrifuga conica da 50 millilitri e centrifugare a 290 Gs per cinque minuti a quattro gradi Celsius. Rompere il pellet cellulare come prima e aggiungere 10 millilitri di soluzione ipotonica fredda agli eritrociti della liscivia.
Mescolare facendo roteare delicatamente il tubo per un minuto esatto. Quindi, aggiungere 10 millilitri di soluzione ipertonica fredda e conservare in ghiaccio. Ora enumerate le cellule dopo aver pellettato i neutrofili mediante centrifugazione.
Sospendiamo il PMN a 10 a sette cellule per millilitro. Nella PBS fredda mantenere le cellule in ghiaccio. Aliquotare 100 microlitri di sospensione PMN in tubi einor da 1,5 millilitri.
Quindi aggiungere il corrispondente anticorpo monoclonale a 10 microgrammi per millilitro e incubare su ghiaccio per 15 minuti. Per lavare le cellule, aggiungere un millilitro di centrifuga PBS fredda e aspirare il surnatante. Quindi rompere delicatamente il pellet della cella e lavare altre due volte con PBS.
Per rimuovere l'anticorpo non legato, risospendere il PMN lavato nello stesso volume iniziale di PBS caldo contenente 60 microgrammi per millilitro di IgG anti muse go incubato a 37 gradi Celsius da uno a 20 minuti a seconda del fattore nucleare di interesse. Ora aggiungere un millilitro di PBS freddo Dopo aver pellettato le celle mediante centrifugazione, rimuovere la fetta e congelare immediatamente i pellet di cellule in un bagno di etanolo con ghiaccio secco. Per ogni campione, rimuovere la provetta dal set di ghiaccio secco, pulire il bagno di etanolo, pulire e risus.
Sospendere i pellet PMN congelati in 100 microlitri di soluzione ipotonica fredda. Posizionare tutti i campioni sul ghiaccio per monitorare l'integrità dei nuclei. Colorazione un Eloqua della sospensione dei nuclei con trian blu.
Se la sospensione dei nuclei contiene molte cellule intatte o detriti, è meglio scartare la preparazione e iniziare la procedura con un altro campione. Dopo aver pellettato i nuclei mediante centrifugazione, rimuovere il surnatante con molta attenzione, quindi fissare i nuclei a 100 microlitri di soluzione fredda di aldeide paraforma al 4% e incubare i nuclei su ghiaccio. Dopo aver pellettato i nuclei, rimuovere con cura la trappola a 100 microlitri di tampone di permeazione fredda e incubare i campioni su ghiaccio per 10 minuti.
Quindi raccogliere i nuclei permeabili mediante centrifugazione. A questo punto, i nuclei non si attaccano bene sul fondo del tubo. Si consiglia di centrare nuovamente il futuro.
Se il pellet si allenta Per bloccare i siti di legame aspecifici, sospendiamo i nuclei in 500 microlitri di siero bovino fetale freddo al 4% in PBS e incubiamo su ghiaccio per 20 minuti. Pellettare i nuclei mediante centrifugazione, quindi risospendere i nuclei e 100 microlitri di PBS freddo contenente il 4% di FBS e 2,5 microgrammi per millilitro di anticorpo monoclonale contro il fattore nucleare di interesse. Incubare i campioni su ghiaccio per 20 minuti dopo aver lavato i campioni due volte con 500 microlitri di PBS freddo con il 4% di FBS, sospendere i nuclei in 100 microlitri di PBS freddo contenente il 4% di FBS e 10 microgrammi millilitro del corrispondente anticorpo secondario marcato con FZ, incubare su ghiaccio per 20 minuti dopo due lavaggi, risospendere i nuclei in 400 microlitri di paraldeide fredda al 4% in PBS.
Analizza i nuclei immunomarcati in un citometro a flusso, come un fact scan o un apparecchio simile. Regolare le impostazioni di acquisizione: due FSC su scala logaritmica a 10 su uno negativo, SSC su scala logaritmica a 196 e i nuclei di gate in plot di adozione. Acquisire 10.000 nuclei per campione.
Quindi analizzare la fluorescenza dei nuclei di colorazione incerti attraverso il canale FL one impostato su scala logaritmica a 400. Questo metodo di purificazione PMN di solito fornisce neutrofili non stimolati con una purezza superiore al 95% dai nuclei PMN isolati con rese elevate, isolati nei nuclei, possono essere facilmente riconosciuti come una popolazione diversa dal PMN intatto nel citometro a flusso con un dot plot dopo la stimolazione. Reticolando le integrine beta uno, NF kappa B viene tradotta nel nucleo e questo incremento di NF kappa B nucleare viene rilevato come un aumento della fluorescenza.
Allo stesso modo, la stimolazione del PMN mediante la reticolazione delle integrine beta due induce anche l'attivazione di NF kappa B, come indicato da un aumento della fluorescenza. La sensibilità di questo metodo consente di rilevare piccoli cambiamenti nei livelli di fattori nucleari, come evidenziato dal fatto che le integrine beta uno, che legano le proteine della matrice extracellulare come la fibronectina, inducono un'attivazione più forte di NF kappa B rispetto alle integrine beta due, che si legano alle molecole di adesione su altre cellule. Questo metodo presenta una grande flessibilità perché possono essere utilizzati molti fluorocromi diversi e poiché consente la preparazione di nuclei di diversi tipi di cellule, ha utilizzato questo approccio semplice ed economico per studi di trasduzione del segnale che comportano cambiamenti dei livelli proteici nel nucleo di una varietà di tipi di cellule.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Panoramica
Questo studio presenta un metodo per rilevare e quantificare le proteine nucleari nei neutrofili utilizzando la citometria a flusso. L'approccio permette ai ricercatori di analizzare l'attivazione dei fattori di trascrizione, come NF kappa B, nei nuclei isolati.
Componenti principali dello studio
Area di Scienza
- Immunologia
- Biologia Cellulare
- Citometria a Flusso
Sfondo
- I neutrofili sono il tipo più abbondante di leucociti nel sangue.
- Giocano un ruolo cruciale nella risposta immunitaria attraverso la produzione di citochine proinfiammatorie.
- Comprendere le loro funzioni nucleari è essenziale per ottenere informazioni sulla regolazione immunitaria.
- La citometria a flusso è uno strumento potente per analizzare i componenti cellulari.
Obiettivo dello studio
- Purificare i neutrofili dal sangue periferico umano.
- Studiare l'attivazione dei fattori nucleari in risposta alla stimolazione.
- Fornire una metodologia dettagliata per quantificare i livelli delle proteine nucleari.
Metodi utilizzati
- Isolamento dei neutrofili dal sangue umano utilizzando dextrina e centrifugazione su gradiente di densità.
- Stimolazione dei neutrofili con anticorpi anti-recettore che prendono di mira le integrine o i recettori FC.
- Isolamento e fissazione dei nuclei per l'etichettatura immunologgica con anticorpi specifici.
- Analisi dei nuclei mediante citometria a flusso per rilevare cambiamenti nell'attivazione dei fattori nucleari.
Risultati principali
- La stimolazione dei neutrofili tramite integrine porta ad un aumento della concentrazione nucleare di NF kappa B.
- La citometria a flusso rileva efficacemente piccoli cambiamenti nell'attivazione dei fattori nucleari.
- I risultati contribuiscono alla comprensione delle vie di segnalazione nei neutrofili.
- La metodologia può essere applicata per studiare vari fattori nucleari in cellule primarie.
Conclusioni
- Questo metodo fornisce un approccio affidabile per studiare l'attivazione dei fattori nucleari nei neutrofili.
- La citometria a flusso è una tecnica preziosa per analizzare le funzioni delle cellule immunitarie.
- Ulteriori ricerche possono esplorare ulteriori vie di segnalazione e le loro implicazioni.
Domande Frequenti
Executive Industry Relevance
Detecting nuclear factor activation in primary human neutrophils enables mechanistic de-risking of inflammatory signaling pathways in drug discovery. This flow cytometry-based method provides quantitative, reproducible readouts of transcription factor dynamics, supporting target validation and assay development in immunology-focused programs. By overcoming transfection limitations in short-lived primary cells, it offers a scalable solution for early-stage biomarker alignment and predictive confidence in lead identification.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of NF-κB and Elk-1 activation in primary human neutrophils to clarify proinflammatory signaling mechanisms.
- Operational Value: Provides a transfection-independent method for studying transcriptionally regulated responses in difficult-to-transduce primary immune cells.
- Predictive Value: Supports functional target validation by linking receptor stimulation (e.g., integrins, Fc receptors) to nuclear translocation of key inflammatory mediators.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Generates isolated, immunolabeled neutrophil nuclei suitable for high-throughput flow cytometric screening of modulators of nuclear factor activation.
- Quantitative Output: Enables detection of small changes in nuclear protein concentration, facilitating dose-response and IC50 determination in compound screening.
- Reproducibility: Standardized neutrophil isolation and nuclear preparation workflows yield consistent fluorescence readouts across replicates and donors.
Translational & Preclinical Research
- Disease Relevance: Directly applicable to studying neutrophil-driven inflammatory pathways in models of infection, autoimmunity, and tissue injury.
- Translational Continuity: Bridges discovery-phase mechanism elucidation with preclinical validation by providing a primary human cell-based readout of target engagement.
- Mechanistic De-risking: Reduces reliance on surrogate systems by enabling direct measurement of transcription factor activation in the therapeutically relevant cell type.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the early discovery continuum, supporting hypothesis testing in immunology and enabling progression from target engagement assays to functional validation in primary human neutrophils before lead optimization.
- Discovery Biology: Facilitates pathway clarification by quantifying nuclear translocation of transcription factors downstream of receptor stimulation (e.g., β1/β2 integrins, Fc receptors).
- Screening: Delivers assay-ready nuclei with quantitative fluorescence outputs suitable for screening compound libraries for modulators of NF-κB or Elk-1 activation.
- Analytics: Provides single-nucleus resolution and fluorescence intensity measurements enabling statistical comparison of stimulated vs. basal conditions.
- Translational Research: Uses primary human neutrophils to enhance clinical relevance of mechanistic findings, supporting biomarker alignment in inflammatory disease models.
- Enterprise Reuse: Adaptable to multiple nuclear factors and fluorophores, allowing reuse across projects targeting different signaling pathways in neutrophils or other primary cell types.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation by providing direct, quantitative evidence of nuclear factor activation in primary human immune cells.
- Operational Value: Delivers a standardized, scalable workflow for neutrophil isolation, nuclear preparation, and flow cytometric analysis with minimal specialized equipment.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by reducing mechanistic ambiguity in early-stage immunomodulator programs.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of compounds based on target pathway modulation in a disease-relevant primary cell system.
Implementation Considerations
- Requires expertise in primary human blood processing, neutrophil isolation, and flow cytometry compensation and gating.
- Dependent on access to flow cytometers capable of fluorescence detection in the appropriate channels (e.g., FL1 for FITC-labeled antibodies).
- Necessitates standardization of stimulation conditions, antibody titers, and nuclear fixation/permeabilization protocols across users and sites.
- Adaptation to other cell types requires optimization of hypotonic/hypertonic lysis conditions and validation of nuclear integrity.
- Practical limitations include neutrophil donor variability and the short ex vivo lifespan of primary neutrophils, necessitating same-day experimentation.
