Formazione di strutture biomolecolari ordinate dalla Self-assemblaggio di piccoli peptidi

L'obiettivo generale di questa procedura è quello di generare assemblaggi a base di peptidi sotto forma di collane biomolecolari. Ciò si ottiene preparando prima le soluzioni madre sciogliendo separatamente la difenilalanina e il suo analogo protetto da Bach nella quantità appropriata di HFP fino a una concentrazione finale di 100 milligrammi per millilitro. Il secondo passo consiste nel miscelare le soluzioni stock di peptidi in un rapporto di cinque a tre mescolando 10 microlitri della soluzione di peptide di difenilalanina con sei microlitri della soluzione di peptide di difenilalanina protetta da Bach.

Successivamente, la soluzione madre di peptidi miscelati viene aggiunta all'etanolo al 50% appena preparato per ottenere una concentrazione finale di cinque milligrammi per millilitro di difenilalanina e tre milligrammi per millilitro per la difenilalanina protetta da Bach, rispettivamente. In definitiva, la microscopia elettronica a scansione viene utilizzata per mostrare le collane biomolecolari co-assemblate dai due peptidi. Il vantaggio principale dell'utilizzo di processi di auto-assemblaggio come quello qui dimostrato, è che attraverso la progressione spontanea, è possibile generare una struttura complessa.

In vitro qui rappresentano l'auto-assemblaggio del peptide, in particolare il co-assemblaggio di Dipeptidi che dimostra questa procedura sarà nuran, un ex laboratorio di studenti laureati. Per iniziare la procedura per l'autoassemblaggio della difenilalanina in strutture tubolari, preparare una soluzione madre di peptidi da 100 milligrammi per millilitro sciogliendo il peptide di difenilalanina in HFP. Per garantire l'omogeneità della soluzione, mescolarla con un miscelatore a vortice per alcuni secondi e metterla da parte sul banco per qualche minuto fino a quando il peptide non sarà completamente sciolto e la soluzione sarà limpida.

Diluire la soluzione madre di peptidi a una concentrazione finale di due milligrammi per millilitro in acqua distillata tripla. Conservare la soluzione a temperatura ambiente per 24 ore. Per la procedura di co-assemblaggio, due milligrammi di peptide di difenilalanina e un milligrammo di peptide di difenilalanina protetto da Bach separatamente in HFP a una concentrazione di 100 milligrammi per millilitro.

Quindi mescolare le soluzioni con un miscelatore a vortice per alcuni secondi e metterle da parte sul banco per alcuni minuti fino a quando i peptidi non saranno completamente sciolti e le soluzioni saranno limpide. Miscelare le soluzioni madre di peptidi in un rapporto di cinque a tre mescolando 10 microlitri della soluzione di peptide difenilalanina con sei microlitri della soluzione di peptide di difenilalanina protetta da Bach. Quindi mescolare la soluzione utilizzando un miscelatore a vortice.

Successivamente, aggiungere otto microlitri della soluzione madre di peptidi miscelati a 92 microlitri di etanolo al 50% appena preparato per ottenere una concentrazione finale di cinque milligrammi per millilitro per difenilalanina e tre milligrammi per millilitro. Per Bach protetto difenilalanina protettiva. Utilizzare una pipetta per mescolare delicatamente la soluzione.

Dopo 24 ore di incubazione a temperatura ambiente, applicare una goccia da 10 microlitri della soluzione peptidica su un vetrino di vetro e lasciarlo asciugare a temperatura ambiente. Rivestire il campione sul vetrino coprioggetto con un sottile strato d'oro utilizzando un coter sputter per 90 secondi. Al termine, immagina gli assemblaggi utilizzando il SEM che funzionano a 10-20 kilovolt.

Per l'analisi TEM, posizionare una goccia da 10 microlitri di soluzione peptidica su una griglia di rame da 200 mesh ricoperta di carbonio e stabilizzata da un supporto in film polimerico. Dopo un minuto, rimuovere il liquido in eccesso utilizzando carta da filtro. Successivamente, trasferire una soluzione di acetato di orinatoio al 2% in una siringa e filtrarla utilizzando un'unità filtrante da 22 micrometri a punto zero.

Per rimanere nel campione, posizionare una goccia da 10 microlitri di soluzione di acetato di orinatoio sulla griglia. Dopo 30 secondi, rimuovere il fluido in eccesso utilizzando carta da filtro e visualizzare il campione sulla griglia mediante TEM funzionante a 120 kilovolt. Per l'analisi FTIR, applicare una goccia da 30 microlitri della soluzione peptidica su una finestra di fluoruro di calcio.

Lasciare asciugare la soluzione a temperatura ambiente per sopprimere il segnale dell'acqua nello spettro FTIR. Posizionare una goccia di ossido di deuterio sul campione di peptide secco. Dopo aver essiccato il campione in un essiccante sotto vuoto, ripetere i passaggi precedenti due volte per garantire il massimo scambio tra idrogeno e deuterio.

Infine, registrare gli spettri FTIR utilizzando un rivelatore di triglicina solfato deuterato. Determinare i valori minimi di trasmittente utilizzando il software fornito con lo strumento per dimostrare la formazione di strutture ordinate mediante autoassemblaggio di peptidi. Il co-assemblaggio di due semplici peptidi aromatici è stato preparato e caratterizzato utilizzando l'analisi SEM e TEM.

I peptidi miscelati formavano un'architettura di assemblaggi sferici con un diametro di diversi micron collegati da strutture allungate con un diametro di poche centinaia di nanometri a causa dell'elevata somiglianza nella morfologia per battere le sue corde. Queste strutture sono chiamate collane molecolari. Un'analisi FM di queste strutture dimostra chiaramente la loro disposizione tridimensionale.

Inoltre, l'analisi SEM di diverse regioni di vari campioni indica che questo processo è avvenuto con un'elevata resa. L'analisi FTIR fornisce informazioni sulla struttura secondaria degli assemblaggi di peptidi. Lo spettro assorbente dell'ammide.

Una banda degli assemblaggi sferici formata dal peptide difenilalanina protetto da Bach in etanolo mostrava un singolo picco ammidico a 1.657 centimetri reciproci che indicava una conferma dell'alfa elica. Le strutture tubolari formate dal peptide difenilalanina nell'etanolo hanno mostrato due picchi distintivi a 1.613 centimetri reciproci e 1.682 centimetri reciproci, che si correlano con una struttura secondaria del foglio beta. Lo spettro FTIR delle collane biomolecolari formate dal co-assemblaggio dei due peptidi differito dall'assegnazione del picco per ogni singolo peptide.

Il primo picco a 1.653 centimetri reciproci corrisponde a una struttura ad elica alfa e il secondo picco a 1.684 centimetri reciproci si riferisce a una conferma di virata beta. La differenza tra i vari spettri indica una struttura unica per le collane biomolecolari. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione su come generare un assemblaggio basato su peptidi mediante peptide colorante.

Questo metodo può essere applicato facilmente ad altre biomolecole per formare una struttura complessa. Non dimenticare che camminare con solventi organici può essere estremamente pericoloso. Guanti. Il camice da laboratorio e gli occhiali di sicurezza devono essere sempre indossati durante l'esecuzione di questa procedura.