Rapid Protocollo per la preparazione di elettrocompetenti Escherichia coli E Vibrio cholerae

L'obiettivo generale di questa procedura è quello di generare batteri competenti in modo rapido e conveniente nello stesso giorno. Sono necessari per la trasformazione. Ciò si ottiene prima placcando i batteri su agar LB e incubandoli per quattro-sei ore.

Successivamente, il prato batterico viene raccolto con cura dalla superficie dell'agar e il pellet viene risospeso in acqua fredda sterile o tampone. Quindi il pellet batterico viene lavato tre volte a quattro gradi Celsius e risospeso in 40 microlitri. Infine, le cellule competenti vengono elettroporate in presenza di DNA.

In definitiva, si possono ottenere risultati che mostrano livelli di trasformazione batterica paragonabili a quelli ottenuti con il metodo tradizionale che richiede attrezzature considerevoli, grandi volumi di colture batteriche e tamponi sterili. Il vantaggio principale di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti è che i batteri freschi e competenti possono essere preparati praticamente da qualsiasi ceppo di laboratorio lo stesso giorno in cui viene pianificata la trasformazione senza la necessità di grandi centrifughe, rotori o leader di tamponi e colture sterili. In generale, gli individui nuovi a questo metodo non avranno molta difficoltà perché questa è solo una variante scorciatoia delle tecniche comunemente impiegate nei laboratori di batteriologia. L'ideatore di questo protocollo non può essere identificato in quanto è stato utilizzato e ottimizzato da numerosi ricercatori nel corso del tempo.

Il metodo qui presentato è stato utilizzato nei nostri laboratori per quasi due decenni ed è nostro obiettivo condividere questo utile protocollo con i nostri colleghi. La dimostrazione visiva di questo metodo è importante per un passaggio. In particolare, la raccolta dei batteri dal prato sulla trivella perché ci vuole un occhio esperto per valutare la crescita sulla piastra.

E questo è meglio visualizzato. A dimostrare la procedura è Theresa Brooks, assistente di ricerca del laboratorio del Dr. Te Koski presso l'Università di Alberta a Edmonton, in Canada. Per iniziare la preparazione della coltura batterica nel tardo pomeriggio, utilizzare una piccola quantità di e coli o raggi per inoculare da uno a cinque millilitri di brodo LB in autoclave in provette sterili di vetro silicato bo.

Mettere le provette inoculate in un tamburo a rulli e incubare per una notte a 37 gradi Celsius e ad alta velocità. Preparare un divaricatore di cellule a forma di mazza da hockey da un'asta di vetro riscaldando il centro dell'asta nella fiamma di un bruciatore bunsen fino a quando il vetro non si ammorbidisce. Quindi usa una pinzetta o una pinza per dirigere delicatamente la curva in un angolo di 135 gradi.

Riscalda nuovamente l'asta nel punto medio tra l'estremità e la prima curva e piegala con un angolo di 45 gradi verso l'interno. Preparare libbre di aerati con e senza antibiotici e conservare a quattro gradi Celsius. La mattina dopo.

Piastra 100 microlitri di coltura notturna su ciascuna piastra di agar LB. Utilizzando lo spandiconcime, incubare la piastra a 37 gradi Celsius per quattro-sei ore o fino a quando non diventa visibile un sottile prato di crescita batterica. Utilizzando un anello di inoculazione, prelevare una massa batterica di circa due millimetri di diametro dalla piastra e sospenderla in un millilitro di ghiaccio freddo.

Cloruro di calcio a due millimolari. Se si utilizza il coray o l'acqua sterile doppiamente distillata per l'e coli utilizzando una centrifuga refrigerata impostata a quattro gradi Celsius, centrifugare la sospensione per cinque minuti a 5, 000 Gs.Scartare il surnatante e ripetere il lavaggio altre due volte. Dopo aver rimosso il residuo surnatante finale, sospendere il pellet in 40 microlitri di cloruro di calcio o acqua doppiamente distillata e tenere in ghiaccio.

Per effettuare una trasformazione, aggiungere fino a un microgrammo di DNA plasmatico alla sospensione batterica da 40 microlitri e trasferire la miscela in uno spazio sterile pre-raffreddato di 0,2 centimetri. Inserire il vete nella camera di elettroporazione del modulo di controllo degli impulsi e mangiare a 1,8 kilovolt e 25 micro phs. La costante di tempo dovrebbe essere di circa 5,0 millisecondi e non dovrebbero verificarsi archi elettrici.

Risospendere rapidamente le cellule in un millilitro di brodo LB e trasferirle in una provetta di vetro per grigliare precedentemente in autoclave. Lasciare che le cellule si riprendano incubando in condizioni di crescita aerata a 37 gradi Celsius per 30 minuti senza selezione di antibiotici. Placcare i batteri su piastre LB ager con antibiotico e incubare a 37 gradi Celsius durante la notte.

Come mostrato qui, abbiamo effettuato una serie di trasformazioni con e coli e V co array per confrontare l'efficienza di trasformazione della nostra metodologia rapida con un adattamento del metodo tradizionale originariamente descritto da doer et al per la preparazione di batteri elettrocompetenti. La resa del trasformante era compresa tra 10 del sesto e 10 del settimo CFU per microgrammo di DNA nell'intervallo di tre esperimenti replicati per e coli e v coray. Utilizzando il metodo tradizionale per l'elettrocompetenza.

Preparazione cellulare, la resa del trasformante è apparsa diminuita di dieci volte a 10, al quinto, a 10 al sesto CFU per microgrammo di DNA in tre esperimenti replicati per e coli e v coray utilizzando il metodo rapido. Per questo motivo, abbiamo determinato la percentuale di batteri trasformati dividendo le CFU trasformate per il numero di CFU recuperate da trasformazioni simulate da lotti altrimenti identici di cellule competenti. La percentuale di batteri trasformati era entro un registro.

Indipendentemente dal metodo di preparazione e dalla specie trasformata. Questi risultati suggeriscono che l'efficienza del metodo rapido è paragonabile a quella della tradizionale procedura più lunga di preparazione di cellule competenti e che i ceppi rappresentativi di ieo, coray ed esia coli sono ugualmente suscettibili alla procedura rapida. Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere eseguita entro cinque o sei ore, eseguita correttamente.

Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordarsi di raccogliere i batteri durante la loro fase logaritmica di crescita, lavarli in una soluzione di acqua tampone sterile, appena preparata e pre-raffreddata e mantenerli freddi fino a quando non vengono risospesi in LB dopo l'elettroporazione. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come generare rapidamente cellule specifiche per ceppi batterici elettrocompetenti nel tuo laboratorio coltivandole sul prato inaugurale, raccogliendole durante la fase logaritmica di crescita e quindi lavandole in un tampone freddo in preparazione per l'elettroporazione.