Istituzione di un In vitro Sistema per studiare intracellulare Comportamento Candida glabrata In umani THP-1 macrofagi

L'obiettivo generale di questa procedura è quello di stabilire un sistema modello di coltura in vitro per studiare il comportamento intracellulare di un patogeno fungino opportunista umano. Canida lab ratta in macrofagi derivati dalla linea cellulare monocitica umana TP one. Per ottenere questo THP, un monocito viene prima trattato con quattro esteri per differenziarli in macrofagi.

Successivamente, i macrofagi THP 1 vengono infettati con cellule GTA di canida due ore dopo l'infezione. Le cellule GTA di canida non fagocitosio vengono rimosse dai lavatori PBS e le cellule e intracellulari vengono recuperate per ulteriori studi mediante osmos di macrofagi infetti. Questo protocollo può essere utilizzato per valutare sia le cellule GTA virali a canide nei macrofagi, sia la risposta di Ross e citochine di maturazione faiz nella THP su macro FIDS in seguito all'infezione da candida GTA.

Inoltre, questo protocollo può essere scalato per esaminare la libreria di mutanti collaboratori di candida alla ricerca di profili di sopravvivenza alterati nei macrofagi TSP one in modo semi high throughput. Il vantaggio principale di questo protocollo è che è relativamente economico, altamente riproducibile e facilmente adattabile a diverse cellule immunitarie e ai patogeni fungini. Per iniziare la procedura due giorni prima dell'infezione, portare il THP e le cellule monocitiche all'80% di CO il primo giorno, eliminare il rischio della coltura e portare lentamente e delicatamente tutte le cellule sottili in sospensione.

Trasferire la sospensione di una cellula monocitaria DHP in una provetta da centrifuga da 15 ml. Centrifugare La sospensione cellulare a temperatura ambiente Per quattro minuti A 1000 giri/min Deccan il terreno in un contenitore di scarto a cinque ml di terreno pre API nella provetta e reus. Sospendi il pellet THV a una cellula pipettando delicatamente il terreno tre quattro volte.

Prelevare 10 microlitri della sospensione cellulare per determinare la densità cellulare utilizzando un emocitometro e regolare la densità cellulare a 1 milione di cellule per ml. Aggiungere un microlitro di una soluzione madre di PMA da 60 micromolari alla sospensione cellulare in modo che la concentrazione finale sia di 16 anomolari e mescolare bene. Erogare un ml di sospensione cellulare corrispondente a 1 milione di cellule in ciascun pozzetto di una piastra di coltura tissutale a 24 pozzetti e trasferirlo in un incubatore impostato a 37 gradi Celsius e 5% di CO2.

Dopo 12 ore di incubazione, scartare il vecchio terreno. Aggiungere un ml di terreno pre RPI a ciascun pozzetto e incubare la piastra per altre 12 ore. Queste cellule saranno utilizzate per l'infezione da Canada atorio, che verrà mostrata in seguito.

Utilizzando pratiche microbiologiche appropriate, inoculare una singola colonia di EA in un flass contenente terreno ML YPD. Incubare il flass per 14-16 ore in un'incubatrice impostata a 30 gradi Celsius dopo la centrifuga di incubazione. Una coltura ML a 4.000 giri/min per cinque minuti.

Scartare il sup natina e lavare i gusci tre volte con PBS sterile. Dopo aver eliminato il tampone di lavaggio, sospendere la tavolozza cellulare in un ml di PBS sterile mediante pipettaggio delicato. Successivamente, misurare l'assorbanza della sospensione cellulare in uno spettrofotometro a 600 nanometri e regolare la densità cellulare a 2 milioni di cellule per ml con PBS.

Prelevare 50 microlitri della sospensione cellulare e diluire cento volte in una coltura di cento microlitri su piastra di diffusione PBS su terreno YPD AGA. Incubare la piastra a 30 gradi Celsius e contare il numero di colonie che sono apparse sulla piastra YPD dopo uno o due giorni, moltiplicare questo numero con il fattore di diluizione appropriato per calcolare le unità formanti colonie a zero ore. Queste numerose unità formanti colonie di Canada Reta saranno utilizzate per infettare il DHE sui macrofagi.

Nella fase successiva, aggiungere 50 macro litri di sospensione di cellule di clater del Canada al monostrato di macrofagi in una piastra di coltura di 24 balene. Sporcare la piastra per distribuire uniformemente ogni cellula e incubare a 37 gradi Celsius dopo due ore di incubazione. Scartare il terreno capovolgendo la piastra di coltura in un contenitore per ciascun pozzetto della piastra di coltura a ml di PBS seriale con attenzione lungo il lato dei pozzetti e scartare accuratamente il tampone.

Ripeti questo passaggio altre due volte. Successivamente, ad eccezione del primo pozzetto, aggiungere un mezzo ML RPI a tutti gli altri pozzetti, che può essere utilizzato per monitorare la replicazione intracellulare delle cellule candidatorie a 4, 6, 12 e 24 ore dopo l'infezione per recuperare le cellule e intracellulari dopo due ore di infezione da macrofagi, aggiungere un ML di acqua di cereali al phos. Bene, dopo due minuti, raschiare delicatamente il pozzetto con l'unica punta ML piper per rimuovere i detriti macrofagici dal pozzetto.

Sciacquare bene la fontana e raccoglierla in un tubo per pesci macro centrali. Preparare una diluizione cento volte del lisato cellulare microFIT in PBS e impiattare cento microlitri su terreno YPD AGA. Incubare la piastra a 30 gradi Celsius per uno o due giorni e contare il numero di unità formanti la colonia.

Moltiplicare questo numero con un fattore di diluizione appropriato per enumerare il numero di cellule dell'attore canida che vengono fagocitate da T 2 e macrofagi dopo due ore di infezione. Allo stesso modo, il numero di cellule intracellulari di canina può essere determinato in diversi punti temporali. La replicazione intracellulare e post infezione può essere rappresentata come un aumento delle 24 ore rispetto alle CFU internalizzate a due ore qui mostrate.

Altri risultati di un tipico esperimento in cui il numero totale di cellule di alligatore canida infettate dai macrofagi TV 1 è sei volte 10, due per quattro. Il numero di cellule recuperate a due ore è 3,7, sei volte 10,4. Ciò dimostra che le cellule e vengono fagocitate a un tasso del 62,66% durante il periodo di co-incubazione di 24 ore.

Possono tutte le cellule diverse da una replicazione di 5,2 volte poiché il numero di cellule e intracellulari è aumentato da 3,76 volte 10,4 a 1,96 volte 10,5. In questo esperimento, la replicazione intracellulare delle cellule TER canida può essere valutata anche utilizzando cellule E che esprimono GFP e microscopio confocale. Preparare e infettare THV e macrofagi in un vetrino a quattro camere utilizzando il protocollo descritto in precedenza per la piastra di coltura a 24 pozzetti.

Due ore dopo l'infezione. Scartare il terreno capovolgendo il vetrino in un contenitore per rifiuti a 500 microlitri di PBS per ciascuna camera del vetrino. Risciacquare bene e scartare il PBS.

Ripetere questo passaggio altre due volte a 500 microlitri di altezza formale del 3,7% per fissare le celle. Incubare il vetrino a temperatura ambiente per 20 minuti e scartare il formale de Height. Lavare ogni pozzetto con 500 microlitri di PBS per permeare i macrofagi a 500 microlitri di tritone X dopo cinque minuti di incubazione, rimuovere Triton X lavare il pozzetto con PBS.

Smontare con cautela la slitta della camera utilizzando una slitta per la rimozione della camera e il cursore del pilota pneumatico. Posizionare una goccia di supporto di montaggio Vector Shield contenente DPI su ciascun settore del vetrino, montare un vetrino coprioggetti e sigillare i bordi con vernice per unghie, celle visualizzate al microscopio confocale. Qui sono mostrate le immagini confocali rappresentative dei macrofagi TP uno infettati con GFE che esprimono cellule di laboratorio canida wild type circa un aumento di sei volte del numero di cellule e intracellulari da due a 24 ore è indicativo della replicazione di laboratorio di canida in TP un approccio di mutagenesi del tag di firma dei macrofagi è ampiamente utilizzato per identificare i fattori di ulenza nei patogeni microbici in cui un gran numero di mutanti viene contemporaneamente sottoposto a screening per difetti di crescita tramite un unico oligonucleotide sequenza.

Qui descriviamo il nostro protocollo per lo schermo STM della libreria canadese e della libreria mutante, che consiste nel seguire tre passaggi. Primi 96 plasmidi. Ognuno di essi ospita una pila di sequenze di oligonucleotidi unica e viene immobilizzato su una membrana di nylon.

Nella seconda fase, un pool di 96 mutanti atorator di CANIDA viene sottoposto a screening per profili di sopravvivenza alterati nei macrofagi THV uno, seguito dal recupero di cellule e mutanti YPD, cresciute e internalizzate dai macrofagi, che saranno indicate rispettivamente come campioni di input e output. Infine, i tag di firma del DNA sono amplificati PCI e radiomarcati da campioni di DNA genomico in ingresso e in uscita. Il prodotto PCR viene ibridato in tag univoci e i segnali radioattivi sulla membrana vengono quantificati e analizzati.

Per assemblare l'apparecchio 96 12 dot board, posizionare una membrana di nylon bagnata sopra una carta umida per albero del vento di scambio e serrare le viti dell'unità. Lavare la membrana con acqua sterile, seguita da un lavaggio con idrossido di sodio 0,4 mu. Trasferire 200 nanogrammi di soluzione di PLA BDNA dal blocco 96 12 ai pozzetti corrispondenti dell'apptus del sangue a punti Dopo un lavaggio con idrossido di sodio 0,4 molari.

Rimuovere la membrana dall'apparato sanguigno puntiforme dopo una ferenza in due XXSC attraversando il BDNA plasmatico trasferito alla membrana in un reticolante UV. Incubare la membrana in pre-ibridazione antennale, tampone e input e bottiglie UNE per due ore a 42 gradi Celsius. Preparare sonde di livello radio mediante PCR utilizzando il DNA genomico estratto da tavolozze di cellule di input e output e primer contro la regione di fiancheggiamento invertito di tag unici.

Denaturare le sonde radio a 99 gradi Celsius per cinque minuti e far scattare il gel sul ghiaccio. Trasferire le sonde nelle bottiglie di ingresso e di uscita e incubare per 14-16 ore a 42 gradi Celsius. Post ibridazione.

Lavare le membrane di ingresso e di uscita come descritto nel protocollo. Estrarre le membrane dalle bottiglie e asciugarle all'aria ed esporle a uno schermo di immagini fosfo. Dopo due o tre ore, eseguire la scansione dello schermo al fosforo e acquisire le immagini.

In questo esempio, sono mostrati due filtri a membrana ibridati, che rappresentano lo screening di un pool di 96 mutanti Gatory di canida per una sopravvivenza alterata. In thv uno, la quantificazione dei macrofagi e la determinazione del rapporto tra l'intensità del segnale di ciascun punto sull'uscita e la membrana di ingresso hanno rivelato che i numeri di tag 13, 26, 75 e 85 sono sottorappresentati nell'output. Queste pile sono circondate di rosso e riflettono la crescita di quattro diversi mutanti.

Al contrario, lo stack di mutanti con sequenze uniche 11 e 81 evidenziate in verde è sovrarappresentato nel campione di output. In altre parole, da questa schermata, un pool di 96 mutanti, due mutanti dovrebbero aumentare la sopravvivenza mentre quattro mutanti mostrano una crescita nei macrofagi. I fenotipi di sopravvivenza alterati identificati in tale screening del pool devono essere verificati in saggi di singola infezione.

Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come mettere in atto un sistema orale in vitro per studiare il profilo di crescita intra del patogeno fungino di tuo interesse. Inoltre, dovresti essere in grado di condurre uno screening del pool di mutanti su larga scala utilizzando il sistema ora.