Metodo per l'etichettatura di trascrizioni in cellule individuali Escherichia coli per singola molecola di fluorescenza In Situ gli esperimenti di ibridazione
21 dicembre 2017
Questo manoscritto descrive un metodo per l'etichettatura individuale RNA messaggero (mRNA) trascrizioni con sonde di DNA fluorescente etichettati, per l'uso in singola molecola fluorescenza in situ (smFISH) gli esperimenti di ibridazione in Escherichia coli. smFISH è un metodo di visualizzazione che permette la rilevazione simultanea, la localizzazione e quantificazione delle singole molecole di mRNA in singole celle fisse.
L'obiettivo generale di questo protocollo è quello di marcare singoli trascritti in E.Coli per sonde di DNA marcate in fluorescenza per la visualizzazione in esperimenti FiSH a singola molecola. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo della biologia dei sistemi, come la caratterizzazione delle trascrizioni della capacità cellula-cellula del campo di interesse. Così come i trascritti di localizzazione della parete cellulare.
Il vantaggio principale di questa tecnica è che fornisce una quantità di informazioni sulle statistiche dei processi trascrizionali. Per iniziare il protocollo, coltivare E.Coli MG1655 in terreno LB durante la notte in un agitatore orbitale, a 260 giri/min e 37 gradi Celsius. Il giorno successivo, diluire la coltura notturna a una temperatura compresa tra 1 e 100 in terreno fresco e misurarne la densità ottica in uno spettrofotometro, fino a un valore compreso tra 0,2 e 0,4.
Quindi, pellettare le celle mediante centrifugazione per cinque minuti a 4, 500 G a quattro gradi Celsius. Rimuovere il surnatante da tutte le provette. Aggiungere un millilitro di 1XPBS a ciascuna provetta e risospendere il pellet per ridurre al minimo l'aggregazione da cellula a cellula.
Quindi aggiungere quattro millilitri di tampone di fissazione e agitare delicatamente il tubo. Incubare i campioni in un agitatore orbitale. Risospendere il pellet per ridurre al minimo l'aggregazione da cellula a cellula, che può interferire con l'imaging cellulare.
Dopo l'incubazione, pellettare le cellule, rimuovere il surnatante e aggiungere un millilitro di 1XPBS. Trasferire le sospensioni in provette per microcentrifuga a fondo conico da 1,8 millilitri. Pellettare le celle mediante centrifugazione.
Iniziare la permeabilizzazione dei batteri rimuovendo con cura il surnatante. Utilizzare pipette di piccolo volume per rimuovere tutto il liquido all'esterno del pellet. Successivamente, risospendere il pellet in acqua trattata DEPC da 300 microlitri.
Aggiungere 350 microlitri di etanolo assoluto di alta qualità e mescolare delicatamente la soluzione capovolgendo il tubo. Aggiungere altri 350 microlitri di etanolo e mescolare ancora. Quindi ruotare il campione con il rotatore del tubo a 20 giri/min per un'ora a temperatura ambiente.
Pellettare le celle dalla permeabilizzazione. Dopo la centrifugazione, rimuovere il surnatante. Aggiungere un millilitro di tampone di lavaggio al 20% ai campioni.
Lasciarli riposare per diversi minuti. Successivamente, le celle a pellet per centrifugazione per sette minuti a 750 G e quattro gradi Celsius. Rimuovere il surnatante molto delicatamente e utilizzare pipette di piccolo volume per rimuovere tutto il liquido all'esterno del pellet.
Quindi aggiungere la soluzione madre del set di sonde oligonucleotidiche all'aliquota del tampone di ibridazione in modo che la concentrazione finale di oligonucleotidi sia di 250 nanomolari e far vorticare vigorosamente il tubo. Sospendi i campioni in 50 microlitri di tampone di ibridazione che contiene le sonde oligonucleotidiche, evitando la generazione di bolle. Lasciare i campioni per una notte, al buio, su un blocco termico a 30 gradi Celsius.
Per preparare il lavaggio, procurarsi una nuova provetta per microcentrifuga per ogni campione da visualizzare. Aggiungere un millilitro di tampone di lavaggio a ciascun tubo. Aggiungere da 10 a 15 microlitri dai campioni ibridati alla nuova provetta che contiene il tampone di lavaggio.
Pellettare le celle mediante centrifugazione. Quindi, rimuovere il surnatante. Lavare i campioni altre due volte.
Risospendere il pellet in un tampone di lavaggio da 25 microlitri. Preparare un gel di agarosio aggiungendo 150 milligrammi di agarosio a 10 millilitri di tampone 2X SSC. Cuocere la soluzione nel microonde per 10-15 secondi ogni volta, fino a quando l'agarosio non si dissolve completamente.
Quindi mettere da parte il tubo a raffreddare per qualche minuto. Quindi, posizionare una cornice in silicone di separazione sul vetrino in modo che il centro del vetrino rimanga esposto. Posiziona un anello rigido largo 10 millimetri e spesso da uno a due millimetri al centro del carrello.
Depositare una piccola quantità di gel al centro per sigillare e attendere qualche minuto affinché il gel si indurisca. Quindi aggiungere altro gel, fino a formare una forma a cupola alta. Attendere circa 10 minuti affinché il gel si indurisca e rimuovere l'anello.
Depositare 10 microlitri di cellule batteriche di lavaggio sul gel e sigillarlo con un vetrino coprioggetti numero zero. Tenere il campione al buio per evitare lo sbiancamento delle foto. Le misurazioni smFiSH delle cellule di E.coli mostrano il livello di induzione di galK in risposta a concentrazioni variabili di D-fucosio extracellulare.
Il segnale di fondo è mostrato da un ceppo galK cancellato, o delta galK JW0740 come controllo negativo. Nella maggior parte delle cellule si osservano numerose macchie. Corrispondente a uno o pochi trascritti galK quando due millimolari di D-fucosio vengono aggiunti alla coltura batterica.
Considerando che, alcune macchie si osservano in assenza di D-fucosio extracellulare. Un altro esempio per l'applicazione di questo protocollo è fornito dal gene sodB, con immagini a fluorescenza e contrasto di fase di smFiSH in un tipo selvatico o in un ceppo deleto di sodB JW1648. I campioni preparati con questo protocollo possono anche essere visualizzati utilizzando STORM che consente un'accurata precisione dei trascritti nella cellula.
Dopo il suo sviluppo, questa tecnica ha aperto la strada ai ricercatori nel campo della biologia dei sistemi per esplorare le statistiche degli eventi di trascrizione nelle singole cellule.
Visualizza la trascrizione completa e accedi a migliaia di video scientifici
Panoramica
Questo manoscritto descrive un metodo per etichettare singoli trascrittometri dell'RNA messaggero (mRNA) con sonde di DNA fluorescentemente etichettate per l'uso in esperimenti di ibridazione in situ a fluorescenza a singola molecola (smFISH) in E. coli. Questa tecnica consente la rilevazione, la localizzazione e la quantificazione simultanea di singole molecole di mRNA in cellule singole fissate.
Componenti principali dello studio
Area della scienza
- Neuroscienze
- Biologia dei sistemi
- Biologia cellulare
Sfondo
- La ibridazione in situ a fluorescenza a singola molecola (smFISH) è un potente metodo di visualizzazione.
- Questo metodo consente lo studio dei processi trascrizionali a livello di singola cellula.
- Comprendere la localizzazione e la quantificazione dell'mRNA è cruciale per la biologia dei sistemi.
- E. coli serve come organismo modello per questi esperimenti.
Obiettivo dello studio
- Etichettare singoli trascrittometri dell'mRNA in E. coli.
- Visualizzare la localizzazione dell'mRNA utilizzando sonde di DNA fluorescentemente etichettate.
- Migliorare la comprensione della variabilità trascrizionale tra le cellule.
Metodi utilizzati
- Coltivare E. coli MG1655 in terreno LB durante la notte.
- Diluire la coltura notturna in terreno fresco.
- Misurare la densità ottica per garantire condizioni di crescita adeguate.
- Applicare sonde di DNA fluorescentemente etichettate per l'analisi smFISH.
Risultati principali
- Etichettatura di successo dei singoli trascrittometri dell'mRNA.
- Visualizzazione della localizzazione dell'mRNA all'interno delle cellule fissate.
- Quantificazione dei processi trascrizionali a livello di singola molecola.
- Informazioni sulla variabilità tra cellula e cellula nell'espressione dei trascrittometri.
Conclusioni
- Il metodo fornisce un approccio robusto per studiare la dinamica dell'mRNA.
- Contribuisce con informazioni preziose al campo della biologia dei sistemi.
- Questa tecnica può essere applicata a varie domande di ricerca riguardanti l'espressione genica.
Domande frequenti
Executive Industry Relevance
Single-molecule fluorescence in situ hybridization (smFISH) in E. coli enables direct quantification and spatial mapping of mRNA transcripts at single-cell resolution, addressing key challenges in understanding transcriptional heterogeneity. This capability supports predictive confidence in early discovery by revealing cell-to-cell variability and subcellular transcript localization. The method is strategically positioned for target validation and mechanistic de-risking in microbial systems biology and synthetic biology pipelines.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables quantitative interrogation of gene expression variability across individual bacterial cells.
- Supports mechanistic de-risking by mapping transcript localization and abundance at single-molecule resolution.
- Facilitates functional target validation by distinguishing true biological effects from population-averaged artifacts.
- Provides high-content data for hypothesis-driven pathway analysis in microbial models.
Screening & Assay Development
- Prepares validated bacterial systems for downstream screening of gene regulation or synthetic constructs.
- Delivers reproducible, quantitative mRNA copy number outputs for assay standardization.
- Enables multiplexed transcript detection within single cells, limited by spectral overlap of fluorophores.
- Supports robust evaluation of gene induction or repression in response to experimental perturbations.
Translational & Preclinical Research
- Aligns with translational biomarker strategies by enabling precise quantification of gene expression changes in microbial models.
- Provides continuity from discovery to preclinical validation for engineered strains or pathway interventions.
- Reduces risk in advancing microbial targets by supplying single-cell resolution data on transcript dynamics.
Pipeline & Workflow Integration
This smFISH labeling method integrates into the discovery-to-preclinical continuum for microbial systems, supporting both hypothesis testing and quantitative analytics.
- Discovery Biology: Delivers direct measurement of transcriptional events and spatial transcript distribution for pathway clarification.
- Screening: Supplies standardized, quantitative readouts for evaluating gene expression modulation in engineered or wild-type strains.
- Analytics: Enables statistical analysis of mRNA copy number distributions and cell-to-cell variability using open-source or custom software.
- Translational Research: Bridges discovery findings to preclinical models by validating gene expression changes at single-cell resolution.
- Enterprise Reuse: Offers a reusable workflow for transcript quantification in diverse bacterial systems and experimental contexts.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in microbial gene expression studies.
- Operational Value: Standardizes transcript labeling and imaging for reproducible, scalable data generation.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions for microbial targets and synthetic constructs by providing high-resolution expression data.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of microbial targets and engineered pathways based on quantitative single-cell analytics.
Implementation Considerations
- Requires expertise in bacterial cell handling, fixation, and fluorescence microscopy.
- Needs access to fluorescence imaging platforms with low-intensity detection and appropriate filter sets.
- Demands cross-team standardization of probe design and imaging protocols for reproducibility.
- Adaptation to other bacterial strains or gene targets may require probe redesign and spectral optimization.
- Multiplexing is limited by spectral overlap of available fluorophores, constraining simultaneous gene detection.
