Name: Formazione di strutture biomolecolari ordinate dalla Self-assemblaggio di piccoli peptidi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-11-21T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 26 s
Description: Scopri il metodo di auto-assemblaggio per creare collane biomolecolari usando peptidi commerciali come difenilalanina. Questa tecnica permette di generare strutture complesse per studi di biochimica e biologia strutturale.

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Questo lavoro è stato supportato dal internazionali Marie Curie per il reinserimento Grant e dalla Fondazione tedesca-Israele. Riconosciamo Mr. Yair Razvag per l&#39;analisi AFM.

1. Auto-assemblaggio di Homoaromatic dipeptidi <ol><li> Pesare il peptide desiderato nella sua forma liofilizzata (es. NH 2-Phe-Phe-OH, Boc-Phe-Phe-COOH) e preparare una soluzione madre sciogliendo il peptide in 1,1,1,3,3,3-esafluoro -2-propanolo (HFP) alla concentrazione appropriata (ad esempio 100 mg / ml di NH 2-Phe-Phe-OH e Boc-Phe-Phe-COOH) 7,17,46. </li><li> Mescolare la soluzione con vortex e posto in panchina fino a che il peptide è completamente sciolto e la soluzione sembra chiaro (pochi minuti). </li><li> Diluire la soluzione peptide magazzino, con un solvente adatto, per la concentrazione appropriata (ad esempio 2 mg / ml di NH 2-Phe-Phe-OH in acqua distillata tripla (TDW) per la formazione di nanotubi; aggiungendo 2 ml di peptide soluzione stock da 98 microlitri TDW, 5 mg / ml di Boc-Phe-Phe-COOH in etanolo per la formazione di strutture sferiche). </li><li> Mantenere la soluzione a temperatura ambiente per 24hr. </li><li> Per evitare qualsiasi preaggregation, preparare le soluzioni madre fresche per ogni esperimento. </li></ol> 2. Coassembly of Two Homoaromatic dipeptidi <ol><li> Preparare una soluzione di etanolo al 50% mescolando volumi uguali di TDW e etanolo assoluto. Utilizzare agitare per miscelare le due soluzioni. </li><li> Pesare 2 mg di peptide NH 2-Phe-Phe-OH e 1 mg del peptide Boc-Phe-Phe-OH. Sciogliere ciascun peptide in HFP ad una concentrazione di 100 mg / ml. </li><li> Mescolare i peptidi soluzioni madre con vortex e metterli in panchina fino a quando i peptidi sono completamente sciolti e le soluzioni sembrano chiare. </li><li> Frullare i peptidi soluzioni madre per il rapporto desiderato. In questo esperimento si fondono 10 ml di peptide NH 2-Phe-Phe-OH con 6 ml di peptide Boc-Phe-Phe-OH (in un rapporto finale di 05:03 rispettivamente). A causa della elevata volatilità del solvente HFP, si raccomanda di preparare una grande quantità di questa soluzione madre (almst 10 microlitri). </li><li> Usa vortex per miscelare la soluzione stock peptidi misti. </li><li> Diluire la soluzione stock peptidi miscelato con il 50% di etanolo alla concentrazione finale desiderata. In questo esperimento, in modo da ottenere una concentrazione finale di 5 mg / ml di NH 2-Phe-Phe-OH e 3 mg / ml di Boc-Phe-Phe-OH, rispettivamente, aggiungere 8 microlitri della soluzione madre peptidi miscelati a 92 microlitri della soluzione di etanolo al 50%. Utilizzare una pipetta per mescolare delicatamente la soluzione. </li><li> Conservare la soluzione a temperatura ambiente per 24 ore. </li><li> Va notato che a causa della natura altamente volatile del solvente, gli esperimenti sono sensibili a piccoli cambiamenti nella concentrazione dei peptidi. Pertanto, le soluzioni di archivi freschi dovrebbero essere preparati per ogni esperimento. </li></ol> 3. Caratterizzazione del Sé assemblato strutture con microscopia elettronica a scansione (SEM) <ol><li> Dopo 24 ore di incubazione, applicare una goccia 10 ml della soluzione di peptidi su una baia di vetroslittamento r e asciugare a temperatura ambiente. </li><li> Coat campione sul vetro con un sottile strato di oro (alcuni nanometri) utilizzando un dispositivo di rivestimento a polverizzazione per 90 sec. </li><li> Immagine assemblee utilizzando SEM operante a 10-20 kV. </li></ol> 4. Caratterizzazione del Sé assemblato strutture con microscopia elettronica a trasmissione (TEM) <ol><li> Una goccia 10 ml della soluzione di peptidi su una griglia di rame 200 mesh rivestito con carbonio e stabilizzato da un supporto film polimerico. </li><li> Dopo 1 min rimuovere il liquido in eccesso con carta da filtro. </li><li> Preparare una soluzione di 2% acetato di uranile in TDW. Filtrare la soluzione con unità filtro 0,22 micron. </li><li> Per macchiare il campione (colorazione negativa), una goccia di soluzione di acetato di uranile 10 microlitri sulla griglia. </li><li> Dopo 30 sec rimuovere il liquido in eccesso con carta da filtro. Va notato che sebbene colorazione negativa migliora il contrasto delle immagini, non è essenziale in tutti i casi. </li><li> Immagine del campione su °e griglia TEM operando a 120 kV. </li></ol> 5. Caratterizzazione tridimensionale delle Assemblee dalla microscopia a forza atomica (AFM) <ol><li> Preparare un campione per l&#39;analisi AFM utilizzando la procedura descritta nel paragrafo 3.1. </li><li> Analizzare il campione sul vetro con uno strumento AFM lavora in modalità AC. Utilizzare cantilever silicio con costante elastica 3 N / m ed una frequenza di risonanza di 75 kHz. </li><li> Inizia con un&#39;analisi un&#39;ampia area di rete, al fine di trovare la struttura desiderata. Poi concentrarsi su una specifica area più piccola e la scansione (il formato di scansione è stata del 2,5 micron x 2.5 micron per l&#39;immagine incluso in questo manoscritto). </li></ol> 6. Caratterizzazione della struttura secondaria da FT-IR <ol><li> Applicare una goccia 30 ml della soluzione di peptidi ad una finestra CaF 2. </li><li> Lasciare che la soluzione per asciugare a temperatura ambiente. </li><li> L&#39;adsorbimento di acqua nello spettro IR è di 1650 cm-1.Questo picco è al centro della banda ammide I del legame peptidico. E &#39;anche un picco tipico per strutture α-elica di peptidi e proteine ​​47. Per superare questo problema ed evitare il segnale di acqua, uno scambio idrogeno-a-deuterio deve essere eseguita. Mettere una goccia di ossido di deuterio (D 2 O) sul campione peptide essiccato. Il calo dovrebbe essere sufficiente a coprire completamente i deposito peptide sulla finestra. </li><li> Lasciare il campione a secco sotto vuoto. </li><li> Ripetere i punti 6.3 e 6.4 2x per garantire lo scambio massimo idrogeno-to-deuterio. Salvare il campione sotto vuoto fino alla sua analisi. </li><li> Registrare gli spettri FT-IR utilizzando un triglicina solfato di deuterio (DTGS) rivelatore. Il sistema FT-IR comprende un generatore di gas di lavaggio, al fine di impedire all&#39;umidità nelle frazioni del campione. Per i campioni di piccoli peptidi, è preferibile eseguire la scansione del campione 2.000 x con una risoluzione di 4 cm -1. I valori minimi di trasmittanza possono essere determinati dal modoftware fornito con lo strumento. </li></ol>

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<li>Amdursky, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blue+luminescence+based+on+quantum+confinement+at+peptide+nanotubes%5BTitle%5D)+AND+%22Nano+Lett%22%5BJournal%5D)">Blue luminescence based on quantum confinement at peptide nanotubes.</a> Nano Lett. 9, 3111-3115 (2009).</li>
<li>Maity, S., Jana, P., Maity, S. K., Haldar, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mesoporous+vesicles+from+supramolecular+helical+peptide+as+drug+carrier%5BTitle%5D)+AND+%22Soft+Matter%22%5BJournal%5D)">Mesoporous vesicles from supramolecular helical peptide as drug carrier.</a> Soft Matter. 7, 10174-10181 (2011).</li>
<li>Adler-Abramovich, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Self-assembled+organic+nanostructures+with+metallic-like+stiffness%5BTitle%5D)+AND+%22Angew.+Chem.+Int.+Ed%22%5BJournal%5D)">Self-assembled organic nanostructures with metallic-like stiffness.</a> Angew. Chem. Int. Ed. 49, 9939-9942 (2010).</li>
<li>Pelton, J. T., McLean, L. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spectroscopic+methods+for+analysis+of+protein+secondary+structure%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Biochem%22%5BJournal%5D)">Spectroscopic methods for analysis of protein secondary structure.</a> Anal. Biochem. 277, 167-176 (2000).</li>
<li>Haris, P. I., Chapman, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+conformational+analysis+of+peptides+using+fourier-transform+IR+spectroscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Biopolymers%22%5BJournal%5D)">The conformational analysis of peptides using fourier-transform IR spectroscopy.</a> Biopolymers. 37, 251-263 (1995).</li>
</ol>

Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari in competizione.

In sintesi, questo documento dimostra la facilità con cui le assemblee a base di peptidi possono essere formati in vitro. Il processo prevede peptidi disponibili in commercio e solventi, e si verifica spontaneamente in condizioni ambientali, per aggiunta di un solvente polare nella provetta. È fondamentale utilizzare HFP come solvente dei peptidi, a causa della bassa solubilità dei peptidi in altri solventi organici. Inoltre, a causa della elevata volatilità di HFP è necessario preparare soluzione madre fresco ...

Natura forma strutture ordinate e funzionale dal processo di auto-assemblaggio biomolecolare. Comprendere le forze che governano questo processo spontaneo può condurre alla capacità di imitare auto-assemblaggio in vitro e di conseguenza a maggiori progressi nel campo della scienza dei materiali 10,11. Peptidi, in particolare, molto promettenti come un blocco di costruzione biomolecolare, dal momento che presentano grandi diversità strutturale, facilità di sintesi chimica, e può essere facilmente funzionalizzati con entità biologiche e chimiche. Il campo di peptide auto-assemblaggio è stato lanciato da Ghadiri e dei suoi colleghi, che hanno dimostrato l&#39;auto-assemblaggio di nanotubi peptidici da peptidi ciclici con alternanza di D-e L-aminoacidi 12. Altri approcci di successo per la progettazione di assiemi peptidici includono peptidi lineari bolaamphiphile 5, amphiphiles (AP) 6, non coniugati auto-complementari peptidi ionici 13, peptidi tensioattivi simile <sup&gt; 4,14, e diblock copolypeptides 15. Un approccio più recente prevede l&#39;auto-assemblaggio di piccoli peptidi aromatici, definito dipeptidi homoaromatic. Questi peptidi comprendono solo due amminoacidi con la natura aromatica (ad es Phe-Phe, terz-butil dicarbonato (Boc)-Phe-Phe) 7,8,16-21. Le strutture formate da questi peptidi homoaromatic includono strutture tubolari, sfere, assemblee lastriformi e fibre 6,8,15,21-32. Le fibre in alcuni casi generano una maglia fibrille che produce un idrogel 33-37. Queste assemblee sono state sfruttate per applicazioni di biosensori, somministrazione di farmaci, elettronica molecolare, ecc. 38-45 Questo documento descrive i passi sperimentali necessarie per avviare la spontanea auto-assemblaggio di peptidi homoaromatic. Inoltre, esso presenta il processo di peptide coassembly. Questo processo implica l&#39;auto-assemblaggio di più di un tipo di peptidemonomero. La nostra dimostrazione include la coassembly di due peptidi disponibili in commercio: il peptide diphenylalanine (NH 2-Phe-Phe-COOH) e il suo Boc protetto analogico (Boc-Phe-Phe-OH). Ciascuno dei peptidi auto-assembla in una struttura supermolecolare: i formulari diphenylalanine peptide assemblee tubolari e le Boc-Phe-Phe-OH peptide auto-assembla in entrambi sfere o fibre a seconda del solvente 7,17,46. Abbiamo mescolato i due peptidi in determinati rapporti e caratterizzato le assemblee portato mediante microscopia elettronica, la forza microscopia e la spettroscopia FT-IR. I metodi hanno dimostrato la formazione di una struttura basata peptide che comprende elementi sferiche con un diametro di alcuni micron (1-4 micron) che sono collegati da assembly allungati con un diametro di poche centinaia di nanometri (~ 300-800 nm) . Le assemblee assomigliano stringhe di perline nella loro morfologia, le strutture sferiche sembrano essere filettato sulassiemi allungati. Abbiamo quindi chiamato queste assemblee &quot;collane biomolecolari&quot;. Le &quot;collane biomolecolari&quot; potrebbero servire come un nuovo biomateriale, come agente di rilascio di farmaci o come impalcatura per applicazioni elettroniche. Inoltre, la procedura che porta alla auto-assemblaggio di peptidi può essere utilizzato con altre classi di peptidi e biomolecole. Essa può portare ad una migliore comprensione delle forze coinvolte in auto-assemblaggio e la formazione di nuove strutture ordinate.

<table><tbody><tr><td>NH2-Phe-Phe-OH</td><td>Bachem</td><td>G-2925.0001</td><td></td></tr><tr><td>Boc-Phe-Phe-OH</td><td>Bachem</td><td>A-3205.0005</td><td></td></tr><tr><td>1,1,1,3,3,3-esafluoro-2-propanolo</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>52512-100ML</td><td></td></tr><tr><td>Etanolo assoluto (disidratato) AR sterile</td><td>Bio-Lab Ltd.</td><td>52555</td><td>Miscelazione con TDW per la preparazione della soluzione al 50% di</td></tr><tr><td>acetato di uranile</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>73943</td><td>Per colorazione negativa. È possibile lavorare senza di esso.</td></tr><tr><td>vetrino di copertura</td><td>Marienfeld Laboratory Vetreria</td><td>110590</td><td></td></tr><tr><td>Griglie TEM</td><td>Microscopia elettronica</td><td>Scienze FCF200-Cu-50</td><td>Formvar/Carbon 200 Mesh, Cu</td></tr><tr><td>Carta da filtro quanttiva</td><td>Whatman</td><td>1001055</td><td></td></tr><tr><td>Ossido di deuterio (D2O)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>151882-100G</td><td>99,9 atom %</td></tr><tr><td>D CaF2 finestra</td><td>PIKE Technologies</td><td>160-1212</td><td>finestra 25 mm x 2 mm. Per misure FT-IR</td></tr><tr><td>Punte AFM</td><td>NanoScience Instruments</td><td>Sonde CFMR</td><td>Aspire, serie CFMR-25</td></tr><tr><td>Unità filtranti</td><td>Millipore</td><td>SLGV033RS</td><td>Millex-GV, 0.22 &; m, PVDF, 33 mm, sterilizzato a raggi</td></tr><tr><td>gamma SEM</td><td>FEI</td><td></td><td>Quanta 200 ESEM</td></tr><tr><td>TEM</td><td>FEI</td><td></td><td>Tecnai T12 G2 Spirit</td></tr><tr><td>AFM</td><td>JPK Instruments</td><td></td><td>A JPK NanoWizard3</td></tr><tr><td>FT-IR</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td></td><td>Nicolet 6700 spettrometro d'oro avanzato</td></tr><tr><td>FT-IR Purge</td><td>Parker</td><td></td><td>BALSTON FT-IR Purge Gas Generator modello 75-52</td></tr><tr><td>Software OMNIC (Nicolet)</td><td>Thermo Nicolet Corporation</td><td></td><td>Per l'analisi degli spettri FT-IR</td></tr><tr><td>Miscelatore a vortice</td><td>Wisd Attrezzatura</td><td></td> da laboratorio <td>ViseMix VM</td></tr><tr><td>Peso</td><td>Mettler Toledo</td><td></td><td>NewClassic MS</td></tr><tr><td>Sputter coater</td><td>Polaron</td><td></td><td>SC7640 Sputter Coater</td></tr></tbody></table>

formazione di strutture biomolecolari ordinate dalla self-assemblaggio di piccoli peptidi

Formation of Ordered Biomolecular Structures by the Self-assembly of Short Peptides

In natura, strutture funzionali complesse sono formate dalla auto-assemblaggio di biomolecole in condizioni blande. Comprendere le forze che controllano l&#39;auto-assemblaggio e imita questo processo in vitro porterà importanti progressi nei settori della scienza dei materiali e delle nanotecnologie. Tra i mattoni biologico disponibili, peptidi hanno diversi vantaggi in quanto presentano sostanziali diversità, la loro sintesi in grande scala è semplice, e possono essere facilmente modificati con entità biologiche e chimiche 1,2. Diverse classi di peptidi progettati come peptidi ciclici, peptidi amphiphile e peptide-coniugati auto-assemblano in strutture ordinate in soluzione. Dipeptidi Homoaromatic, sono una classe di piccoli peptidi auto-assemblati che contengono tutte le informazioni molecolari necessarie per formare strutture ordinate come i nanotubi, sfere e fibrille 3-8. Una grande varietà di questi peptidi è disponibile in commercio. <pclass = &quot;jove_content&quot;&gt; Questo articolo presenta una procedura che porta alla formazione di strutture ordinate dalla auto-assemblaggio di peptidi homoaromatic. Il protocollo richiede soltanto reagenti commerciali e attrezzature di laboratorio di base. Inoltre, il documento descrive alcuni dei metodi disponibili per la caratterizzazione di assiemi a base di peptidi. Questi metodi comprendono elettrone e microscopia a forza atomica e Fourier-Transform Infrared Spectroscopy (FT-IR). Inoltre, il manoscritto dimostra la miscela di peptidi (coassembly) e la formazione di un &quot;perle su un filo&quot; struttura simile da questo processo. 9 I protocolli qui presentati possono essere adattati ad altre classi di peptidi o blocchi biologica e possono potenzialmente portare alla scoperta di nuove strutture a base di peptidi e per un migliore controllo del loro assemblaggio.

Questo documento descrive un metodo per la formazione di strutture ordinate su nano-e micrometro scala dalla auto-assemblaggio di peptidi. Per dimostrare questo semplice processo presentiamo e caratterizzare il coassembly di due semplici peptidi aromatici (Figura 1). Uno dei peptidi è il NH 2-Phe-Phe-OH (diphenylalanine) peptide, che può auto-assemblano in una soluzione acquosa in strutture tubolari cave di dimensioni nanometriche 7. L&#39;altro peptide è suo analogo protetto Boc, ...

Questo documento descrive la formazione di strutture a base di peptidi altamente ordinati dal processo spontaneo di auto-assemblaggio. Il metodo utilizza peptidi disponibili sul mercato e le apparecchiature di laboratorio comune. Questa tecnica può essere applicata a una grande varietà di peptidi e può portare alla scoperta di nuovi assemblaggi a base di peptidi.

Formazione di strutture biomolecolari ordinate dalla Self-assemblaggio di piccoli peptidi

In nature, complex functional structures are formed by the self-assembly of biomolecules under mild conditions. Understanding the forces that control ...

L'obiettivo generale di questa procedura è generare assemblaggi basati su peptidi sotto forma di collane biomolecolari. Questo risultato si ottiene innanzitutto preparando soluzioni stock sciogliendo separatamente la difenilalanina e il suo analogo protetto con gruppo Bach in una quantità appropriata di HFP, fino a una concentrazione finale di 100 milligrammi per millilitro. Il secondo passaggio consiste nel mescolare le soluzioni stock dei peptidi in un rapporto di cinque a tre, unendo 10 microlitri della soluzione peptidica di difenilalanina con 6 microlitri della soluzione peptidica di difenilalanina protetta con gruppo Bach.Successivamente, la soluzione stock del peptide miscelato viene aggiunta all'etanolo al 50% appena preparato per ottenere una concentrazione finale di cinque milligrammi per millilitro di difenilalanina e di tre milligrammi per millilitro di difenilalanina protetta con gruppo Bach, rispettivamente. In modo efficace, alla fine, la microscopia elettronica a scansione viene utilizzata per mostrare le collane biomolecolari co-assemblate dai due peptidi. Il vantaggio principale dell'utilizzo di processi di autoassemblaggio come quello qui dimostrato è che, grazie

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Un manuale semplice e generale metodo di sintesi peptoid con attrezzature di base e dei reagenti disponibili in commercio è delineato, consentendo peptoids per essere facilmente sintetizzati nella maggior parte dei laboratori. La sintesi, purificazione e caratterizzazione di un 36mer peptoid anfifilici è descritto, così come la sua auto-assemblaggio in altamente ordinato nanosheets.

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Formazione di strutture biomolecolari ordinate dalla Self-assemblaggio di piccoli peptidi

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