Nanofibre ECM proteine ​​e Nanostrutture Engineered Uso Assembly-Surface avviato

L'obiettivo generale di questa procedura è quello di ingegnerizzare nano fibre indipendenti, nanostrutture e matrici 2D da proteine della matrice extracellulare singola o multipla utilizzando l'assemblaggio avviato dalla superficie. Ciò si ottiene preparando prima i timbri in polidimetilsoano o PDMS versando il prepolimero PDMS su uno stampo master modellato topograficamente e lasciandolo polimerizzare. Il secondo passo consiste nel ritagliare i timbri PDMS polimerizzati e rivestirli con una soluzione contenente le proteine della matrice extracellulare desiderate.

Successivamente, i timbri vengono lavati, asciugati e stampati a micro contatto su un poli-N iso propilacrilammide o su un vetrino per tubi rivestito in PAM. Il passaggio finale consiste nell'idratare il vetrino coprioggetto con acqua deionizzata calda a 40 gradi Celsius e lasciarlo raffreddare gradualmente la riduzione della soluzione. Una temperatura inferiore a circa 32 gradi Celsius innesca la dissoluzione dello strato PAM del tubo termicamente sensibile e il rilascio di nano fibre proteiche assemblate o nano strutture.

In definitiva, le nanofibre e le nanostrutture assemblate sono indipendenti in soluzione, come confermato dalla microscopia a contrasto di fase e/o a fluorescenza, e possono essere utilizzate in ulteriori applicazioni come gli scaffold di ingegneria tissutale. Il vantaggio principale di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti come la separazione facciale o l'elettrofilatura, è la capacità di ingegnerizzare nano fibre proteiche ECM utilizzando una tecnica che imita realmente il modo in cui le cellule normalmente costruiscono le fibre ECM in vivo. La tecnica di assemblaggio avviato in superficie presenta una serie di vantaggi unici, tra cui la capacità di controllare la composizione delle proteine, la morfologia delle fibre e l'architettura dell'impalcatura.

Inoltre, siamo in grado di ingegnerizzare nanofibre proteiche ECM da proteine della matrice extracellulare come il laminato di fibra nin e il collagene di tipo quattro, che si è rivelato difficile utilizzando altri tipi di metodi. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo dell'ingegneria tissutale, consentendo ai ricercatori di sviluppare costrutti con segnali fisici e chimici specifici e ben definiti per dirigere una varietà di comportamenti cellulari come l'adesione e la differenziazione. Se non conosci questa tecnica, dovresti ricordarti di ispezionare continuamente la qualità dei tuoi steli e la fedeltà dei modelli stampati a micro contatto.

Questo è essenziale per ottenere un corretto assemblaggio delle nanofibre e delle nanostrutture ECM. Per iniziare questa procedura, preparare il poli dimetilsoano o prepolimero PDMS combinando la base elastomerica e l'agente indurente in un rapporto peso per peso di 10 a uno, in genere vengono utilizzati 80 grammi di base e otto grammi di agente indurente per garantire che ci sia un PDMS sufficiente per coprire lo stampo master in una miscela di strati spessi un centimetro e DGA il PDMS utilizzando un miscelatore centripeto impostato sulla seguente miscela a 2000 giri/min per due minuti, DGA a 2000 giri/min per due minuti. Abbastanza povero.

Pre polimero PDMS sopra lo stampo master per formare uno strato spesso un centimetro qui, il PDMS cuocendo a 65 gradi Celsius per quattro ore. Una volta indurito, utilizzare un bisturi per ritagliare la regione contenente il motivo per formare il timbro PDMS. Per distinguere il lato della funzione dal retro del timbro PDMS.

Ritaglia una tacca da uno degli angoli sul retro del timbro. Iniziare questa procedura pulendo i vetrini di vetro di 25 millimetri di diametro, sonicare i vetrini di copertura in etanolo al 95% per un'ora, quindi asciugarli in un forno a 65 gradi Celsius. Quindi, preparare la soluzione di acrilammide o piam poli e isopropilico sciogliere il piam in un butanolo a una concentrazione del 10%Centrare un vetrino di copertura pulito sul mandrino a vuoto dello spin coer e pipettare 200 microlitri della soluzione di Pam per tubi sulla superficie del vetro per coprire completamente la superficie.

Centrifugare il vetrino coprioggetto a 6.000 giri/min per un minuto. Pulire i timbri PDMS mediante sonicazione in etanolo al 50% per 30 minuti, quindi essiccarli sotto un flusso di essiccazione ad azoto e tutti i passaggi successivi devono essere eseguiti in una cabina di biosicurezza per mantenere la sterilità per le applicazioni in cui la matrice extracellulare o le nanostrutture ECM verranno utilizzate con le cellule. La fase di micro stampa a contatto è l'aspetto più difficile di questa procedura.

È importante ispezionare i timbri PDMS per eventuali difetti visibili prima dell'uso. Inoltre, non utilizzare una soluzione proteica più vecchia di due settimane Luogo. Il coperchio rivestito PIAM scivola all'interno di una piastra di Petri chiusa e sterilizza utilizzando l'esposizione ai raggi UV.

Sono sufficienti 45 minuti sotto la luce UV in una cabina di biosicurezza. Rivestire la superficie del modello di ciascun timbro PDMS con 200 microlitri di soluzione proteica. La fibronectina o FN viene utilizzata qui a una concentrazione di 50 microgrammi per millilitro in acqua distillata sterile.

Incubare per un'ora a temperatura ambiente, dopo un'ora lavare i timbri PDMS e l'acqua distillata per rimuovere le proteine in eccesso e asciugare accuratamente sotto un getto di azoto. È importante rimuovere completamente l'acqua per evitare la dissoluzione prematura del tubo. Rivestimento in pam sul vetrino coprioggetto e trasferimento improprio delle proteine.

Se necessario, eseguire la stampa a micro contatto posizionando il lato caratteristico del timbro PDMS a contatto con il vetrino coprioggetti rivestito in PAM per tubi. Usa una pinza per picchiettare leggermente sul retro dei timbri per rimuovere eventuali bolle d'aria e garantire un contatto uniforme dopo cinque minuti. Staccare il timbro PDMS dal vetrino coprioggetto.

A questo punto. A seconda dello studio, è possibile modellare ulteriori proteine ECM per creare strutture più complesse e multicomponente. Una volta stampato il modello ECM, posizionare il vetrino coprioggetto rivestito in PAM in una piastra di Petri da 35 millimetri e ispezionare la fedeltà del modello utilizzando la microscopia a contrasto di fase.

A seconda del modello, potrebbe essere necessaria una telecamera CCD per risolvere le caratteristiche del modello. La microscopia a fluorescenza può essere utilizzata anche per ispezionare il pattern, a condizione che le proteine della ECM siano marcate in fluorescenza. Dopo aver verificato la fedeltà del modello, aggiungere tre millilitri di acqua distillata a 40 gradi Celsius alla capsula di Petri e lasciare che l'acqua si raffreddi gradualmente per la dissoluzione del tubo.

Lo strato PAM e il rilascio dei pattern proteici della ECM possono essere monitorati utilizzando la microscopia a contrasto di fase. In genere, per garantire che le nanostrutture proteiche della MEC siano state rilasciate, l'acqua viene raffreddata a temperatura ambiente ben al di sotto della temperatura critica inferiore della soluzione del tubo, pam, che è di 32 gradi Celsius. Se l'applicazione non consente l'uso di tecniche ottiche, il rilascio può essere monitorato misurando la temperatura della soluzione.

Le nano fibre e altre nano strutture galleggeranno nell'acqua dopo il rilascio dello strato di PAM del tubo. Per ulteriori applicazioni, i nano tessuti e altre nanostrutture devono essere manipolati, ma l'approccio esatto dipenderà dall'obiettivo sperimentale. Qui vengono presentati risultati rappresentativi per dimostrare che l'assemblaggio avviato in superficie o SIA è in grado di ingegnerizzare nanofibre proteiche ECM con un controllo preciso sulle dimensioni delle fibre.

Una serie di rettangoli di fibronectina, di 50 micrometri di lunghezza e 20 micrometri di larghezza, sono stati modellati su un vetrino coprioggetti rivestito di piam, l'aggiunta di 40 gradi Celsius di acqua deionizzata e il successivo raffreddamento al di sotto della soluzione critica inferiore. La temperatura del piam ha innescato la dissoluzione del piam e il rilascio delle nanofibre di fibroina al momento del rilascio. Le fibre si contraevano perché erano sottoposte a una precompressione intrinseca.

Quando sono state modellate sulla superficie del piam, l'analisi di Alice delle dimensioni della nanofibra di fibronectina prima del rilascio ha rivelato che erano mono disperse con una lunghezza media di 50,19 più o meno 0,49 micrometri e una larghezza media di 19,98 più o meno 0,17 micrometri. Al momento del rilascio, le nanofibre si sono contratte in modo apprezzabile, ma sono rimaste monodisperse, con una lunghezza media di 14,15 più o meno 0,92 micrometri e una larghezza media di 2,65 più o meno 0,32 micrometri. La microscopia a forza atomica ha fornito una prospettiva a risoluzione più elevata dei cambiamenti dimensionali delle fibre associati al processo di rilascio di SIA.

In particolare, le fibre pre-rilascio avevano uno spessore uniforme di circa cinque nanometri, mentre le fibre post-rilascio avevano uno spessore dell'ordine di diverse centinaia di nanometri, mentre la lunghezza e la larghezza diminuivano. Utilizzando il processo SIA, è possibile ingegnerizzare una varietà di nanostrutture proteiche della ECM con dimensioni, forma e composizione regolabili. Ad esempio, le nanofibre di fibronectina inizialmente di 20 micrometri di larghezza e un centimetro di lunghezza sono state modellate su un tubo.

Vetrino coprioggetti rivestito in PAM sul raffreddamento e sul tubo. Dissoluzione di Pam, le nano fibre sono state rilasciate formando lunghi fili con una larghezza ridotta di circa tre micrometri. Inoltre, poiché il modello è definito dalla topografia della superficie del timbro PDMS utilizzato per la stampa a micro contatto, è possibile ingegnerizzare complesse nanostrutture proteiche ECM come prova di concetto.

Sono state create stelle di fibroina a più braccia. Il rilascio termico ha provocato la contrazione dei bracci, ma non della regione centrale della stella dove i bracci si sono uniti. La SIA funziona anche con altre proteine della ECM come il laminato o la LN e più proteine della ECM possono essere incorporate nella stessa struttura.

In questo esempio, linee ortogonali interconnesse, larghe 20 micrometri di fibronectina mostrate in rosso e linee larghe 50 micrometri di laminina mostrate in verde integrate in un nano tessuto 2D sono state modellate e poi rilasciate al momento del rilascio entrambi i tipi di nano fibre contratte, ma l'interconnettività complessiva e la struttura reticolare quadrata sono state mantenute. Questi risultati dimostrano che la SIA può essere utilizzata per progettare materiali ECM con una varietà di composizioni e strutture. Infine, vengono mostrati alcuni casi di SIA fallita di nano fibre ECM.

Una causa è il rilascio improprio di un pattern incompleto a causa dello scarso trasferimento della proteina ECM sulla superficie del piam. Durante la stampa a micro contatto, la presenza di fori, bordi irregolari e altri difetti creerà nano fibre e nanostrutture incomplete e soggette a rotture e frammentazioni al momento del rilascio. La rapida dissoluzione del PAM del tubo può anche causare una scarsa fedeltà del modello dopo il rilascio.

Ad esempio, utilizzando acqua a 20 gradi Celsius, una temperatura già inferiore alla soluzione critica inferiore. La temperatura del piam farà sì che il piam si gonfi e si dissolva rapidamente. Ciò può causare l'arretramento e la rottura delle nanofibre, come illustrato nell'immagine 32, e formare configurazioni casuali non organizzate, come illustrato nell'immagine di 52 secondi.

Prima di iniziare questa procedura, le condizioni del PDMS verificano la presenza di difetti e si assicurano anche che tutte le superfici siano prive di polvere. In caso contrario, impedirà il corretto trasferimento delle proteine e porterà a un cattivo assemblaggio delle strutture A CM. Quindi, seguendo questa procedura, le nanofibre o nanostrutture di rilascio possono essere utilizzate per fare una serie di cose come analizzare le proprietà meccaniche delle fibre proteiche o utilizzate come scaffold per l'ingegneria tissutale.

Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come progettare nanofibre e nanostrutture proteiche ECM con composizione, geometria e architettura regolabili. In particolare, si capirà come stampare a micro contatto i modelli di proteine ECM su vetrini di vetro rivestiti di pitone, e quindi innescare termicamente la dissoluzione della superficie per assemblare le strutture ECM.