Tridimensionale confocale Analisi dei marcatori microglia / macrofagi di polarizzazione in Experimental Brain Injury

L'obiettivo generale del seguente esperimento è quello di visualizzare l'espressione e la localizzazione cellulare dei marcatori fenotipici dei macrofagi della microglia dopo l'ischemia cerebrale. In primo luogo, le sezioni criogeniche del cervello ischemico di topo vengono colorate per identificare i marcatori dell'attivazione dei macrofagi della microglia. Le sezioni colorate sono sottoposte a imaging confocale tridimensionale.

Le immagini risultanti vengono quindi elaborate per generare rendering tridimensionali e viene eseguita l'analisi delle immagini per localizzare l'espressione dei marcatori in gruppi di cellule. I dati risultanti dimostrano l'efficacia dell'analisi confocale tridimensionale nell'assegnare correttamente l'espressione del marcatore a uno specifico corpo cellulare Quando due marcatori sono espressi dalla stessa cellula, ma in diversi compartimenti subcellulari, la sola colocalizzazione potrebbe non essere molto informativa. L'utilizzo dell'analisi tridimensionale, come dimostreremo qui, consente una migliore risoluzione e precisione.

Sebbene questo metodo possa fornire informazioni sulla complessità della risposta cerebrale al danno ischemico, può anche essere applicato ad altre condizioni acute o croniche in cui è stato proposto un duplice ruolo per i macrofagi della microglia nel danno e nella riparazione. Oppure, nei casi in cui i segnali devono essere localizzati selettivamente in diversi piani speciali, Carlo Perigo e Stefan di Magali vi guideranno attraverso le diverse fasi della procedura. Il seguente protocollo utilizza tessuto cerebrale di topo in cui l'ischemia è stata indotta dall'occlusione permanente dell'arteria cerebrale media.

Usa un criostato per raccogliere sezioni coronali seriali di 20 micron del cervello su gelatina. I vetrini coperti portano tutti i reagenti e i campioni a temperatura ambiente prima dell'uso. Si prega di notare che la diluizione operativa degli anticorpi e del siero elencati nel documento di accompagnamento è il risultato di studi effettuati al fine di ottenere le migliori prestazioni quando vengono utilizzati anticorpi e siero diversi.

Il protocollo deve essere convalidato. Inizia circondando le sezioni sul vetrino usando una penna bloccante per liquidi per ridurre al minimo la quantità di reagenti necessari. Quindi, posizionare le sezioni cerebrali in una camera umida utilizzando una pipetta da un millilitro.

Aggiungere PBS a temperatura ambiente alle sezioni e incubare per cinque minuti per lavarle. Quindi, utilizzando una siringa monouso da un millilitro con ago, rimuovere la soluzione e ripetere il lavaggio ancora una volta Dopo aver rimosso il secondo lavaggio, procedere alla colorazione dei campioni utilizzando una pipetta da un millilitro e una siringa monouso per tutti gli scambi di soluzione. La procedura di colorazione deve essere eseguita come riassunto. Qui.

Si prega di consultare il testo di accompagnamento per i dettagli, comprese le fasi di lavaggio. In primo luogo, le cellule vengono incubate con perossido di idrogeno all'1% dopo il blocco con il normale siero di capra. Successivamente, i vetrini vengono incubati con un anticorpo secondario appropriato seguito da triss, tampone di interpolazione NACL o TNT, quindi triss, H-C-L-N-A-C-L, tampone bloccante o TNB dopo l'incubazione con TNB.

I vetrini vengono incubati con streptavidina HRP seguita da un diluente di amplificazione contenente cianuro cinque tyrom, che amplificherà il segnale immunofluorescente. Successivamente, i vetrini vengono incubati con NGS per bloccare i siti di legame non specifici. Quindi vengono incubati con un anticorpo primario contro il CD 68.

Dopo l'incubazione con l'anticorpo primario, le cellule vengono quindi incubate nell'anticorpo secondario coniugato Fluor appropriato, seguito da un microgrammo per millilitro di uncini per marcare il DNA. Una volta completata la colorazione, montare le sezioni criogeniche utilizzando oro prolungato durante il montaggio delle sezioni, evitando di generare bolle d'aria. Conservare le sezioni a quattro gradi Celsius al buio fino a quando non vengono analizzate.

L'acquisizione del segnale fluorescente deve essere eseguita entro una settimana. Questo protocollo utilizza un microscopio IX 81 dotato di un'unità di scansione confocale FV 500 con tre linee laser: argon kripton a 488 nanometri, elio rosso neon a 646 nanometri ed elio verde neon a 532 nanometri più un diodo UV nell'influenza del software U 500. Selezionare i laser di eccitazione e gli specchi dicroici appropriati.

Imposta anche la risoluzione dell'immagine su un minimo di 800 x 600 pixel. Successivamente, posizionare il vetrino sul tavolino del microscopio e, utilizzando l'epifluorescenza, identificare un'area di interesse, aumentare progressivamente l'ingrandimento fino all'obiettivo 40x. Quindi passa alla modalità di microscopia a scansione laser ed esegui scansioni ripetitive regolando il livello di potenza del fotomoltiplicatore e il guadagno per ciascun canale.

Ciò ridurrà la sovrapposizione del segnale causata dall'eccitazione contemporanea a diverse lunghezze d'onda. Mantieni il guadagno il più basso possibile per evitare segnali non specifici indesiderati. Continuando la scansione ripetitiva, regolare la messa a fuoco e definire gli estremi inferiore e superiore dell'asse Z con una lunghezza totale dell'asse Z di 10 micron.

Quindi interrompi la scansione ripetitiva. Quindi, inserisci la dimensione del passo. Dovrebbe essere il più vicino possibile alla dimensione dei pixel, che è di 0,225 micron.

Questo darà un rapporto di dimensioni standard di uno a uno sull'asse Z nel software Attiva il filtro kalman almeno due volte. L'algoritmo di Kalman è una funzione iterativa che elimina il segnale casuale, come i singoli voxel positivi appartenenti al rumore di fondo, migliorando così il rapporto segnale/rumore. Ora attiva la modalità di scansione sequenziale per evitare effetti di sanguinamento.

Spostarsi al punto medio dell'asse Z ed eseguire una scansione sequenziale XY. Controllare la configurazione del PMT e del guadagno per garantire un rapporto segnale/rumore soddisfacente. Eseguire l'acquisizione XY, Z dopo l'acquisizione.

Esporta i dati come file TIF multiplo. Ogni file TIF multiplo contiene in genere tre canali di colore e 44 piani focali per l'elaborazione. Inizia aprendo il software imas.

Innanzitutto, seleziona la vista di superamento, quindi carica il file TIF multiplo. Successivamente, sul pannello di regolazione del display, selezionare il colore desiderato per ciascun canale qui. Il rosso rappresenta il CD 11 B.Il verde rappresenta il CD 68 e il blu rappresenta la macchia del DNA dei ganci per rimuovere il rumore dallo sfondo, aumentare il valore minimo sul pannello di regolazione del display per ciascun canale.

Quindi passare alla vista di sezione per visualizzare un singolo piano focale XY con proiezioni ortogonali degli assi x, Z e YZ. Spostarsi lungo l'asse Z alla ricerca della colocalizzazione, che viene visualizzata sotto forma di pixel gialli. Fare clic su un'area gialla per vedere se la colocalizzazione è presente lungo l'asse Z, il che indica che appartiene all'asse Z di un oggetto solido.

Le sporgenze sono visibili nella parte destra e inferiore della figura. Scatta un'istantanea, quindi torna alla vista di sorpasso. Successivamente, nel menu a discesa di modifica, seleziona ritaglia 3D e delinea una regione di interesse per isolare una cella o un gruppo di cellule.

Quindi, sul pannello di regolazione del display, selezionare un canale. Selezionare il generatore di algoritmi di superamento delle superfici. Quindi, per impostare l'algoritmo, seleziona prima un canale.

Quindi definire la soglia come lo stesso valore minimo impostato nel pannello di regolazione del display e definire il ridimensionamento se necessario. Quindi, definire l'arrotondamento come 0,200. Selezionate il pannello dei colori e modificate l'aspetto in base alle esigenze.

Ripetere la configurazione per il generatore di algoritmi di superamento delle superfici per ciascun canale. Quindi, nel pannello di regolazione del display, deselezionare i canali di fluorescenza e selezionare tutte e tre le superfici. Infine, sposta il volume per trovare la vista migliore e scatta un'istantanea per determinare il modello di co-espressione dei marcatori MM.

I protocolli per l'immunofluorescenza e l'acquisizione confocale descritti in questo video sono stati eseguiti in un modello murino di ischemia focale indotta da occlusione permanente dell'arteria cerebrale media. Una vista bidimensionale delle immagini acquisite mostra che a 24 ore dall'ischemia, il marcatore lisosomiale CD 68, mostrato in verde, è espresso nelle cellule ipertrofiche tra CD 11 B positive, che sono viste in rosso presenti nel nucleo ischemico. La proiezione dell'asse Z mostrata in basso a destra dimostra che la distribuzione dei marcatori documentata nella vista a piano singolo è presente anche lungo l'asse Z nella zona del bordo.

Le cellule B positive di CD 11 mostrano corpi cellulari ipertrofici con processi altamente positivi per CD 68, suggerendo che i fagosomi sono legati alla membrana cellulare. Ciò indica il comportamento acido PHA attivo delle cellule microgliali per valutare la co-espressione di CD 68 e YM uno, un marcatore di M due polarizzato. Mm.Le immagini fluorescenti sono state sottoposte a rendering tridimensionale.

La vista tridimensionale delle immagini acquisite mostrate qui indica la presenza di cellule positive CD 68 mostrate in verde e di cellule YM 1 positive mostrate in voxel fluorescenti rossi. Posando parallelamente, la vista dell'osservatore può produrre un segnale colocalizzato visto come giallo, che potrebbe non essere correlato alla distanza effettiva tra i marcatori. Per definire la colocalizzazione.

Dovrebbe essere generata una singola vista piana con proiezioni dell'asse Z che si spostano lungo l'asse Z. Alla ricerca di colocalizzazione. La proiezione dell'asse Z si ottiene come si vede nella parte destra e inferiore di questa immagine.

I voxel fluorescenti possono essere trasformati in oggetti solidi mediante rendering tridimensionale con assegnazione dell'espressione del marcatore a uno specifico corpo cellulare. Dopo un elevato ingrandimento e un rendering 3D, i due marcatori sembrano appartenere a celle diverse che si trovano nelle immediate vicinanze. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come eseguire un test di immunofluorescenza con più marcatori e coloranti e di come acquisire e visualizzare correttamente le immagini tridimensionali mediante microscopia confocale.

Inoltre, l'analisi di post-processing descritta può essere sfruttata proficuamente per analizzare qualsiasi co-espressione o colocalizzazione a livello cellulare, o in quei casi in cui i segnali devono essere localizzati selettivamente in diversi piani spaziali.