Monitoraggio della concorrenza intraspecie in una popolazione di cellule batteriche mediante cocultivazione di ceppi marcati fluorescentmente

Questo metodo utilizza la co-coltivazione di bacillus sutilis marcato in fluorescenza per monitorare la rapida espansione clonale e l'eliminazione di mutazioni benefiche e dannose in una popolazione di cellule batteriche nel tempo. Per prima cosa, prepara le precolture dei batteri per l'esperimento di competizione. Mescolare quantità uguali di ceppi marcati con fluorescenza e co-coltivare i batteri in diverse condizioni nutrizionali.

Quindi raccogliere i campioni in diversi punti temporali, diluirli in modo appropriato e propagare le cellule su piastre di agar. Ora visualizza e conta i ceppi sopravvissuti mediante microscopia a stereofluorescenza. In definitiva, i risultati possono determinare la percentuale dei batteri sopravvissuti rispetto al numero totale di colonie contate.

A differenza del monitoraggio della competizione intra-specie, l'utilizzo di diverse cassette di antibiotici per l'etichettatura dei ceppi. In questo metodo, i ceppi concorrenti marcati con fluorescenza sono quasi completamente isotonici e in grado di fermentare sulle stesse piastre AGA. La pre-procedura sarà presentata da Lorena, che è una dottoranda nel mio laboratorio, inoculare i quattro millilitri di terreno LB con un microlitro di batteri da meno 80 gradi Celsius, crioceppi e coltivare le precolture durante la notte a 28 gradi Celsius e 220 giri/min, diluire 0,1 millilitri di coltura in 0,9 millilitri di terreno LB in un vete da 1,5 millilitri, e determinare la densità ottica.

Quindi, per ottenere popolazioni cellulari miste per gli esperimenti di competizione, inoculare 100 millilitri di fiasche contenenti 20 millilitri di CGLC e CGLC. Mezzo minimo in un rapporto uno a uno, trasferire 10 millilitri di colture in provette di plastica da 15 millilitri. Raccogliere le cellule mediante centrifugazione per 10 minuti a 4.000 volte la gravità e scartare il surnatante.

Quindi risospendere le cellule in 0,5 millilitri di terreno LB fresco e trasferire le cellule in una tazza di reazione sterile da 1,5 millilitri e aggiungere 0,5 millilitri di glicerolo sterile al 50%. Miscelare la sospensione mediante vortice rigoroso e conservare i campioni in un congelatore a meno 80 gradi Celsius. Coltura successiva, i batteri rimanenti nelle fiasche di agitazione.

Tenere le fiasche di agitazione al buio per evitare il fotosbiancamento del campione di forza della flora, 0,1 millilitri delle colture dopo sette ore e 24 ore di misurazione della crescita e notare che la densità ottica di una diluizione da uno a 10 dei campioni rende le scorte criogeniche dei campioni da conservare a meno 80 gradi Celsius. Dopo aver raccolto tutti i campioni, scongelare le scorte criogeniche e diluire le cellule in una soluzione salina allo 0,9% per ogni piastra di ceppo. 0,1 millilitri della diluizione da 10 alla quinta diluizione negativa su una piastra di agar media SP e distribuire le cellule utilizzando una pipetta di vetro sterile.

Incubare le piastre per una notte a 37 gradi Celsius al buio fino a quando non sono apparse singole colonie con una penna nera. Dividere il fondo della piastra di agar in quattro parti per un migliore orientamento mentre si contano i sopravvissuti al microscopio a stereofluorescenza. Ora, posiziona la piastra capovolta al microscopio e metti a fuoco le colonie usando la fonte di luce fredda.

Una volta che le colonie sono a fuoco, passa al set di filtri appropriato per CFP Flora four. Per visualizzare le cellule sopravvissute del ceppo marcato con CFP, contare i sopravvissuti di questo ceppo etichettando le colonie con una penna. E annota il numero.

Rimuovere le etichette con l'etanolo. Quindi passare al set di filtri YFP. Visualizzare le cellule sopravvissute del ceppo marcato con YFP.

Conta di nuovo i sopravvissuti etichettando le colonie con una penna. E annota il numero. Aprire le foto da un punto che sono state scattate con il set di filtri CFP e YFP.

Ottimizza il contrasto e la luminosità per ridurre la fluorescenza dello sfondo dai media. Vai a una delle immagini e seleziona tutto. Copia l'immagine e incollala sull'altra immagine.

Unisci le immagini selezionando nel menu dei livelli l'opzione colore più chiaro. In questo esperimento, una popolazione cellulare costituita da due ceppi BCI è stata marcata con Fluor CFP e YFP per valutare l'effetto di diverse fonti di azoto sulla crescita mediante diluizione appropriata su piastre di agar. La composizione clonale di una popolazione cellulare nel tempo può essere determinata con precisione semplicemente contando le colonie fluorescenti gialle e blu.

L'attività dell'enzima glutammato deidrogenasi influenza fortemente la fitness dell'oto a seconda della disponibilità di glutammato esogeno. In assenza di glutammato esogeno, l'attività di GDH ad alto livello è svantaggiosa per i batteri poiché gli enzimi roccia G e B buono degradano il glutammato necessario nell'anabolismo. Al contrario, la sintesi di due gdhs funzionali è vantaggiosa per i batteri quando è disponibile il glutammato esogeno perché, oltre al glucosio G, il glutammato viene utilizzato come fonte di carbonio.

Risultati simili sono stati ottenuti in un esperimento di cambio di stampo. Ancora una volta, i batteri dotati di attività GDH di alto livello sono stati superati dalle cellule con ridotta attività GDH in terreni di crescita privi di glutammato. Al contrario, i batteri che sintetizzano un solo GDH attivo sono stati eliminati dalla coltura.

Quando il terreno è stato integrato con glutammato, chiaramente la composizione iniziale della popolazione di cellule miste è rimasta quasi costante nel tempo. Indipendentemente dal Fluor preso insieme. L'uso di Flora Force è un potente strumento per monitorare la competizione intraspecie in una popolazione di cellule batteriche Una volta che sono stati generati i punti di forza della concorrenza.

Questa tecnica può essere eseguita in cinque giorni se eseguita correttamente.