Citometria a flusso basato su test per il monitoraggio delle funzioni delle cellule NK

L'obiettivo generale di questa procedura è monitorare le funzioni delle cellule NK utilizzando un test basato sulla citometria a flusso. Le cellule natural killer sono fondamentali per l'esito di varie infezioni virali e malattie maligne. Per monitorare meglio le funzioni delle cellule NK, il nostro laboratorio ha ulteriormente sviluppato un test basato sulla citometria a flusso che può essere utilizzato sia nella ricerca scientifica che nelle valutazioni cliniche.

Abbiamo ottimizzato il protocollo per consentire l'analisi di campioni di piccole dimensioni di cellule NK, che è essenziale per il suo utilizzo in pediatria e per i pazienti immunodeficienti. Un ulteriore vantaggio di questa tecnica è la possibilità di misurare le funzioni delle cellule NK non solo all'interno dell'intera popolazione di cellule NK, ma anche in diversi sottogruppi di cellule NK. Per isolare le cellule NK, iniziare mescolando il volume appropriato di soluzione cocktail per l'isolamento delle cellule NK con 6-10 millilitri di sangue intero periferico EDTA da un paziente mediante diverse inversioni.

Successivamente, omogeneizzare ulteriormente il campione su un rotatore di provette per cinque minuti a temperatura ambiente. Quindi posizionare la provetta in un separatore magnetico per 15 minuti in condizioni sterili, facendo attenzione che l'etichetta della provetta sia rivolta verso la parte posteriore del magnete per facilitare la visibilità della linea di separazione. Al termine della separazione, trasferire con cura il surnatante in una nuova provetta da 15 millilitri e portare il volume finale fino a 15 millilitri con terreno completo.

Lavare le celle per centrifugazione e risospendere il pellet in un millilitro di terreno fresco completo. Quindi contare le cellule e regolare il volume a una concentrazione di almeno due volte 10 al quarto di cellule NK per 100 microlitri in terreno completo. Per stimolare le cellule NK isolate, prima mescolare delicatamente pipettando almeno cinque volte e aliquotare 100 microlitri di cellule nei pozzetti appropriati di una piastra con fondo a V a 96 pozzetti.

Spegnere la luce e aggiungere l'anticorpo anti-CD107a a ciascun pozzetto delle cellule NK. Quindi mescolare accuratamente un'aliquota di cellule tumorali K562 a due volte 10 al quarto di cellule per 100 microlitri di volume pipettando almeno cinque volte e trasferire 100 microlitri di cellule tumorali in ciascun pozzetto pianificato per la stimolazione. Il pipettaggio preciso e la preparazione di un rapporto tra gli effettori uno a uno sono di fondamentale importanza per la valutazione accurata della funzione delle cellule NK.

Quindi, aggiungere IL-2 e IL-15 ai pozzetti di stimolazione e mescolare tutti i pozzetti pipettandoli almeno cinque volte. Incubare la piastra al riparo dalla luce per tre ore a 37 gradi Celsius e 5% di anidride carbonica. Dopo la prima ora con la luce spenta, aggiungere la soluzione di inibitore del trasporto proteico appena preparata in ciascun pozzetto mescolando accuratamente e rimettere la piastra nell'incubatore.

Al termine dell'incubazione, mescolare accuratamente le co-colture e trasferirle nelle provette per citometria a flusso corrispondenti. Aggiungere un millilitro di tampone di lavaggio a ciascuna provetta per la centrifugazione e risospendere i pellet in 99 microlitri di PBS più un microlitro di marcatore di cellule morte fissabile per campione. Mescolare le cellule mediante vortex, seguito da un'incubazione di 15 minuti a temperatura ambiente al buio.

Al termine dell'incubazione, lavare le cellule in un millilitro di tampone di lavaggio e risospendere i pellet in 84 microlitri di tampone di lavaggio più 16 microlitri dell'appropriato cocktail di anticorpi sulla superficie cellulare. Mescolare i campioni mediante vortice e incubare per 20 minuti al buio a quattro gradi Celsius. Quindi lavare le cellule in un millilitro di tampone di lavaggio e risospendere i pellet in 100 microlitri di una soluzione di fissazione fredda.

Mescolare a vortice, seguito da 10 minuti a quattro gradi Celsius al buio. Lavare ora le celle in un millilitro di tampone di lavaggio e risospendere i pellet in 90 microlitri di tampone di permeabilizzazione. Colorare con 10 microlitri degli anticorpi intracellulari appropriati e mescolare mediante vortexing.

Dopo 30 minuti al buio a quattro gradi Celsius, lavare le cellule due volte in un millilitro di tampone di permeabilizzazione fresco. Quindi risospendere i campioni in 400 microlitri di tampone di permeabilizzazione fresco. Mescolare bene a vortice e porre le cellule sul ghiaccio fino alla loro analisi mediante citometria a flusso.

Il prima possibile, trasferire tutte le provette nel citometro a flusso e avviare l'acquisizione dei dati. Qui vengono illustrate le strategie di gating per analizzare la degranulazione e la produzione di citochine e chemochine dell'intera popolazione di cellule NK, nonché di tre diversi sottogruppi di cellule NK. Le cellule NK non stimolate provenienti da donatori sani non hanno prodotto né interferone gamma né MIP-1 beta e non esprimono CD107a sulla loro superficie.

Al contrario, le cellule NK stimolate con cellule tumorali e citochine hanno prodotto quantità significative di interferone gamma intracellulare e MIP-1 beta con oltre il 20% delle cellule che hanno dimostrato degranulazione dopo l'interazione con le cellule tumorali, come indicato dalla loro espressione sulla superficie cellulare CD107a. Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere completata in otto ore. Durante il tentativo di questa procedura, è importante essere precisi nella placcatura delle cellule NK e delle cellule tumorali K562.

Per mantenere il rapporto del bersaglio dell'effettore selezionato, il conteggio dovrebbe essere il più accurato possibile. Questa procedura flessibile può essere facilmente modificata. Ad esempio, le cellule NK all'interno della popolazione PBMC possono essere analizzate o possono essere utilizzati diversi anticorpi per verificare la presenza di altri marcatori di interesse.

Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come purificare, stimolare e marcare le cellule NK per monitorare la loro funzione utilizzando un test basato sulla citometria a flusso. Non dimenticare che lavorare con cellule umane e bersaglio è potenzialmente pericoloso e che durante l'esecuzione di questa procedura è necessario adottare sempre precauzioni di sicurezza come indossare i dispositivi di protezione individuale appropriati.