Name: Istituzione di un In vitro Sistema per studiare intracellulare Comportamento Candida glabrata In umani THP-1 macrofagi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-12-10T20:15:00.000+00:00
Duration: 13 min 47 s
Description: Scopri come stabilire un modello in vitro per studiare il comportamento intracellulare di Candida glabrata nei macrofagi THP-1 umani. Questo protocollo riproducibile valuta la virulenza fungina e le risposte immunitarie.

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Questo lavoro è stato sostenuto da Innovative Giovane Biotechnologist Award BT/BI/12/040/2005 e BT/PR13289/BRB/10/745/2009 concessione dal Dipartimento di Biotecnologie, Governo dell&#39;India e dei fondi fondamentali del Centro per l&#39;impronta digitale del DNA e diagnostica, Hyderabad. MNR e GB sono i destinatari di Junior e Senior Research Fellowships del Consiglio di ricerca scientifica e industriale verso il perseguimento di un dottorato di ricerca dell&#39;Università Manipal. SB è il destinatario di Junior e Senior Research Fellowship del Dipartimento di Biotecnologie verso il perseguimento di un dottorato di ricerca dell&#39;Università Manipal.

Si consiglia di eseguire C. glabrata esperimenti di infezione in un laboratorio con livello di biosicurezza di contenimento 2 (BSL-2). <ol><li> Preparazione di THP-1 macrofago monostrato. </li><li> Preparazione di C. sospensione cellulare glabrata. </li><li> Infezione di cellule THP-1 macrofagi con C. cellule glabrata. </li><li> Misurazione della frequenza fagocitosi e replicazione intracellulare tramite unità formanti colonie saggio. </li><li> Monitoraggio della replica intracellulare mediante microscopio confocale a scansione laser. </li></ol> 1. Preparazione di THP-1 macrofagi Monolayer <ol><li> THP-1 è una linea cellulare monocitica umana derivata dal sangue periferico di un 1 anni figlio maschio affetto da leucemia monocitica 14. THP-1, una linea cellulare di sospensione, viene normalmente mantenuta a 37 ° C in umidificata al 5% di CO 2 nel terreno di coltura RPMI-1640 supplementato con 10% FBS (siero fetale bovino). Il trattamento con phorbol 12-myristaTE 13-acetato (PMA, un estere del forbolo) provoca differenziazione terminale di cellule THP-1 monociti in macrofagi. È importante sottolineare che il trattamento PMA non pregiudica la vitalità cellulare e le cellule differenziate non si dividono. </li><li> Seme circa 1,5 x 10 6 THP-1 monociti in 100 piatti mm cultura in RPMI-1640 completa (medio RPMI-1640 integrato con il 10% di siero, glutammina 2 mM e 1x antibiotici, 10 ml / piatto) e lasciare le cellule crescono a 37 ° C in 5% CO 2 per 2 giorni. </li><li> Una volta THP-1 le cellule hanno raggiunto una densità di 8 x 10 5 cellule / ml, trasferire il piatto cultura alla cappa di coltura cellulare a flusso laminare e agitare delicatamente per risospendere le cellule insediate. </li><li> Pipettare la sospensione cellulare, posizionate in una provetta sterile 15 ml e centrifugare a 1000 rpm (130 xg) per 4 min. Gettare il surnatante e sospendere THP-1 pellet di cellule in 5 ml fresco, preriscaldata, medie completo RPMI-1640. </li><li> Enumerare le celle con un emocitometro e diluire il celsospensione l per una densità finale di 10 6 cellule / ml con mezzo completo RPMI preriscaldata-1640 </li><li> Aggiungere 1 ml di 160 mM PMA magazzino (phorbol soluzione di 13-acetato 12-myristate preparato in dimetilsolfossido) a 10 ml THP-1 sospensione cellulare (concentrazione finale 16 nM) e mescolare bene. Pipettare 1 ml di sospensione cellulare in ciascun pozzetto di una piastra di coltura tissutale a 24 pozzetti ed incubare piastra in incubatore mantenuto a 37 ° C con 5% di CO 2 per 12 ore. </li><li> Rimuovere il vecchio mezzo, aggiungere 1 ml preriscaldata RPMI-1640 completa e consentono alle cellule di recuperare per 12 ore a 37 ° C in 5% di CO 2. </li><li> Osservare le cellule sotto un microscopio invertito per garantire che forma ovale cellule THP-1 monocitiche in sospensione sono stati differenziati in appiattite, macrofagi mandrino a forma e aderenti. Queste cellule differenziate sono ora pronti a condurre C. Gli studi di infezione glabrata. </li></ol> 2. Preparazione di C. glabrata &amp; #Sospensione cellulare; 160 C. glabrata ceppo selvatico Bg2 verrà utilizzato per infettare THP-1 macrofagi. C. cellule glabrata sono ordinariamente coltivate in YPD liquido (estratto di lievito (1%)-Peptone (2%)-destrosio (2%)) medio. Mezzo YPD solido viene preparata aggiungendo 2% agar prima media autoclave. <ol><li> Per preparare una coltura di C. glabrata, scegliere una singola colonia su dalla piastra di agar con una sterile, monouso ciclo e inoculare in 10 ml di mezzo YPD liquido e incubare per 14-16 ore con agitazione (200 rpm) a 30 ° C. </li><li> Centrifugare questa cultura (1 ml) a 4.000 giri (1.800 xg) per 5 minuti in una microcentrifuga da tavolo superiore, lavare le cellule tre volte con PBS sterile (PBS, pH 7,4) e sospendere pellet di cellule in 1 ml di PBS. </li><li> Misurare OD 600 di C. sospensione cellulare glabrata e diluire con un volume adeguato di PBS sterile per ottenere una densità di 2 x 10 6 cellule / ml (OD 600= 0.1). In alternativa, la densità cellulare desiderata può essere ottenuta contando le cellule di lievito con un emocitometro. </li></ol> 3. Infezione di cellule THP-1 Macrofagi con C. Celle glabrata <ol><li> Aggiungere 50 microlitri C. sospensione cellulare glabrata di THP-1 macrofagi (10 6 cellule seminate in ogni pozzetto di una piastra di coltura a 24 pozzetti) per ottenere un MOI (molteplicità di infezione) di 0,1 e Incubare la piastra a 37 ° C con 5% di CO 2. </li><li> Per determinare i conteggi vitali di lievito, diluire 50 ml C. glabrata cell sospensione 100 volte in PBS sterile e piatto 100 microlitri su terreno solido YPD. Incubare le piastre a 30 ° C e contare manualmente il numero di colonie di lievito che compaiono dopo 1-2 giorni. Questi numeri, d&#39;ora in poi, essere indicate come 0 hr C. glabrata CFU (unità formanti colonie). </li><li> Dopo 2 ore coculturing di cellule THP-1 con C. cellule glabrata, terreno di coltura di rigetto invertendo 24-pozzetti di coltura tissutale ina serbatoio e lavare delicatamente tre volte con PBS sterile preriscaldata per rimuovere nonphagocytosed extracellulare C. cellule glabrata. Lavaggi delicati con PBS sono assolutamente essenziali per realizzare la completa rimozione di tutti lievito extracellulare senza causare alcun danno al THP-1 macrofagi monostrato. </li></ol> 4. Misurazione della fagocitosi Rate e intracellulare replica tramite Colony Forming saggio Unità <ol><li> Lyse C. glabrata infettato THP-1 macrofagi in 1 ml sterile H 2 O per 2 min, raschiare delicatamente per rimuovere i detriti macrofago dal pozzo e raccogliere lisato cellulare in una provetta da microcentrifuga. Verifica microscopica di completa lisi dei macrofagi è fondamentale per il recupero di tutti lievito interiorizzato. </li><li> Preparare una diluizione 100 volte di lisato in PBS sterile, piatto 100 microlitri su terreno solido YPD e incubare le piastre a 30 ° C. </li><li> Dopo 1-2 giorni, contare manualmente il numero di C. glabrata colonie che appeared su terreno YPD, si moltiplicano con fattore di diluizione (2 ore CFU) e calcolare tasso di fagocitosi che si riferisce alla percentuale di C. cellule glabrata che vengono ingerite da THP-1 macrofagi dopo 2 ore coincubation utilizzando la seguente formula. % Fagocitosi = [(CFU a 2 h) / (CFU a 0 h)] X 100 </li><li> Per misurare la velocità di replicazione intracellulare di C. cellule glabrata in THP-1 macrofagi, raccolgono lievito intracellulare in tempi diversi punti dall&#39;infezione esempio. 4, 6, 8, 10, 12 e 24 ore, ripetendo i passaggi 3,3-4,3. </li><li> Calcola piega sopravvivenza / replica di C. cellule glabrata in THP-1 macrofagi dividendo CFU totali in qualsiasi punto del tempo con quelli di 2 ore (lievito fagocitati). </li></ol> 5. Monitoraggio della replica intracellulare Uso confocale Laser Microscopia a Scansione <ol><li> Seguendo i passi descritti nella Sezione 1, sementi PMA-trattati 5 x 10 5 cellule THP-1 in ciascun pozzetto di due diapositive da camera a quattro pozzetti e incubare a 37 ° C con 5% di CO 2 per 12 ore. </li><li> Sostituire il vecchio mezzo con preriscaldata RPMI-1640 completa e consentono alle cellule di recuperare dal trattamento PMA per 12 ore. </li><li> Preparare GFP (green fluorescent protein)-tagged C. sospensione cellulare glabrata come descritto nella Sezione 2 e infettare di THP-1 macrofagi ad una MOI di 1. Se C. glabrata ceppi che esprimono GFP non sono disponibili, le cellule di lievito marcate con FITC (fluoresceina isotiocianato) possono essere utilizzati per monitorare eventi precoci dall&#39;infezione vale a dire. tasso di fagocitosi e fagolisosomale maturazione a 2 ore. </li><li> Incubare i vetrini per 2 ore a 37 ° C con 5% di CO 2, capovolgere con attenzione a scartare medie e lavare 3x con sterile, preriscaldata PBS. </li><li> Aggiungere 500 ml preriscaldata RPMI-1640 medi completoum a ciascuna camera di uno scivolo e incubare a 37 ° C con 5% di CO 2 per 22 hr. </li><li> Per risolvere 2 hr C. glabrata-infettati THP-1 macrofagi, aggiungere 500 ml di 3,7% di formaldeide (preparato in PBS) per ciascuna camera dell&#39;altro vetrino ed incubare a temperatura ambiente per 20 minuti al buio. </li><li> Lavare il vetrino tre volte con PBS, aggiungere 500 microlitri Triton-X (0,7%), e incubare a temperatura ambiente per 5 min in scuro. </li><li> 3x diapositive Lavare con PBS, rimuovere camera dalla cultura vetrino e asciugare all&#39;aria per 3-5 minuti al buio. </li><li> Montare con cura un vetrino con mezzo Vectashield di montaggio contenente DAPI (4 &#39;,6-diamidino-2-phenylindole) sulla trasparenza evitando la formazione di bolle. Rimuovere delicatamente il liquido in eccesso con Kimwipe e sigillare i bordi coprioggetto con smalto per unghie. Conservare scivolo al buio a 4 ° C fino al momento dell&#39;uso. </li><li> Ripetere i punti 5.4 e 5,6-5,9 per elaborare cellule THP-1 24 ore dopo l&#39;infezione. </li><li> Celle di immagine utilizzando un confo scansione lasermicroscopio cal (60X obiettivo ad immersione in olio, eccitazione a 405 nm e 488 nm per DAPI e macchia GFP, rispettivamente). </li></ol>

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<li>Castaño, I., Kaur, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tn7-based+genome-wide+random+insertional+mutagenesis+of+Candida+glabrata%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Res%22%5BJournal%5D)">Tn7-based genome-wide random insertional mutagenesis of Candida glabrata.</a> Genome Res. 13 (5), 905-915 (2003).</li>
</ol>

Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari in competizione.

Sistema immune innato svolge un ruolo importante nel controllo delle infezioni fungine opportunistiche. I macrofagi contribuiscono alla difesa antimicotici per ingestione e la distruzione del patogeno fungino. Così, delucidazione di fattori che sono necessari per la sopravvivenza e / o contrastare le funzioni antimicrobiche di macrofagi avanzerà la nostra comprensione delle strategie di virulenza fungine. In questo contesto, abbiamo stabilito un sistema cellulare modello vitro in coltura utilizzando macrofagi d...

Specie di Candida sono la principale causa di infezioni fungine invasive potenzialmente letali nei pazienti immunocompromessi 1. Candida glabrata, un patogeno nosocomiale emergente, è il secondo o il terzo più frequentemente isolati specie di Candida da pazienti nell&#39;unità di terapia intensiva a seconda della posizione geografica 1-3. Filogeneticamente, C. glabrata, un lievito in erba aploidi, è più strettamente legato alle Saccharomyces non lievito modello patogeno cerevisiae che a patogeni Candida spp. tra cui C. albicans 4. Coerentemente con questo, C. glabrata manca di alcune caratteristiche di virulenza fungine chiave, tra cui l&#39;accoppiamento, attività proteolitica secreto e la plasticità morfologica 4-5. Sebbene C. glabrata non forma ife, può sopravvivere e riprodursi nei macrofagi murini ed umani 6-8 suggerendo che essa ha sviluppato meccanismi di patogenesi unici. Sono disponibili informazioni limitate circa le strategie che C. glabrata impiega per sopravvivere nell&#39;ambiente intracellulare dei macrofagi poveri di nutrienti e contrastare ossidativo e risposte dell&#39;ospite nonoxidative montati da ospite cellule immunitarie 5. Un pertinente modello di sistema dei macrofagi è un prerequisito per delineare l&#39;interazione di C. glabrata con fagociti host tramite approcci di genomica e proteomica funzionale. Cellule mononucleate del sangue periferico (PBMC) e macrofagi derivate dal midollo osseo (BMDMs) di origine umana e murina, rispettivamente, sono prima stati utilizzati per studiare l&#39;interazione di C. glabrata con ospite cellule immunitarie 7,9. Tuttavia, la difficoltà nell&#39;ottenere PBMC e BMDMs, la loro durata di vita limitata e la variazione intrinseca tra i diversi donatori mammiferi limitano l&#39;utilizzo di queste cellule sistemi modello come versatili. Qui, descriviamo un metodo per la creazione di un sistema in vitro per studiare la intracellulcomportamento ar di C. cellule glabrata in macrofagi derivati ​​dalla linea cellulare monocitica umana THP-1. L&#39;obiettivo generale di questo protocollo è quello di stabilire un modello di sistema di coltura cellulare semplice, poco costoso, veloce e riproducibile che può essere facilmente manipolato per studiare diversi aspetti di interazione ospite-patogeno fungino. Cellule THP-1 sono stati precedentemente utilizzati per decifrare la risposta immunitaria contro una vasta gamma di agenti patogeni quali batteri, virus e funghi 10-12. Monocitaria THP-1 le cellule sono di facile manutenzione e possono essere differenziati, previo trattamento esteri phorbol, ai macrofagi che imitano i macrofagi derivate da monociti di risorse umane ed esprimono adeguatamente i marcatori macrofagi 13. I principali vantaggi di THP-1 sistema modello macrofagi sono la facilità d&#39;uso e la mancanza di sofisticate apparecchiature requisito. Il protocollo qui presentato è facilmente adattabile a studiare l&#39;interazione di altri patogeni fungini umani con host cellule immunitarie. L&#39;attuale procedura può anche essere impiegato per identificare i fattori di virulenza per l&#39;agente patogeno di interesse utilizzando schermi mutanti alto rendimento. Questa prova di concetto è stato esemplificato dal successo nell&#39;uso di THP-1 sistema modello di coltura per identificare un insieme di 56 geni che sono necessari per la sopravvivenza di C. glabrata in macrofagi umani 8.

<table><tbody><tr><td>THP-1</td><td>Collezione di colture di tipo americano</td><td>TIB 202</td><td>Linea cellulare di leucemia monocitica acuta umana</td></tr><tr><td>RPMI-1640</td><td>Hyclone</td><td>SH30096.01</td><td>Per il mantenimento delle cellule THP-1</td></tr><tr><td>Phorbol 12-miristato 13-acetato</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P 8139</td><td>Attenzione: YPD pericoloso</td></tr><tr><td>&nbsp;</td><td>BD-Difco</td><td>242710</td><td>Per la crescita di cellule Candida glabrata</td></tr><tr><td>Formaldeide</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F8775</td><td>Per la fissazione di macrofagi THP-1 infetti da C. glabrata</td></tr> Soluzione <tr><td>salina tamponata con fosfato (PBS)</td><td></td><td></td><td>Tampone (137 mM NaCl, 10 mM Fosfato, 2,7 mM KCl,&nbsp; pH 7,4) per lavaggi</td></tr><tr><td>Citrato salino-sodio (SSC)&nbsp;</td><td></td><td></td><td>Tampone (3 M NaCl, 0,3 M di citrato di sodio per una concentrazione 20x) per lavaggi</td></tr><tr><td>Tampone</td><td></td><td></td> di preibridazione <td>Tampone (50% formammide, 5x Denhardt' soluzione s, 5x SSC, 1% SDS) per ibridazione</td></tr><tr><td>Terreno di montaggio VECTASHIELD</td><td>Vector Labs</td><td>H-1200</td><td>Per il montaggio di vetrini per microscopia confocale</td></tr><tr><td>32P marcato &alpha;-dCTP</td><td>JONAKI-BARC</td><td>LCP-102</td><td>Per la radiomarcatura di etichette di firma</td></tr><tr><td>Piastre per colture tissutali da 100 mm</td><td>Corning</td><td>430167</td><td>Per la coltura di cellule THP-1</td></tr><tr><td>Piastra per colture tissutali a 24 pozzetti</td><td>Corning</td><td>3527</td><td>Per eseguire studi di infezione da C. glabrata in macrofagi THP-1</td></tr><tr><td>vetrino trattato con coltura tissutale a 4 camere</td><td>BD Falcon</td><td>REF354104</td><td>Per l'imaging C. glabrata-infected THP-1 macrofagi</td></tr><tr><td>Emocitometro</td><td>Rohem India</td><td></td><td>Per l'enumerazione delle cellule</td></tr><tr><td>Microcentrifuga da tavolo</td><td>Beckman Coulter</td><td>Microfuge 18</td><td>Per la centrifuga di cellule in microprovette</td></tr><tr><td>Centrifuga da tavolo</td><td>Remi</td><td>R-8C</td><td>Per la centrifuga di cellule in provette da 15 ml</td></tr><tr><td>Spettrofotometro</td><td>Amersham Biosciences</td><td>Ultraspec 10</td><td>Per monitorare l'assorbanza delle cellule di lievito</td></tr><tr><td>Incubatore a piastre</td><td>Labtech</td><td>Refrigerato</td><td>Per la crescita di cellule C. glabrata</td></tr><tr><td>Incubatore shaker</td><td>New Brunswick</td><td>Innova 43</td><td>Per coltivare cellule C. glabrata</td></tr><tr><td>Incubatore CO2&nbsp; Thermo</td><td>Electron Corporation</td><td>Forma serie 2</td><td>Per coltivare cellule THP-1</td></tr><tr><td>Microscopio confocale</td><td>Carl Ziess</td><td>Ziess LSM 510 meta</td><td>Per osservare C. glabrata-infettato THP-1 macrofagi</td></tr><tr><td>Microscopio composto</td><td>Olympus</td><td>CKX 41</td><td>Per osservare C. glabrata e THP-1 macrofagi</td></tr><tr><td>Macchina PCR</td><td>BioRad</td><td>DNA Motore</td><td>Per amplificare tag unici da input e output genomico DNA</td></tr><tr><td>Forno di ibridazione</td><td>Labnet</td><td>Problot 12S</td><td>Per l'ibridazione&nbsp;</td></tr><tr><td>PhosphorImager</td><td>Fujifilm</td><td>FLA-9000</td><td>Per la scansione di membrane ibridate</td></tr><tr><td>Thermomixer</td><td>Eppendorf</td><td>Thermomixer Comfort</td><td>Per la denaturazione di etichette di firma radiomarcate</td></tr><tr><td>Unità di documentazione su gel</td><td>Alphainnontech</td><td>Alphaimager</td><td>Per visualizzare il DNA colorato con bromuro di etidio in gel di agarosio</td></tr></tbody></table>

istituzione di un<em&gt; in vitro</em&gt; sistema per studiare intracellulare comportamento<em&gt; candida glabrata</em&gt; in umani thp-1 macrofagi

Establishment of an In vitro System to Study Intracellular Behavior of Candida glabrata in Human THP-1 Macrophages

Un sistema cellulare modello di coltura, se un vicino mimo di condizioni ambientali ospitanti, può servire come un&#39;alternativa economica, riproducibile e facilmente manipolabile per sistemi modello animale per lo studio di una fase specifica di infezione microbica patogeno. Una linea cellulare monocitica umana THP-1 che, al momento phorbol trattamento estere, è differenziato in macrofagi, è già stata utilizzata per studiare le strategie di virulenza di molti patogeni intracellulari, tra cui Mycobacterium tuberculosis. Qui, discutiamo un protocollo di emanare una cellula in vitro modello di cultura sistema che utilizza THP-1 macrofagi per delineare l&#39;interazione di un opportunista lievito Candida glabrata agente patogeno umano con fagociti host. Questo sistema modello è semplice, veloce, suscettibili di schermi mutanti high-throughput, e non richiede attrezzature sofisticate. Un tipico esperimento THP-1 infezione dei macrofagi richiede circa 24 ore con un ulteriore 24-48 ore per permettere intracellulare recuperatolievito di crescere su terreno ricco di formanti colonia analisi fattibilità basato su unità. Come altri sistemi modello in vitro, un possibile limite di questo approccio è la difficoltà di estrapolare i risultati ottenuti da una circuiteria cellule immunitarie altamente complesso esistente nell&#39;ospite umano. Tuttavia, nonostante questo, l&#39;attuale protocollo è molto utile per chiarire le strategie che un patogeno fungino può utilizzare per eludere / contrastare risposta antimicrobica e sopravvivere, adattarsi e proliferare in un ambiente povero di nutrienti delle cellule immunitarie dell&#39;ospite.

Infezione analisi di PMA trattati THP-1 macrofagi con C. tipo selvatico glabrata (wt), le cellule hanno rivelato che le cellule wt stati fagocitati dai macrofagi ad un tasso del 55-65% dopo 2 ore coincubation. Inoltre, C. glabrata cellule erano in grado di resistere uccisione da parte THP-1 macrofagi ed hanno subito un moderato 5 - a 7 volte maggiore CFU dopo 24 ore di coculturing con THP-1 macrofagi 8. Replica intracellulare di cellule di tipo selvatico, trasformate con GF...

L&#39;attuale articolo descrive un protocollo per stabilire un sistema cellulare modello di coltura in vitro per studiare l&#39;interazione di una facoltativo intracellulare patogeno fungino umano Candida glabrata con i macrofagi umani che saranno un utile strumento per far progredire la nostra conoscenza dei meccanismi di virulenza fungine.

Istituzione di un<em&gt; In vitro</em&gt; Sistema per studiare intracellulare Comportamento<em&gt; Candida glabrata</em&gt; In umani THP-1 macrofagi

A cell culture model system, if a close mimic of host environmental conditions, can serve as an inexpensive, reproducible and easily manipulatable ...

L'obiettivo generale di questa procedura è stabilire un sistema modello di coltura in vitro per studiare il comportamento intracellulare di un patogeno fungino opportunistico umano. Candida albicans nei macrofagi derivati da una linea cellulare monocitica umana, THP-1. Per ottenere questo risultato, i monociti THP-1 vengono inizialmente trattati con forbole estere per differenziarli in macrofagi.Successivamente, i macrofagi derivati da THP-1 vengono infettati con cellule di Candida GTA due ore dopo l'infezione. Le cellule di Candida GTA non fagocitate vengono rimosse mediante lavaggi con PBS e le cellule intracellulari vengono recuperate per ulteriori studi tramite osmotica dei macrofagi infetti. Questo protocollo può essere utilizzato per valutare sia l'internalizzazione virale delle cellule di Candida GTA nei macrofagi, sia la maturazione fagocitica e la risposta citochinica nei macrofagi derivati da THP-1 in seguito all'infezione da Candida GTA.Inoltre, questo protocollo può essere ampliato per analizzare in modo semi ad alto rendimento la libreria di mutanti del collaboratore Candida per profili di sopravvivenza modificati nei macrofagi TSP1. Il vantaggio principale di questo p

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JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia e Infezioni

Source: Montefusco-Pereira, C. V. et al. P. aeruginosa Infected 3D Co-Culture of Bronchial Epithelial Cells and Macrophages at Air-Liquid Interface for Preclinical Evaluation of Anti-Infectives. J. Vis. Exp.(2020)This video demonstrates a co-culture model of bronchial epithelial cells and macrophage-like cells at the air-liquid interface to study host-pathogen interactions. Pathogenic bacterial infection compromises epithelial membrane integrity, triggering macrophage-like cell activation and...

Establishing a Co-Culture Model to Study Host-Pathogen Interactions at the Air-Liquid Interface

Source: Lê-Bury, G., et al. Phagosome Migration and Velocity Measured in Live Primary Human Macrophages Infected with HIV-1. J. Vis. Exp. (2016)This video demonstrates live confocal imaging of HIV-1-infected human macrophages to visualize and quantify phagosome migration using GFP fluorescence and bright field tracking, providing insights into how HIV alters intracellular trafficking during Fc receptor–mediated phagocytosis.

Live Imaging of Phagosome Migration in HIV-1-Infected Human Macrophages

In questo video, eseguiamo il test di fagocitosi microgliale per il neuroblastoma utilizzando cellule staminali pluripotenti indotte. Il test aiuta a valutare la compromissione della funzione microgliale nelle malattie neurodegenerative.

Saggio di fagocitosi microgliale: un test in vitro per stabilire un modello di fagocitosi microgliale per le cellule di neuroblastoma utilizzando i macrofagi iPSC

In questo video, dimostriamo il test di efferocitosi per studiare la clearance delle cellule apoptotiche utilizzando la microscopia confocale. L'efferocitosi è un processo in più fasi in cui le cellule apoptotiche vengono inghiottite dai fagociti e degradate all'interno di vescicole chiamate efferosomi. Questo protocollo fornisce un metodo per visualizzare porzioni internalizzate e non internalizzate di singole cellule apoptotiche e quantificare l'efferocitosi.

Saggio di efferocitosi cellulare fissa: un metodo per studiare l'assorbimento efferocitico delle cellule apoptotiche da parte dei macrofagi utilizzando la microscopia a fluorescenza

Questo video mostra un test per quantificare la crescita intracellulare dei parassiti nei macrofagi derivati dal midollo osseo (BMM). Le cellule macrofagiche sono infettate dagli stadi invasivi mobili e non mobili della Leishmania, rispettivamente i promastigoti metaciclici e gli amastigoti. I parassiti invadono i macrofagi, interiorizzandosi in un vacuolo parassitoforo e moltiplicandosi all'interno. La crescita intracellulare del parassita viene quantificata utilizzando un microscopio dopo...

Un test in vitro per quantificare la crescita intracellulare del parassita nei macrofagi

Si descrivono i metodi per il live-cell microscopia...

Live-cellula Microscopia Video di funghi patogeni fagocitosi

Fagosoma, la rimozione fagocitica delle cellule apoptotiche, è necessaria per mantenere l'omeostasi ed è facilitata dalla recettori e vie di segnalazione che consentono il riconoscimento, il engulfment e interiorizzazione delle cellule apoptotiche. Qui, presentiamo un protocollo di microscopia di fluorescenza per la quantificazione del fagosoma e l'attività delle vie di segnalazione efferocytic.

Quantificazione del fagosoma da microscopia di fluorescenza di cella singola

Presentato qui è un protocollo per rilevare la produzione di trap extracellulari macrofalo (MET) nella coltura di cellule vive utilizzando microscopia e colorazione a fluorescenza. Questo protocollo può essere ulteriormente esteso per esaminare specifici marcatori proteici MET mediante colorazione immunofluorescenza.

Stimolazione in vitro e visualizzazione del rilascio di trap extracellulari nei Macrofagi derivati da Monciti Umani differenziati

Il meccanismo associato alla fagocitosi nell'infezione da Leishmania rimane poco conosciuto. Qui, descriviamo i metodi per valutare gli eventi precoci che si verificano durante l'interazione di Leishmania con le cellule ospiti.

Studiare la fagocitosi della Leishmania usando la microscopia confocale

La tecnica che prevede la fagocitosi dei conidi fungini da parte dei macrofagi è ampiamente utilizzata per gli studi che valutano la modulazione delle risposte immunitarie nei confronti dei funghi. Lo scopo di questo manoscritto è quello di presentare un metodo per valutare la fagocitosi e le capacità di clearance dei macrofagi di derivazione mononucleare del sangue periferico umano stimolati con Trichoderma stromaticum conidia.

Saggio di vitalità dei conidi di Trichoderma stromaticum all'interno di macrofagi di derivazione mononucleare del sangue periferico umano

I monociti e i macrofagi sono cellule immunitarie molto plastiche e riprogrammabili, cruciali per la salute e la malattia. Percepiscono e rispondono a un'ampia gamma di stimoli adottando specifici programmi di differenziazione e fenotipi. Abbiamo standardizzato un modello in vitro per studiare la polarizzazione e la riprogrammazione dei macrofagi, fornendo uno strumento prezioso per la ricerca.

Riprogrammazione del modello di macrofagi derivati da monociti umani per saggi in vitro

Scopri come stabilire un modello in vitro per studiare il comportamento intracellulare di Candida glabrata nei macrofagi THP-1 umani. Questo protocollo riproducibile valuta la virulenza fungina e le risposte immunitarie.

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