Name: Assorbimento di liquidi nasali e bronchiali: precisione campionamento della Mucosa respiratoria umana e laboratorio di lavorazione dei campioni (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-01-21T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 54 s
Description: Scopri le tecniche di nasosuzione e broncosuzione per il campionamento della mucosa respiratoria umana utilizzando matrici assorbenti sintetiche. Questi metodi non invasivi migliorano la standardizzazione e la tollerabilità nel monitoraggio delle malattie respiratorie.

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Finanziamento: Questo lavoro è stato sostenuto da finanziamenti da Imperiale Istituto nazionale per salute ricerca (NIHR) Biomedical Research Centre (BRC), NIHR salute protezione Research Unit (HPRU) nelle infezioni respiratorie dell'Imperial College di Londra in partenariato con sanità pubblica inglese (PHE) e il centro di ricerca traslazionale NIHR imperiale sicurezza del paziente. Le opinioni espresse sono quelle degli autori e non necessariamente quelle di NHS, la NIHR, il dipartimento della salute o sanità pubblica inglese.

Le tecniche utilizzate nel protocollo seguente sono state approvate dal comitato etico West London ricerca (numero di riferimento 15/lO/0444).
1. assorbimento nasale (NA)
<ol><li>
Preparazione prima del campionamento di NA
	<ol>
<li>Quando effettuano NA, prima lavarsi le mani e indossare guanti, preferibilmente davanti il paziente.</li>
		<li>Ispezionare la cavità nasale utilizzando una torcia e hanno il clinico utilizzare loro pollice non dominante per ritrarre il naso del paziente per visualizzare la cavità nasale. Nota: Uno speculum nasale non è generalmente necessario.</li>
		<li>Visualizzare la cavità nasale e turbinato prima del campionamento inferiore. Nota: Le narici (narici) non sono rotonde in sezione trasversale e vanno dritto all'indietro. Generalmente, il turbinato inferiore può essere visto come un rigonfiamento o rientranza sulla parete laterale della narice, con setto nasale formando la parete liscia, piatta mediale. Vogliamo che per esempio da questo inferiore dei turbinati, poiché l'epitelio sottostante è un semplice epitelio ciliato delle vie respiratorie44.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Campionamento di NA
	<ol>
<li>Durante il campionamento, passare il SAM NA delicatamente il lumen della narice, orientando per essere piatta contro il turbinato inferiore.</li>
		<li>Chiedere il donatore utilizzare un dito indice per premere il SAM sulla mucosa nasale. NA può causare un lieve solletico, con possibile occhio irrigazione, come la FML è assorbito. Nota: Negli adulti, eseguiamo generalmente NA per 60 s.</li>
		<li>Dopo l'assorbimento della FML, rimuovere il dispositivo di NA dalla narice e rimettere il tubo originale.</li>
		<li>Trattare i campioni immediatamente in laboratorio o congelarli, come descritto in dettaglio più avanti in questo protocollo. Nota: NA sta studianda in una varietà di modelli di mucosa nasale di sfida e anche in malattie diverse vie aeree. Tuttavia, convalida contro altri metodi di campionamento respiratoria deve essere eseguita per ciascuna popolazione di studio e paziente.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. assorbimento bronchiale (BA)
<ol><li>
Preparazione prima del campionamento di BA Nota: BA è eseguita da personale specializzato in una suite di broncoscopia.<ol>
<li>Prima dell'immissione BA giù il catetere, verifica che il SAM è d'espulsione e ritiro indietro nel catetere.</li>
		<li>Prima di svolgere BA su un paziente, condurre un finto BA su un simulatore di broncoscopia.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Campionamento di BA
	<ol>
<li>Passare il broncoscopio giù la trachea e del bronco principale destro al livello del Bronco intermedius, appena prossimale alla divisione in lobi più basso di destra e centrale di destra. Nota: Abbiamo in genere campione dal Bronco intermedius, anche se altri siti all'interno delle vie respiratorie possono essere campionati. Quando si osserva il catetere e SAM, non si può vedere la punta del broncoscopio. Osserviamo i seguenti semplici passi per BA, una volta che il broncoscopio ha raggiunto il sito di campionamento desiderata.</li>
		<li>CATETERE giù: Inserire il catetere BA attraverso il canale operativo del broncoscopio fino a quando la punta bianca è appena visibile nelle vie respiratorie, ad un massimo di 1 cm distalmente alla fine del broncoscopio. Mantenere il broncoscopio e catetere punta al centro del lume delle vie aeree. Fare attenzione a ridurre al minimo il contatto tra la punta del catetere e la mucosa bronchiale per ridurre il rischio di abrasione della mucosa.</li>
		<li>SAM OUT: Premere la maniglia del dispositivo BA in modo che il SAM viene estruso nel lume delle vie aeree del lobo inferiore destro o centrale di destra. Sotto visione diretta, piegare la punta del broncoscopio per garantire che il SAM è entrare in contatto con la FML sulla parete delle vie aeree. Lasciare il SAM all'interno delle vie respiratorie, piatto alla parete della mucosa per 30 s.</li>
		<li>IN SAM: Guardare attraverso il broncoscopio per garantire che la sonda di SAM umida è lineare e non piegati indietro sopra l'estremità del catetere. Se richiesto, la punta del catetere e broncoscopio possa essere portata indietro per raddrizzare il SAM. Sotto visione diretta, ritrarre il SAM dritto delicatamente indietro nel catetere. Nota: Se c'è difficoltà ritraendo il SAM indietro nel catetere, ritirare l'intero dispositivo con SAM estruso indietro fuori le vie respiratorie.</li>
		<li>CATETERE fino: Ritirare il catetere intero dal canale operativo del broncoscopio.</li>
		<li>CUT OFF SAM: Il SAM è tagliare con forbici sterili e viene poi messo in un stoccaggio PROVETTE CRIOGENIA sul ghiaccio. Questi campioni possono essere elaborati con metodi diversi, come descritto in dettaglio più avanti in questo protocollo.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. elaborazione di NA e BA campioni
Nota: Ci sono numerose opzioni per l'elaborazione di laboratorio di campioni derivanti da NA e BA. Questi protocolli cercano di conservare i campioni per un uso successivo e per eluire il campione MLF da SAM.
<ol><li>
Opzioni per la gestione immediata di campioni NA e BA
	<ol>
<li>Opzione 1: Memorizzare il SAM umido sul ghiaccio per un paio d'ore prima di un'ulteriore elaborazione.</li>
		<li>Opzione 2: Immediatamente deep freeze NA SAMs nell'insieme tubo. Allo stesso modo, congelare BA SAMs in fiale criogenici dopo la rimozione, con le forbici, dal dispositivo di campionamento.</li>
		<li>Opzione 3: Posizionare il SAM distaccato in tampone di eluizione (300 µ l) prima della sua elaborazione direttamente o profondità di congelamento.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Opzioni di tampone di eluizione per campioni NA e BA Nota: La scelta di tampone di eluizione dipende da ciò che sta per essere analizzati nel campione MLF e suggeriamo quattro alternative principali:<ol>
<li>Utilizzare un tampone di dosaggio pre-preparato adatto per procedure di immunoanalisi. Tale buffer deve contenere una piccola quantità di detersivo (0,05%) così come proteina, per esempio, albumina di siero bovino (BSA) all'1%.</li>
		<li>In alternativa, utilizzare un buffer che contiene una maggiore quantità di detersivo, in modo che lisi cellulare si verifica. Nota: Usiamo il buffer contenente Triton-X o NP40 a 1% di concentrazione. Buffer di lisi delle cellule abilitare citochine intracellulari ed extracellulari essere eluite da SAM e generalmente provocare i livelli elevati di citochine e chemochine. Questi buffer devono inoltre contenere proteine e sono realizzati con BSA all'1%.</li>
		<li>Per misurazioni di RNA, come la PCR quantitativa del RNA virale o misura del RNA di host, è necessario aggiungere tampone di estrazione di RNA direttamente al SAM umida. Nota: Buffer di estrazione RNA caotropici contengono guanidinium che denatura le proteine. Un'alternativa consiste nell'aggiungere il tampone di estrazione di RNA al fluido di MLF eluiti contenute nel buffer di lisi di immunoassay o cella.</li>
		<li>Utilizzare solventi organici, come l'acido trifluoroacetico, per l'estrazione dei lipidi e dei metaboliti, per la valutazione tramite spettrometria di massa. Nota: Dettagli di tutti i reagenti sono inclusi nella sezione materiali.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Tecnica di eluizione
	<ol>
<li>Per tutte le tecniche di eluizione sopra, inserire il SAM in una provetta da 2 mL micro-centrifuga, insieme con il tampone di estrazione desiderata.</li>
		<li>Vortice mescolare il campione per 30 s a lavare il SAM di fluidi senza bloccare allegati e biomolecole.</li>
		<li>Per garantire il recupero del campione completo, eseguire centrifugo eluizione aggiungendo il SAM umido a una mini-colonna di filtro spin che inserisce lo stesso tubo del micro-centrifuga 2 mL utilizzato per il lavaggio. Nota: Due tipi di mini-colonna di filtro spin possono essere utilizzati. Il primo contiene solo una maglia di plastica, che tiene il SAM sul posto, permettendo la completa eluizione dei fluidi. In alternativa, se lavora con materiale infetto, è possibile utilizzare filtri spin con un diametro dei pori da 0,22 µm. Questi filtri si sterilizzare campioni e sono adatti per i campioni con sospetta infezione micobatterica. Tuttavia, questi filtri vanno pre-incubati con buffer, per minimizzare l'associazione dei mediatori al filtro da interazioni non specifiche.</li>
		<li>Utilizzare forcipe sterilizzato per trasferire il SAM umido al filtro spin. Cambiare il forcipe tra campioni per prevenire la contaminazione.</li>
		<li>Centrifugare i campioni per 20 min a 16.000 x g in una mini-centrifuga raffreddata a 4 ° C.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Protocollo di esempio Sommario
	<ol>
<li>In laboratorio, etichetta mL 2 micro-provette per la raccolta del campione e aggiungere il volume di tampone di eluizione (tipicamente 300 µ l per NA; 100 µ l per BA). Guarnizione coperchio e metterli su ghiaccio.</li>
		<li>Seguendo il SAM di campionamento (immediatamente o in laboratorio) è rimosso dall'impugnatura usando il forcipe e inserito nel buffer contenente tubo di raccolta (prodotto nel passaggio precedente). Assicurare il tappo del tubo del microcentrifuge è chiuso saldamente e trasferire i campioni, il ghiaccio, al laboratorio per un'ulteriore elaborazione.</li>
		<li>Rimuovere le provette contenenti il buffer di SAM ed eluizione da loro mix di contenitore e vortice di trasferimento per 30 s.</li>
		<li>Utilizzando pinze sterili, rimuovere SAM e collocare in una colonna di rotazione (con o senza filtro di acetato di cellulosa 0,22 µm).</li>
		<li>Raccogliere il tampone di eluizione dal tubo di raccolta e conservare.</li>
		<li>Posizionare la colonna di spin, con SAM, nel tubo di raccolta originale (o uno nuovo se il filtro sterile campioni) e aggiungere tampone di raccolta per far girare la colonna. In questo modo, il fluido di lavaggio passa attraverso la colonna di spin nuovamente dentro il tubo di raccolta, contribuendo a eluire il campione da SAM.</li>
		<li>Centrifugare i campioni con coperchi sigillati (16.000 x g, 20 min, 4 ° C).</li>
		<li>Rimuovere i campioni dalla centrifuga e collocare in un rack.</li>
		<li>Aprire il coperchio sigillato dei tubi e rimuovere la colonna contenente il SAM. Smaltire colonna SAM e spin in un apposito contenitore per rifiuti.</li>
		<li>Attentamente l'eluato contenuta all'interno del tubo in etichettati criogenico aliquota tubi. Registrare il volume e il volume totale di eluato in ciascuna aliquota.</li>
		<li>Trasferire le provette sigillate criogeniche a un congelatore a-80 ° C e conservare in posizione verticale fino all'utilizzo.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

Gli autori non hanno nulla a rivelare.

Risultati da tecniche di campionamento delle vie respiratorie esistenti sono considerare come altamente variabile; tecniche di campionamento alternativi sono necessari per standardizzare la ricerca all'interno di questo campo5. NA e BA consentono il campionamento della FML in maniera non invasiva e hanno potenziale emozionante per misurare le risposte immunitarie nelle vie aeree di sani e malati. Queste tecniche offrono numerosi potenziali vantaggi rispetto alle tecniche esistenti, tra cui maggiore tollerabilità, la capacità di ripetere frequentemente il campionamento, la velocità di campionamento bassa variabilità inter-utente e diminuito la diluizione di mediatori immuni5 . La durata dell'assorbimento e della tecnica di lavorazione utilizzata dovrebbe essere ottimizzata per ogni studio e rigorosamente mantenuta tra gli eventi di campionamento. Inoltre, nel caso di BA, il sito di campionamento all'interno delle vie respiratorie deve essere attentamente replicato tra gli individui.
NA e in particolare BA, sono ancora relativamente nuove tecniche per la ricerca clinica. Tuttavia, i benefici di queste tecniche hanno portato nel loro uso in numerosi studi, tra cui attenta convalida rispetto a tecniche alternative5. Questi dispositivi sono ora disponibili come dispositivi di marcatura pronto per l'uso molto diffuso nella ricerca delle vie respiratorie. Mentre NA e BA provocare molto più piccoli volumi di campione rispetto alle tecniche di campionamento alternativi, le più alte concentrazioni ottenute possono provocare una maggiore sensibilità per mediatori immuni abbondanza bassa.
A seconda delle applicazioni a valle desiderate, NA e BA campioni possono essere congelati direttamente per la successiva elaborazione, studio di fattibilità in un ambiente di ricerca clinica di miglioramento. Il protocollo per la gestione dei campioni possa anche essere adattato alle particolari applicazioni a valle. Le tecniche di lavorazione suggerito possono essere utilizzate per la raccolta di proteine o di mediatori immuni del lipido o di acidi nucleici, ma dovrebbero essere ottimizzate per ogni studio. In particolare, FML possono essere eluiti con diversi buffer. In primo luogo, immunoassay buffer può essere utilizzato per misurare la mucosa citochine, chemochine e anticorpi6,45. Buffer con i livelli elevati di detersivo è utilizzabile anche per garantire la lisi cellulare si verifica, permettendo l'inclusione delle citochine intra-cellulare. Estrazione di RNA caotropici buffer deve essere utilizzato per la determinazione dell'infezione virale, viral carico, ospitare mRNA e il microbioma. In alternativa, i solventi organici possono essere utilizzati per lipidomica e spettrometria di massa.
In conclusione, assorbimento diretto della FML da superfici mucose è una tecnica entusiasmante con potenziale impiego in malattie mucose respiratorie, gastro-intestinale, urogenitale e altre. Tuttavia, queste promettenti tecniche di assorbimento richiederà precisa convalida di campionamento e di elaborazione tecnica per singoli saggi (biomarkers) in ogni ambiente di malattia. Inoltre, queste tecniche di campionamento della mucosa romanzo precisione richiede convalida contro campioni convenzionali, come da sangue, respiro ed espettorato. Con queste tecniche, FML può essere utilizzato per misurare i microbi, citochine, chemochine, prostanoidi e anticorpi.

La maggior parte delle malattie respiratorie causano una risposta infiammatoria, e c'è un urgente bisogno di campionamento dalla superficie della mucosa respiratoria nella rinite allergica, infezioni virali e fungine, tubercolosi, asma, malattia polmonare ostruttiva cronica, polmonare cancro del polmone e fibrosi 1. Aspirato nasofaringeo (NPA), lavaggio nasale e lavaggio broncoalveolare (BAL) sono tecniche comuni per le vie respiratorie superiori e inferiori di campionamento. Tuttavia, queste tecniche presentano notevoli problemi tra cui la scarsa tollerabilità, diluizione dei mediatori infiammatori e l'impossibilità di ripetere frequentemente il campionamento2. Un'alternativa al campionamento NPA è l'uso di tamponi, o nylon "floccati", cotone, o rayon3,4, ma questi inoltre hanno dei limiti, poiché causano disagio e danni all'epitelio nasale e in qualche legame irreversibile di casi di mediatori infiammatori5. Queste tecniche generalmente non possono essere ripetute in serie più di un'ora, e tecniche alternative possono essere più efficaci per il rilevamento di abbondanza bassa citochine e chemochine5,6. Inoltre, la variabilità di utente connessa con queste tecniche potrebbe generare incoerenze nei dati, risultanti nel requisito di più grandi gruppi di pazienti.
In alternativa, tecniche di assorbimento utilizzando spugne naturali e sintetici sono stati utilizzati per raccogliere FML da superfici mucose. Oftalmiche spugne composto di cellulosa naturale (ad es., Weck-cel) sono stati usati per esempio saliva, cervicale e le secrezioni vaginali7. Inoltre, spugne sintetiche effettuata in alcol polivinilico (PVA) e acetato di polivinile idrossilato (HPVA) sono stati utilizzati8. Sette diversi materiali fonoassorbenti sono stati confrontati per campionamento fluido orale prima della misura gli anticorpi9, mentre il mini-spugne in poliuretano sono stati utilizzati per raccogliere le lacrime umane10.
Carta da filtro costituito da cellulosa naturale dalla pianta del cotone è stato ampiamente usato per assorbire le secrezioni nasali dal libro pionieristico di Alam e colleghi nel 199211,12,13,14, 15,16,17. Dischi di carta da filtro sono state prodotte da schede di filtro (ad esempio Shandon) e sono stati utilizzati per misurare le istamine e citochine dopo aver controllato le sfide nasale allergene e con allergene naturale esposizione18,19 ,20,21. Tuttavia, diversi lotti di carta da filtro variano nel loro grado di legame con le proteine e alcuni non riescono a rilascio di citochine. Metodi utilizzando una matrice sintetica assorbente (SAM) sono quindi stati sviluppati2,22,23. SAMs sono generalmente utilizzate per ottenere MLF nasale di na Questi materiali assorbenti sono comodi da utilizzare e consente di ottenere MLF anche dal naso infiammato a intervalli frequenti su lunghi periodi di tempo.
Assorbimento nasale è una forma di campionamento della mucosa precisione utilizzando una SAM per il campionamento della FML in vie respiratorie superiori. NA dispositivi sono fabbricati come dispositivi medici recanti la marcatura CE dei materiali grado medicale con camere pulite e sono privi di polvere e allergeni. Il campionatore di NA è costituito da un manico e SAM in una sterile stoccaggio provette criogenia. Il SAM è costituito da polimeri, in genere fibre, ma è anche disponibile come schiuma, e questi sono selezionati per essere morbido e assorbente, con rapido wicking per raccolta del campione. SAMs hanno legame proteico minimo per consentire l'efficiente eluizione delle secrezioni assorbite. NA è una tecnica molto delicata, non invasiva che può essere eseguita su donatori di tutte le età. Inoltre, campionamento di serie, anche ogni pochi minuti, è possibile. NA è stata convalidata contro esistenti delle vie respiratorie superiore5 di tecniche di campionamento e campionamento ripetitivo ha permesso la generazione di dati cinetici seguendo la sfida delle vie respiratorie con allergene23,24,25, endotossina batterica26 e agonisti TLR di tipo virale (GAI, a. et al., manoscritto in preparazione). NA è stato utilizzato anche nei neonati per indagare la storia naturale di atopia27,28,29 e Bronchiolite virale30.
Microcampionamento bronchoscopic (BMS) è una procedura per la raccolta della FML nelle vie respiratorie inferiori che sono stata sviluppata da Olympus31,32,33. Purtroppo, questo sistema BMS è concesso in licenza solo in Giappone. Olympus fornire due sistemi BMS: uno con un poliestere idrossilati fibroso (FHPE) sonda34,35,36,37, e uno con un cotone sonda33,38, 39 , 40 , 41 , 42 , 43. un ostacolo principale è stato che la sonda BMS utilizzata in pazienti con asma causata contatto mucoso, sanguinamento, con la metà di tutti i campioni contaminati da sangue. Gli autori hanno concluso che non era fattibile per esempio MLF usando questo sistema BMS da airways periferici in pazienti di asma43.
In alternativa, abbiamo sviluppato utilizzando una morbida SAM che possono essere eseguite durante l'indagine bronchoscopic su basse vie respiratorie, anche a seguito di infezione sperimentale in soggetti asmatici con rhinovirus6BA. Il dispositivo di BA è costituito da: un catetere cavo esterno, un manipolo che sull'attivazione estrude il SAM e un filo di guida plastica centrale che ha il SAM sulla sua fine. Per quanto riguarda NA, BA kit sono fabbricati con materiali di grado medico utilizzando le camere sono pulite e sono privi di polvere e allergeni. Inoltre, i dispositivi sono marchiati CE e sono forniti di gamma-irradiati. La striscia di SAM è morbido, assorbente e ha wicking rapido per raccolta del campione. Ha anche un legame con le proteine minimo per consentire l'efficiente eluizione delle secrezioni assorbite. Il dispositivo può adattarsi attraverso il canale operativo di un broncoscopio e può essere utilizzato per rapidamente e con precisione assaggiare FML in siti specifici di interesse all'interno delle vie respiratorie. A differenza di BAL o BMS, BA non causare sanguinamento contatto o dopo la procedura ulteriore disagio per il paziente.
Un'attenta considerazione dovrebbe essere data al trattamento dei campioni di NA e BA. I campioni possono essere direttamente congelati e trasformati in lotti o possono essere elaborati immediatamente. Il tipo di elaborazione può essere adattato verso alcune applicazioni a valle, tra cui test immunodiagnostici per citochine, chemochine e immunoglobuline o eluizioni di virali, batteriche, e cellula ospite associato RNA. Vi presentiamo la raccolta clinica e laboratorio di tecniche di elaborazione associati con NA e BA come una guida per ricercatori clinici.

<table><tbody><tr><td>Nasosoppressione (adulto, larghezza 7 mm)</td><td>Hunt Developments</td><td>NSFL-FXI-11</td><td>Sono disponibili diverse misure per diversi gruppi di pazienti/età.</td></tr><tr><td>Sviluppi della caccia al broncoassorbimento</td><td></td><td>BSFL-FXI-11</td><td>Dimensione minima del canale del broncoscopio 2 mm; Lunghezza massima di lavoro 815 mm</td></tr><tr><td>Corning&nbsp; Costar&nbsp; Spin-X&nbsp; filtri per provette da centrifuga (senza membrana)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>CLS9301-1000EA</td><td></td></tr><tr><td>Corning&nbsp; Costar&nbsp; Spin-X&nbsp; filtri per provette da centrifuga (membrana da 0,22 um)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>CLS8160-24EA</td><td>Per la sterilizzazione di campioni a rischio di infezione.</td></tr><tr><td>Tampone per test (eluizione)</td><td>Millipore</td><td>AB-33k</td><td>Non elencato sul sito web di Millipore ma disponibile tramite richieste o società di forniture di laboratorio generiche, come Cedarlane. Contiene lo 0,05% di Tween-20 e l'1% di BSA.</td></tr><tr><td>NP-40 Tampone per lisi cellulare</td><td>Life Technologies</td><td>FNN0021</td><td>Aggiungere albumina sierica bovina all'1% (p/v). Può recuperare livelli di mediatore assoluto più elevati.</td></tr><tr><td>Tampone RLT (estrazione dell'RNA)</td><td>Qiagen</td><td>79216</td><td>Consente il recupero dell'RNA da campioni di nasosorpzione e broncoassorbimento.</td></tr><tr><td>Acido trifluoroacetico</td><td>Sigma Aldrich</td><td>302031-100ML-M</td><td>Per l'eluizione di campioni da utilizzare in applicazioni HPLC</td></tr><tr><td>Provette per microcentrifuga da 2,0 ml</td> Sono necessarie provette <td>Costar</td><td>3213</td><td>da 2 ml per i filtri per provette Spin-X, le tradizionali provette da 1,5 ml non si adattano a queste.</td></tr></tbody></table>

assorbimento di liquidi nasali e bronchiali: precisione campionamento della mucosa respiratoria umana e laboratorio di lavorazione dei campioni

Absorption of Nasal and Bronchial Fluids: Precision Sampling of the Human Respiratory Mucosa and Laboratory Processing of Samples

I metodi di assorbimento nasale (NA) e assorbimento bronchiale (BA) utilizzano matrici assorbenti sintetici (SAM) per assorbire il liquido di rivestimento mucoso (MLF) dell'apparato respiratorio umano. NA è una tecnica non invasiva che assorbe il liquido dal Turbinato inferiore e provoca disagio minimo. NA ha dato risultati riproducibili con la capacità di ripetere frequentemente il campionamento delle vie aeree superiori.
In confronto, metodi alternativi di campionamento la mucosa respiratoria, come aspirazione rinofaringeo (NPA) e scovolatura convenzionali, sono più invasivi e possono provocare una maggiore variabilità dei dati. Altri metodi hanno dei limiti, per esempio, biopsie e procedure bronchiale sono invasive, espettorato contiene molti morti e morendo le cellule e richiede la liquefazione, respiro esalato condensato (EBC) contiene acqua e saliva e campioni di lavaggio sono diluiti e variabile.
BA può essere eseguita attraverso il canale operativo di un broncoscopio in clinica. Campionamento è ben tollerato e può essere condotta a più siti nelle vie respiratorie. BA si traduce in campioni MLF essendo meno diluito rispetto a campioni di lavaggio broncoalveolare (BAL).
Questo articolo viene illustrato le tecniche di NA e BA, così come il laboratorio di lavorazione dei campioni risultanti, che può essere su misura per il biomarcatore a valle desiderato da misurare. Queste tecniche di assorbimento sono un'utile alternativa per le tecniche di campionamento convenzionali utilizzate nella ricerca clinica respiratoria.

NA è stata utilizzata in una serie di studi a facilmente e non invadente misura l'infiammazione della mucosa. Dopo la somministrazione dell'allergene al naso, livelli di prostaglandina-D2 (PGD2) possono essere osservati a salire e scendere in minuti (Figura 1), in linea con degranulazione delle cellule di albero (Thwaites et al., manoscritto in preparazione). Inoltre, mediatori di infiammazione di tipo II, quali IL-5 (Figura 2, ristampato con il permesso da 24), possono essere misurati nelle ore successive nasale allergene sfida23,24. Nell'infezione sperimentale di asmatici allergici e controlli sani, NA serviva a misurare un panel di mediatori, compreso interferone-gamma (IFN-γ), nel corso di 7 giorni (Figura 3, ristampato con il permesso da 6). Inoltre, nell'infezione naturale virus respiratorio sinciziale (RSV) degli infanti, NA dimostrato RSV per essere associato con i livelli elevati di citochine infiammatorie, quali IFN-γ, rispetto al non-RSV infanti con bronchiolite e controlli sani ( Figura 4, ristampato con il permesso di 30). Interessante, questa discriminazione tra non-RSV bronchiolitis e RSV non era significativa in pari tempo di campioni NPA (Figura 4).
BA è stato anche utilizzato durante l'infezione sperimentale di asmatici allergici con rhinovirus. Al giorno 4 dell'infezione del rhinovirus, livelli di IFN-γ, CXCL11, IL-10 e IL-5 sono stati elevati dal basale (Figura 5; A, B, C e D, rispettivamente). Inoltre, questa tecnica ha dimostrato i livelli elevati di IL-5 nelle vie respiratorie inferiori degli asmatici allergici durante l'infezione del rhinovirus, rispetto a controlli sani (Figura 5) (Figura 5 ristampato con il permesso da 6).
Questi risultati rappresentativi sono stati generati da campioni eluiti mediante tampone contenente 0.05% Tween-20 e 1% BSA (Vedi Tabella materiali).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56413/56413fig1.jpg"> Figura 1 : Generazione veloce e clearance di prostaglandina-D2 seguendo la sfida dell'allergene nasale. I livelli di prostaglandina-D2 (PGD2) misurati da eluati di assorbimento nasale in campioni di serie seguendo la sfida dell'allergene nasale con polline dell'erba Timothy (n = 5). Ogni riga rappresenta i dati da un individuo. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56413/56413fig1large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56413/56413fig2.jpg"> Figura 2 : Misurazione cinetica di IL-5 dopo la sfida dell'allergene nasale. Produzione di IL-5 in campioni seriali assorbimento nasale seguendo la sfida dell'allergene nasale. Ripetere i tre sono stati condotti studi di sfida di allergene, con i partecipanti (n = 19) che ricevono il placebo (blu), a bassa dose (10 mg) di prednisone orale (arancione), o prednisone orale della dose elevata (25 mg) (rosso) un'ora prima della somministrazione dell'allergene. Linee denotano media geometrica e barre di errore sono gli intervalli di confidenza del 95% di tutti i partecipanti. (Figura ristampato con il permesso dal Leaker et al., immunologia delle mucose, 2017). <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56413/56413fig2large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56413/56413fig3.jpg"> Figura 3 : Induzione di interferone-γ durante l'infezione del rhinovirus. Durante la sfida di infezione di adulti sani (n = 11, blu) e gli asmatici allergici (n = 28, rosso) con il rhinovirus-16, campionamento di assorbimento nasale è stato usato per misurare i livelli di interferone-γ (IFN-γ). I dati sono rappresentati come trame di spaghetti A) crudo degli individui e dei livelli di B) mediani con barre di errore che indica il range interquartile. (Figura ristampato con il permesso da Hansel et al. 6). <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56413/56413fig3large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56413/56413fig4.jpg"> Figura 4 : Nasosorption discrimina elevati interferone-γ associata con l'infezione RSV degli infanti. Assorbimento nasale e rinofaringeo aspirazione (NPA) sono stati usati per misurare i livelli di interferone-γ in infanti con il bronchiolitis connessi con l'infezione del virus respiratorio sinciziale (RSV) (rosso, n = 12), un agente patogeno respiratorio non-RSV (verde, n = 12) e sano controlli (blu, n = 9). I dati sono stati analizzati utilizzando un test di Kruskall-Wallis con Dunns correzione per i confronti multipli (* * *p&lt; 0,001). Linee denota valori mediani e barre di errore sono intervalli interquartile. (Figura per volta con il permesso di Thwaites et al. 30). <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56413/56413fig4large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56413/56413fig5.jpg"> Figura 5 : Mediatori infiammatori nei campioni di assorbimento bronchiale durante l'infezione del rhinovirus. Dopo l'infezione del rhinovirus-16 dei comandi sani (n = 10, blu) e volontari asmatici allergici (n = 23, rosso), assorbimento bronchiale è stato usato per misurare i livelli di A) IFN-γ, CXCL11 B), C) IL-10 e IL-5 D) al basale e il giorno 4 di infezione. Dati analizzati di Wilcoxon firmarono prova rigogliosa (campioni abbinati) e test di Mann-Whitney (campioni senza eguali). Figura ristampato con il permesso da Hansel et al. 6 <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56413/56413fig5large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>

Questo manoscritto descrive l'uso di tecniche di assorbimento nasali e bronchiali, in particolare utilizzando matrici assorbenti sintetici (SAM) per assaggiare il liquido di rivestimento mucoso (MLF) delle vie respiratorie superiori e inferiori. Questi metodi forniscono maggiore standardizzazione e tollerabilità rispetto alle tecniche respiratorie campionamento esistenti.

Assorbimento di liquidi nasali e bronchiali: precisione campionamento della Mucosa respiratoria umana e laboratorio di lavorazione dei campioni

The methods of nasal absorption (NA) and bronchial absorption (BA) use synthetic absorptive matrices (SAM) to absorb the mucosal lining fluid (MLF) of the ...

Oggi dimostreremo la tecnica della nasosorption, una forma di campionamento di precisione della mucosa che utilizza una matrice assorbente sintetica per assorbire il fluido di rivestimento della mucosa. Il campionatore per nasosaurizione è costituito da un'impugnatura e da un SAM in una crioprovetta sterile. I SAM sono costituiti da polimeri, fibre o schiuma, e sono appositamente selezionati per essere morbidi e assorbenti, con una rapida traspirazione per la raccolta dei campioni.I SAM hanno anche un legame proteico minimo, per consentire l'efficiente eluizione delle secrezioni assorbite. La nasosaurizione è una tecnica molto delicata e non invasiva che può essere eseguita su pazienti di tutte le età, compresi i neonati. Inoltre, è possibile il campionamento seriale, anche ogni pochi minuti.Quando si esegue la nasosorzione, è necessario prima lavarsi le mani e indossare i guanti, preferibilmente davanti al paziente. Per prima cosa viene ispezionata la cavità nasale. Si consiglia l'uso di una torcia frontale e che il medico utilizzi il pollice non dominante per ritrarre il naso del paziente per visualizzare la cavità nasale.Di solito non è necessario uno speculum nasale. Se guardi nella cavità nasale, le narici, o narici, non sono rotonde in sezione trasversale e vanno dritte all'indietro. Generalmente si vede il turbinato inferiore come un rigonfiamento, una rientranza sulla parete laterale della narice, con il setto nasale che forma la parete mediale liscia e piatta.Vogliamo campionare da questo turbinato inferiore poiché l'epitelio sottostante è un semplice epitelio ciliato delle vie respiratorie. Durante il prelievo, la nasosaurizione SAM viene fatta passare delicatamente lungo il lume, orientandolo in modo che sia piatto contro il turbinato inferiore. Quindi utilizzare il dito indice per premere il SAM sulla mucosa nasale.Questo può causare un leggero solletico con possibile lacrimazione degli occhi quando la FML viene assorbita. Generalmente utilizziamo un assorbimento temporizzato di 60 secondi. Il dispositivo di nasosaurizzazione viene quindi rimosso dalla narice, rimesso nel criotubo e può essere immediatamente conservato su ghiaccio e quindi congelato.In alternativa, è possibile procedere immediatamente all'eluizione della FML. La nasosaurizione è in fase di studio in una varietà di modelli di provocazione della mucosa nasale e anche in diverse malattie delle vie aeree. Tuttavia, questo metodo relativamente nuovo richiede ancora una convalida formale rispetto ad altri metodi di campionamento respiratorio.La tecnica del broncoassorbimento utilizza una matrice assorbente sintetica per campionare il fluido di rivestimento della mucosa del bronco. Il metodo viene eseguito da personale specializzato tramite un broncoscopio a fibre ottiche. Il dispositivo di broncoassorbimento è costituito da un catetere cavo esterno con un filo guida centrale in plastica.Questo ha un SAM all'estremità che può essere estruso all'attivazione del manipolo. Come la nasosaurizzazione, la striscia SAM è morbida e assorbente con una rapida traspirazione per la raccolta dei campioni. Ha anche un legame proteico minimo per consentire l'efficiente eluizione delle secrezioni assorbite.Prima di posizionare il dispositivo di broncoassorbimento nel broncoscopio, è consuetudine verificare che il SAM stia estrudendo e ritirandosi nuovamente nel catetere con facilità. Dimostreremo ora il metodo di broncoassorbimento utilizzando un simulatore di broncoscopia. Per prima cosa viene eseguita una broncoscopia standard, passando il broncoscopio lungo la trachea, nel bronco principale destro e al livello del bronco intermedio appena prossimale alla divisione dei lobi inferiori destri e medi destri.Una volta inserito in questo livello, vengono seguiti cinque passaggi. Uno, catetere giù. Inserire il catetere di broncoassorbimento attraverso il canale operatorio del broncoscopio fino a quando la punta bianca è visibile nelle vie aeree fino a un massimo di un centimetro distale all'estremità del broncoscopio.Tenere il broncoscopio e la punta del catetere al centro del lume delle vie aeree. Fare attenzione a ridurre al minimo il contatto tra la punta del catetere e la mucosa bronchiale per ridurre il rischio di danni alla mucosa. Due, SAM fuori.Premere l'impugnatura del dispositivo di broncoassorbimento in modo che la striscia SAM venga estrusa nel lume delle vie aeree del lobo medio destro o inferiore destro. Sotto visione diretta, piegare la punta del broncoscopio per assicurarsi che il SAM entri in contatto con il fluido di rivestimento della mucosa sulla parete delle vie aeree. Lasciare la striscia SAM all'interno delle vie aeree, piatta sulla parete della mucosa per 30 secondi.Tre, SAM in. In caso di visione diretta, ritrarre il SAM direttamente nel catetere. Durante la ritrazione, assicurarsi che la sonda SAM umida sia diritta.Se necessario, il catetere e la punta del broncoscopio possono essere riportati indietro per raddrizzare il SAM. In caso di difficoltà nell'estrarre il SAM, estrarre l'intero dispositivo con il SAM estruso dalle vie aeree. Quattro, catetere su.Estrarre l'intero catetere dal canale operatorio del broncoscopio. Cinque, tagliare SAM. Il SAM viene tagliato con forbici sterili, messo in una crioprovetta e deve essere immediatamente posto sul ghiaccio prima di essere congelato o eluito direttamente.Il seguente video mostra l'estrusione di un SAM nelle vie aeree di un paziente sottoposto a broncoscopia di ricerca. Il broncoassorbimento è attualmente in fase di studio in una varietà di diverse malattie polmonari. Ci auguriamo che questo metodo di campionamento di precisione della mucosa si riveli utile nell'iter diagnostico e nella stratificazione e nel monitoraggio dei pazienti.Elaborazione in laboratorio dopo nasosaurizione e broncoassorbimento. L'eluizione del fluido di rivestimento della mucosa dalla matrice assorbente sintetica. Oggi dimostreremo i principi generali dell'elaborazione dei campioni in laboratorio dopo le tecniche di campionamento non invasivo della mucosa di nasosorpzione e broncoassorbimento.In particolare, dimostreremo come eluire il campione di fluido di rivestimento della mucosa dalla matrice assorbente sintetica. Al momento della raccolta, i campioni devono essere posti su ghiaccio per il trasporto in laboratorio. I campioni possono essere elaborati immediatamente o possono essere inseriti direttamente nel congelatore nella provetta originale per l'eluizione in un secondo momento.Se viene eseguita l'elaborazione immediata, il campione può essere trasferito su ghiaccio al laboratorio nella sua provetta originale. Oppure il SAM può essere staccato e posto in un tampone di eluizione nel punto di raccolta e quindi successivamente trasferito su ghiaccio al laboratorio. I campioni possono rimanere sul ghiaccio in tampone o all'interno della provetta per diverse ore prima dell'elaborazione.Una fase di lavaggio prima della centrifugazione e della centrifugazione del SAM mira a ottimizzare la resa del campione. A tal fine, il SAM viene inserito in una provetta Eppendorf insieme all'involucro di estrazione desiderato. Il campione viene quindi miscelato su un miscelatore a vortice per 30 secondi per lavare il SAM dai fluidi e dalle biomolecole attaccati in modo lasco.Per garantire il recupero completo del campione, viene quindi eseguita l'eluizione di spin aggiungendo il SAM umido a un inserto di centrifuga all'interno della stessa provetta Eppendorf utilizzata per il lavaggio. Per questa procedura è necessario utilizzare una pinza pulita e sostituirla tra un campione e l'altro per evitare contaminazioni. Questo metodo utilizza la centrifugazione per estrarre il fluido dal SAM.Centrifughiamo campioni per 20 minuti a 16.000 g in una centrifuga raffreddata a quattro gradi Celsius. Il bugger di eluizione utilizzato sarà determinato dall'applicazione desiderata. Utilizziamo comunemente tampone per il saggio degli ammino contenente proteine o tampone per la lisi dell'RNA.È possibile utilizzare due tipi di filtro rotante. Il primo contiene solo una rete di plastica che tiene in posizione il SAM, consentendo la completa eluizione dei fluidi. In alternativa, se si lavora con materiali infettivi, è possibile utilizzare filtri rotanti con una dimensione dei pori di 0,2 micrometri.Questi filtri decontaminano i campioni infetti e sono adatti per campioni con sospetta infezione microbatterica. Se sono necessari tali filtri, è importante includere una fase di pre-incubazione in cui il tampone proteico viene lasciato in ammollo attraverso il filtro prima dell'aggiunta del campione. Questo passaggio riduce al minimo il legame dei mediatori al filtro mediante l'assorbimento di proteine aspecifiche.Di seguito è riportato un esempio di metodo utilizzato dal nostro laboratorio per il trattamento di nasosorpazione e broncoassorbimento di campioni che non richiedono una fase di decontaminazione, inclusi i patogeni di classe due. La prima fase, il SAM viene inserito in un Eppendorf contenente il tampone e il vortice appropriati per 30 secondi. Per la nasosaurizione utilizziamo in genere 300 microlitri di tampone e per il broncoassorbimento 100 microlitri.Nella seconda fase, il SAM viene rimosso utilizzando una pinza e inserito in una tazza del filtro a rete di plastica insieme al tampone utilizzato per lavare il SAM. Fase tre, il contenitore del filtro in rete di plastica contenente il SAM viene restituito all'Eppendorf originale. Fase quattro, l'Eppendorf contenente la coppa del filtro, il tampone e il SAM viene centrifugato per 20 minuti a 16.000 g a quattro gradi Celsius.Dopo la centrifugazione, la coppa del filtro contenente il SAM viene rimossa e smaltita. L'eluizione può quindi essere aliquotata e congelata per l'analisi in un secondo momento. Il campionamento di nasosaurizione è stato applicato a numerosi contesti di ricerca respiratoria clinica.Ciò include la misurazione dei mediatori infiammatori durante l'allergia nasale come la prostaglandina D2 e l'interleuchina 5. È importante sottolineare che in questi contesti di modello di sfida, il campionamento mediante nasosorpzione consente una frequente profilazione cinetica dei livelli di mediatore, in cui il campionamento può essere ripetuto ogni pochi minuti. La nasosaurizione è stata utilizzata anche durante una provocazione di infezione da rinovirus in soggetti sani e asmatici allergici, dove la nasosaurizione è stata ripetuta quotidianamente durante il periodo di studio.L'uso della nasosaurizione nello studio ha permesso una caratterizzazione sensibile delle risposte dell'interferone all'infezione da rinovirus. Infine, abbiamo utilizzato il campionamento di nasosorpzione per studiare i neonati con bronchiolite. In questo studio l'infezione da virus respiratorio sinciziale è stata associata a livelli più elevati di mediatori infiammatori, come l'interferone gamma.È importante sottolineare che il campionamento con nasosorpzione consente l'inclusione di un gruppo di controllo sano negli studi sui neonati. Il broncoassorbimento è stato utilizzato anche nello studio di provocazione del rinovirus in soggetti sani e asmatici allergici. Questo studio ha dimostrato aumenti significativi dei mediatori infiammatori interferone gamma, ITAC, IL-10 e IL-5 nelle vie aeree inferiori durante l'infezione da rinovirus.L'inclusione di questa tecnica negli studi delle vie aeree inferiori crea la possibilità di misurare i livelli di mediatori, che potrebbero non essere rilevabili con metodi convenzionali come il lavaggio broncoalveolare. In conclusione, il fluido di rivestimento della mucosa può essere ottenuto in modo non invasivo e ha un potenziale entusiasmante per misurare le risposte infiammatorie nell'infezione e nell'infiammazione. I metodi di eluizione devono essere adattati in base alla natura dei campioni e ai parametri da misurare.In particolare, la MLF può essere utilizzata per misurare le citochine e le chemochine delle mucose, le infezioni virali, la carica virale, le infezioni batteriche e fungine, il microbioma e gli anticorpi delle mucose. Infine, i metodi di campionamento ed eluizione della mucosa richiederanno uno sviluppo su misura e un'attenta convalida per i singoli progetti.

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Assorbimento di liquidi nasali e bronchiali: precisione campionamento della Mucosa respiratoria umana e laboratorio di lavorazione dei campioni (Video) | JoVE Journal

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