Il monitoraggio spaziale segregazione in superficie Colonizzare microbiche Popolazioni

L'obiettivo generale di questa procedura è osservare la distribuzione spaziale dei ceppi microbici durante lo sciame, lo scorrimento o la formazione di biofilm utilizzando la microscopia a fluorescenza. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo della microbiologia sociale, come ad esempio il modo in cui la segregazione spaziale influenza l'interazione microbica. Il vantaggio principale di questa tecnica è che l'idoneità e la distribuzione spaziale dei ceppi microbici possono essere facilmente valutate utilizzando tecniche microscopiche e analisi di immagini di sottosegmenti.

A dimostrare la procedura sarà Theresa Holscher, una ricercatrice di dottorato del mio laboratorio. Il giorno prima dell'esperimento, aggiungere tre millilitri di terreno LB a una provetta di coltura e inoculare da una scorta di B.subtilis congelata. Ripetere questa inoculazione con un tubo separato per ogni ceppo di interesse.

Posizionare le provette in un'incubatrice ad agitazione orizzontale a 37 gradi Celsius per una notte. Per preparare le piastre per gli esperimenti di sciamatura e scorrimento, versare 20 millilitri di LB medium temperato in una capsula di Petri in polistirene da 90 millimetri. Chiudere immediatamente il piatto e posizionarlo su un lato della cappa sterile a raffreddare per almeno un'ora.

Successivamente, preparare le piastre per gli esperimenti sul biofilm delle colonie versando 25 millilitri di agar due volte il terreno SG in una piastra di Petri da 90 millimetri. Chiudete immediatamente i piatti e metteteli a raffreddare in pile di quattro o meno per almeno un'ora. Per iniziare, posizionare le piastre sciame e scorrevoli LB agar in una cappa a flusso laminare e rimuovere i coperchi.

Lasciare asciugare le piastre per 20 minuti. L'umidità delle piastre in questi esperimenti è fondamentale. Mentre l'umidità in eccesso consente ai batteri di nuotare, l'essiccazione prolungata previene la sciamatura e lo scivolamento.

Allo stesso modo, la struttura del biofilm della colonia dipende dalla secchezza del terreno. Utilizzando uno spettrofotometro, determinare le densità ottiche delle colture starter notturne a 600 nanometri. In una provetta da microcentrifuga da 1,5 millilitri, mescolare le quantità normalizzate per densità dei ceppi che producono la proteina fluorescente verde e rossa per un totale di 200 microlitri.

Agitare il tubo per tre secondi. Utilizzando una micropipetta, posizionare due microlitri di coltura mista al centro di una piastra di agar pre-essiccata da 90 millimetri LB nella cappa a flusso laminare. Mettere la piastra ad asciugare per 10 minuti.

Infine, incubare le piastre a 37 gradi Celsius in posizione verticale per evitare che la condensa si accumuli sulla superficie dell'agar. Per prima cosa, posizionare le piastre di agar SG due volte in una cappa a flusso laminare per 15 minuti per asciugarle. Quindi, aggiungere 100 microlitri ciascuno del ceppo di biofilm che produce proteine fluorescenti verdi e rosse, colture starter di B.subtilis 168, in una provetta da microcentrifuga da 1,5 millilitri.

Agitare il tubo per tre secondi. Preparare le provette con 100 microlitri di terreno LB e, utilizzando la coltura mista, creare una serie di inoculati con diluizione di 10 volte. Utilizzando una micropipetta, posizionare due microlitri di coltura mista non diluita sulla piastra di agar SG due volte.

Ripetere l'operazione con inoculi per le diluizioni da 10 a uno, 10 a due, 10 a tre e 10 a quattro, distanziando i punti a distanze uguali per consentire la crescita di sei-nove colonie su un unico piatto. Incubare le piastre in posizione verticale a 30 gradi Celsius per uno o tre giorni. Per iniziare, posizionare le piastre sulla piattaforma di imaging di un microscopio per il rilevamento della fluorescenza.

Per gli esperimenti di scorrimento e sciamatura, impostare l'origine dell'inoculazione, al centro della capsula di Petri, all'angolo del campo visibile per consentire la misurazione dell'espansione radiale della colonia. Regolare l'ingrandimento alla massima risoluzione che consente l'imaging della regione più grande possibile della lastra da 90 millimetri. Regolare il tempo di esposizione in modo appropriato, a seconda dell'intensità del segnale fluorescente.

Per l'analisi del biofilm, posizionare una colonia di interesse al centro del campo visivo. Impostare l'ingrandimento alla risoluzione più alta che consente di visualizzare l'intera colonia. Le colonie sono ora pronte per la misurazione e l'analisi.

Infine, analizza i dati come descritto nel protocollo di testo. Questa figura mostra la crescita di una tipica colonia di Bacillus subtilis co-inoculata a due ceppi. Lo sciame, che è un movimento collettivo di superficie dipendente dai flagellanti, si traduce in una popolazione altamente mista.

In questo video time-lapse, l'inoculante iniziale è stato posizionato al centro della piastra spalmata. Lo sciame di strati sottili è chiaramente osservato e man mano che la colonia si sviluppa, i due ceppi fluorescenti rossi e verdi appaiono mescolati e sovrapposti. Al contrario, le immagini del comportamento di scorrimento mostrano settori di crescita definiti corrispondenti ai ceppi fluorescenti diversamente etichettati.

Questo video mostra la crescita di una colonia co-inoculata scorrevole in cui i ceppi mancano di flagelli funzionanti. Queste colonie sono ancora in grado di diffondersi utilizzando una combinazione di eso-polisaccaride secreto, idrofobina e surfactina. Le colonie risultanti mostrano un distinto assortimento di crescita spaziale rispetto al ceppo sciamatore.

Le densità cellulari iniziali delle colonie produttrici di biofilm hanno influenzato pesantemente l'assortimento spaziale delle colonie risultanti. Le colonie avviate con un'alta densità cellulare delle popolazioni miste, hanno mostrato un assortimento spaziale minore o nullo. Al contrario, quando la densità cellulare all'inizio era bassa, è stato possibile rilevare settori fluorescenti verdi e rossi.

Dopo aver visto questo video dovresti avere una buona comprensione di come determinare le abbondanze relative dei ceppi marcati in fluorescenza nelle colonie microbiche, esaminare la segregazione spaziale e studiare l'influenza della densità delle cellule fondatrici.