Assorbimento di liquidi nasali e bronchiali: precisione campionamento della Mucosa respiratoria umana e laboratorio di lavorazione dei campioni

Oggi dimostreremo la tecnica della nasosorption, una forma di campionamento di precisione della mucosa che utilizza una matrice assorbente sintetica per assorbire il fluido di rivestimento della mucosa. Il campionatore per nasosaurizione è costituito da un'impugnatura e da un SAM in una crioprovetta sterile. I SAM sono costituiti da polimeri, fibre o schiuma, e sono appositamente selezionati per essere morbidi e assorbenti, con una rapida traspirazione per la raccolta dei campioni.

I SAM hanno anche un legame proteico minimo, per consentire l'efficiente eluizione delle secrezioni assorbite. La nasosaurizione è una tecnica molto delicata e non invasiva che può essere eseguita su pazienti di tutte le età, compresi i neonati. Inoltre, è possibile il campionamento seriale, anche ogni pochi minuti.

Quando si esegue la nasosorzione, è necessario prima lavarsi le mani e indossare i guanti, preferibilmente davanti al paziente. Per prima cosa viene ispezionata la cavità nasale. Si consiglia l'uso di una torcia frontale e che il medico utilizzi il pollice non dominante per ritrarre il naso del paziente per visualizzare la cavità nasale.

Di solito non è necessario uno speculum nasale. Se guardi nella cavità nasale, le narici, o narici, non sono rotonde in sezione trasversale e vanno dritte all'indietro. Generalmente si vede il turbinato inferiore come un rigonfiamento, una rientranza sulla parete laterale della narice, con il setto nasale che forma la parete mediale liscia e piatta.

Vogliamo campionare da questo turbinato inferiore poiché l'epitelio sottostante è un semplice epitelio ciliato delle vie respiratorie. Durante il prelievo, la nasosaurizione SAM viene fatta passare delicatamente lungo il lume, orientandolo in modo che sia piatto contro il turbinato inferiore. Quindi utilizzare il dito indice per premere il SAM sulla mucosa nasale.

Questo può causare un leggero solletico con possibile lacrimazione degli occhi quando la FML viene assorbita. Generalmente utilizziamo un assorbimento temporizzato di 60 secondi. Il dispositivo di nasosaurizzazione viene quindi rimosso dalla narice, rimesso nel criotubo e può essere immediatamente conservato su ghiaccio e quindi congelato.

In alternativa, è possibile procedere immediatamente all'eluizione della FML. La nasosaurizione è in fase di studio in una varietà di modelli di provocazione della mucosa nasale e anche in diverse malattie delle vie aeree. Tuttavia, questo metodo relativamente nuovo richiede ancora una convalida formale rispetto ad altri metodi di campionamento respiratorio.

La tecnica del broncoassorbimento utilizza una matrice assorbente sintetica per campionare il fluido di rivestimento della mucosa del bronco. Il metodo viene eseguito da personale specializzato tramite un broncoscopio a fibre ottiche. Il dispositivo di broncoassorbimento è costituito da un catetere cavo esterno con un filo guida centrale in plastica.

Questo ha un SAM all'estremità che può essere estruso all'attivazione del manipolo. Come la nasosaurizzazione, la striscia SAM è morbida e assorbente con una rapida traspirazione per la raccolta dei campioni. Ha anche un legame proteico minimo per consentire l'efficiente eluizione delle secrezioni assorbite.

Prima di posizionare il dispositivo di broncoassorbimento nel broncoscopio, è consuetudine verificare che il SAM stia estrudendo e ritirandosi nuovamente nel catetere con facilità. Dimostreremo ora il metodo di broncoassorbimento utilizzando un simulatore di broncoscopia. Per prima cosa viene eseguita una broncoscopia standard, passando il broncoscopio lungo la trachea, nel bronco principale destro e al livello del bronco intermedio appena prossimale alla divisione dei lobi inferiori destri e medi destri.

Una volta inserito in questo livello, vengono seguiti cinque passaggi. Uno, catetere giù. Inserire il catetere di broncoassorbimento attraverso il canale operatorio del broncoscopio fino a quando la punta bianca è visibile nelle vie aeree fino a un massimo di un centimetro distale all'estremità del broncoscopio.

Tenere il broncoscopio e la punta del catetere al centro del lume delle vie aeree. Fare attenzione a ridurre al minimo il contatto tra la punta del catetere e la mucosa bronchiale per ridurre il rischio di danni alla mucosa. Due, SAM fuori.

Premere l'impugnatura del dispositivo di broncoassorbimento in modo che la striscia SAM venga estrusa nel lume delle vie aeree del lobo medio destro o inferiore destro. Sotto visione diretta, piegare la punta del broncoscopio per assicurarsi che il SAM entri in contatto con il fluido di rivestimento della mucosa sulla parete delle vie aeree. Lasciare la striscia SAM all'interno delle vie aeree, piatta sulla parete della mucosa per 30 secondi.

Tre, SAM in. In caso di visione diretta, ritrarre il SAM direttamente nel catetere. Durante la ritrazione, assicurarsi che la sonda SAM umida sia diritta.

Se necessario, il catetere e la punta del broncoscopio possono essere riportati indietro per raddrizzare il SAM. In caso di difficoltà nell'estrarre il SAM, estrarre l'intero dispositivo con il SAM estruso dalle vie aeree. Quattro, catetere su.

Estrarre l'intero catetere dal canale operatorio del broncoscopio. Cinque, tagliare SAM. Il SAM viene tagliato con forbici sterili, messo in una crioprovetta e deve essere immediatamente posto sul ghiaccio prima di essere congelato o eluito direttamente.

Il seguente video mostra l'estrusione di un SAM nelle vie aeree di un paziente sottoposto a broncoscopia di ricerca. Il broncoassorbimento è attualmente in fase di studio in una varietà di diverse malattie polmonari. Ci auguriamo che questo metodo di campionamento di precisione della mucosa si riveli utile nell'iter diagnostico e nella stratificazione e nel monitoraggio dei pazienti.

Elaborazione in laboratorio dopo nasosaurizione e broncoassorbimento. L'eluizione del fluido di rivestimento della mucosa dalla matrice assorbente sintetica. Oggi dimostreremo i principi generali dell'elaborazione dei campioni in laboratorio dopo le tecniche di campionamento non invasivo della mucosa di nasosorpzione e broncoassorbimento.

In particolare, dimostreremo come eluire il campione di fluido di rivestimento della mucosa dalla matrice assorbente sintetica. Al momento della raccolta, i campioni devono essere posti su ghiaccio per il trasporto in laboratorio. I campioni possono essere elaborati immediatamente o possono essere inseriti direttamente nel congelatore nella provetta originale per l'eluizione in un secondo momento.

Se viene eseguita l'elaborazione immediata, il campione può essere trasferito su ghiaccio al laboratorio nella sua provetta originale. Oppure il SAM può essere staccato e posto in un tampone di eluizione nel punto di raccolta e quindi successivamente trasferito su ghiaccio al laboratorio. I campioni possono rimanere sul ghiaccio in tampone o all'interno della provetta per diverse ore prima dell'elaborazione.

Una fase di lavaggio prima della centrifugazione e della centrifugazione del SAM mira a ottimizzare la resa del campione. A tal fine, il SAM viene inserito in una provetta Eppendorf insieme all'involucro di estrazione desiderato. Il campione viene quindi miscelato su un miscelatore a vortice per 30 secondi per lavare il SAM dai fluidi e dalle biomolecole attaccati in modo lasco.

Per garantire il recupero completo del campione, viene quindi eseguita l'eluizione di spin aggiungendo il SAM umido a un inserto di centrifuga all'interno della stessa provetta Eppendorf utilizzata per il lavaggio. Per questa procedura è necessario utilizzare una pinza pulita e sostituirla tra un campione e l'altro per evitare contaminazioni. Questo metodo utilizza la centrifugazione per estrarre il fluido dal SAM.

Centrifughiamo campioni per 20 minuti a 16.000 g in una centrifuga raffreddata a quattro gradi Celsius. Il bugger di eluizione utilizzato sarà determinato dall'applicazione desiderata. Utilizziamo comunemente tampone per il saggio degli ammino contenente proteine o tampone per la lisi dell'RNA.

È possibile utilizzare due tipi di filtro rotante. Il primo contiene solo una rete di plastica che tiene in posizione il SAM, consentendo la completa eluizione dei fluidi. In alternativa, se si lavora con materiali infettivi, è possibile utilizzare filtri rotanti con una dimensione dei pori di 0,2 micrometri.

Questi filtri decontaminano i campioni infetti e sono adatti per campioni con sospetta infezione microbatterica. Se sono necessari tali filtri, è importante includere una fase di pre-incubazione in cui il tampone proteico viene lasciato in ammollo attraverso il filtro prima dell'aggiunta del campione. Questo passaggio riduce al minimo il legame dei mediatori al filtro mediante l'assorbimento di proteine aspecifiche.

Di seguito è riportato un esempio di metodo utilizzato dal nostro laboratorio per il trattamento di nasosorpazione e broncoassorbimento di campioni che non richiedono una fase di decontaminazione, inclusi i patogeni di classe due. La prima fase, il SAM viene inserito in un Eppendorf contenente il tampone e il vortice appropriati per 30 secondi. Per la nasosaurizione utilizziamo in genere 300 microlitri di tampone e per il broncoassorbimento 100 microlitri.

Nella seconda fase, il SAM viene rimosso utilizzando una pinza e inserito in una tazza del filtro a rete di plastica insieme al tampone utilizzato per lavare il SAM. Fase tre, il contenitore del filtro in rete di plastica contenente il SAM viene restituito all'Eppendorf originale. Fase quattro, l'Eppendorf contenente la coppa del filtro, il tampone e il SAM viene centrifugato per 20 minuti a 16.000 g a quattro gradi Celsius.

Dopo la centrifugazione, la coppa del filtro contenente il SAM viene rimossa e smaltita. L'eluizione può quindi essere aliquotata e congelata per l'analisi in un secondo momento. Il campionamento di nasosaurizione è stato applicato a numerosi contesti di ricerca respiratoria clinica.

Ciò include la misurazione dei mediatori infiammatori durante l'allergia nasale come la prostaglandina D2 e l'interleuchina 5. È importante sottolineare che in questi contesti di modello di sfida, il campionamento mediante nasosorpzione consente una frequente profilazione cinetica dei livelli di mediatore, in cui il campionamento può essere ripetuto ogni pochi minuti. La nasosaurizione è stata utilizzata anche durante una provocazione di infezione da rinovirus in soggetti sani e asmatici allergici, dove la nasosaurizione è stata ripetuta quotidianamente durante il periodo di studio.

L'uso della nasosaurizione nello studio ha permesso una caratterizzazione sensibile delle risposte dell'interferone all'infezione da rinovirus. Infine, abbiamo utilizzato il campionamento di nasosorpzione per studiare i neonati con bronchiolite. In questo studio l'infezione da virus respiratorio sinciziale è stata associata a livelli più elevati di mediatori infiammatori, come l'interferone gamma.

È importante sottolineare che il campionamento con nasosorpzione consente l'inclusione di un gruppo di controllo sano negli studi sui neonati. Il broncoassorbimento è stato utilizzato anche nello studio di provocazione del rinovirus in soggetti sani e asmatici allergici. Questo studio ha dimostrato aumenti significativi dei mediatori infiammatori interferone gamma, ITAC, IL-10 e IL-5 nelle vie aeree inferiori durante l'infezione da rinovirus.

L'inclusione di questa tecnica negli studi delle vie aeree inferiori crea la possibilità di misurare i livelli di mediatori, che potrebbero non essere rilevabili con metodi convenzionali come il lavaggio broncoalveolare. In conclusione, il fluido di rivestimento della mucosa può essere ottenuto in modo non invasivo e ha un potenziale entusiasmante per misurare le risposte infiammatorie nell'infezione e nell'infiammazione. I metodi di eluizione devono essere adattati in base alla natura dei campioni e ai parametri da misurare.

In particolare, la MLF può essere utilizzata per misurare le citochine e le chemochine delle mucose, le infezioni virali, la carica virale, le infezioni batteriche e fungine, il microbioma e gli anticorpi delle mucose. Infine, i metodi di campionamento ed eluizione della mucosa richiederanno uno sviluppo su misura e un'attenta convalida per i singoli progetti.