Il monitoraggio spaziale segregazione in superficie Colonizzare microbiche Popolazioni

L'obiettivo generale di questa procedura è osservare la distribuzione spaziale di ceppi microbici durante il movimento di swarming, sliding o la formazione di biofilm mediante microscopia fluorescente. Questo metodo può contribuire a rispondere a domande fondamentali nel campo della microbiologia sociale, ad esempio come la segregazione spaziale influenzi l'interazione microbica. Il principale vantaggio di questa tecnica consiste nella facilità con cui è possibile valutare l'idoneità (fitness) e la distribuzione spaziale dei ceppi microbici ricorrendo a tecniche microscopiche e all'analisi delle immagini mediante sottosezioni.

La procedura sarà dimostrata da Theresa Holscher, ricercatrice dottoranda del mio laboratorio. Il giorno prima dell'esperimento, aggiungere tre millilitri di mezzo LB in un tubo da coltura e inoculare da una scorta congelata di B.subtilis. Ripetere questa inoculazione con un tubo separato per ogni ceppo di interesse.

Collocare le provette in un incubatore orizzontale con agitazione a 37 gradi Celsius per tutta la notte. Per preparare le piastre per esperimenti di swarming e sliding, versare 20 millilitri di mezzo LB temperato in una piastra di Petri in polistirene da 90 millimetri. Chiudere immediatamente la piastra e posizionarla da un lato dell'hotter sterile per raffreddarla per almeno un'ora.

Successivamente, preparare le piastre per gli esperimenti con biofilm coloniale versando 25 millilitri due volte di terreno SG in una piastra di Petri da 90 millimetri. Chiudere immediatamente le piastre e lasciarle raffreddare in pile di quattro o meno per almeno un'ora. Per iniziare, posizionare le piastre di agar LB per lo swarming e lo sliding in una cappa a flusso laminare e rimuovere i coperchi.

Lasciare asciugare le piastre per 20 minuti. L'umidità delle piastre in questi esperimenti è fondamentale. Mentre un'eccessiva umidità permette ai batteri di nuotare, un'essiccazione prolungata impedisce il movimento collettivo (swarming) e lo scivolamento (sliding).

Allo stesso modo, la struttura del biofilm coloniale dipende dalla secchezza del mezzo. Utilizzando uno spettrofotometro, determinare le densità ottiche delle colture iniziali coltivate durante la notte a 600 nanometri. In un tubo microcentrifuga da 1,5 millilitri, mescolare quantità normalizzate per densità dei ceppi produttori di proteina fluorescente verde e rossa per un volume totale di 200 microlitri.

Agitare il tubo al vortex per tre secondi. Utilizzando una micropipetta, depositare due microlitri della coltura mescolata al centro di una piastra in agar LB da 90 millimetri pre-essiccata all'interno della cappa a flusso laminare. Lasciare asciugare la piastra per 10 minuti.

Infine, incubare le piastre a 37 gradi Celsius in posizione verticale per evitare che la condensa si accumuli sulla superficie dell'agar. In primo luogo, posizionare le piastre all'agar SG due volte in una cappa a flusso laminare per 15 minuti per farle asciugare. Successivamente, aggiungere 100 microlitri ciascuno delle colture iniziali del ceppo di biofilm produttore di proteina fluorescente verde e rossa, B.subtilis 168, in un tubo microcentrifugo da 1,5 millilitri.

Vortexare il tubo per tre secondi. Preparare tubi con 100 microlitri di mezzo LB e, utilizzando la coltura mista, creare una serie di diluizioni di inoculi di 10 volte. Utilizzando una micropipetta, depositare due microlitri della coltura mista non diluita sulla piastra di agar SG 2 volte.

Ripetere questa procedura con i campioni per le diluizioni 10 alla uno, 10 alla due, 10 alla tre e 10 alla quattro, distanziando le gocce in modo uniforme per permettere la crescita di sei-nove colonie su un singolo piatto. Incubare le piastre in posizione verticale a 30 gradi Celsius per uno-tre giorni. Per iniziare, posizionare le piastre sulla piattaforma di imaging di un microscopio con rilevatore di fluorescenza.

Per esperimenti di scivolamento e di nuoto collettivo, posizionare l'origine dell'inoculo, al centro della piastra di Petri, in corrispondenza dell'angolo del campo visibile, in modo da consentire la misurazione dell'espansione radiale della colonia. Regolare l'ingrandimento alla risoluzione più elevata che permetta l'acquisizione d'immagine della regione più ampia possibile della piastra da 90 millimetri. Regolare il tempo di esposizione in modo appropriato, in base all'intensità del segnale fluorescente.

Per l'analisi del biofilm, posizionare una colonia di interesse al centro del campo visivo. Impostare l'ingrandimento alla risoluzione più alta che consenta di visualizzare l'intera colonia. Le colonie sono ora pronte per essere misurate e analizzate.

Infine, analizzare i dati come descritto nel protocollo del testo. Questa figura mostra la crescita di una colonia tipica di Bacillus subtilis con doppia inoculazione. Il movimento collettivo sulla superficie, detto swarming, che dipende dai flagelli, porta a una popolazione altamente mescolata.

In questo video in time-lapse, l'inoculo iniziale è stato posizionato al centro della piastra. È chiaramente osservabile la migrazione a strato sottile e, mentre la colonia si sviluppa, i due ceppi fluorescenti rossi e verdi appaiono mescolati e sovrapposti. Al contrario, le immagini del comportamento di scorrimento mostrano settori ben definiti di crescita corrispondenti ai ceppi fluorescenti con marcatura diversa.

Questo video mostra la crescita di una colonia co-inoculata scivolante in cui i ceppi non possiedono flagelli funzionanti. Queste colonie sono comunque in grado di espandersi grazie a una combinazione di esopolisaccaride secreto, idrofobina e surfattina. Le colonie risultanti mostrano un'organizzazione spaziale della crescita distinta rispetto al ceppo a mobilità collettiva.

Le densità iniziali delle cellule nelle colonie produttrici di biofilm hanno influenzato notevolmente l'assortimento spaziale delle colonie risultanti. Le colonie avviate con un'elevata densità cellulare delle popolazioni miste hanno mostrato un assortimento spaziale minimo o nullo. Al contrario, quando la densità cellulare all'avvio era bassa, erano rilevabili chiari settori fluorescenti verdi e rossi.

Dopo aver guardato questo video, si dovrebbe avere una buona comprensione di come determinare le abbondanze relative di ceppi marcati con fluorocromi all'interno di colonie microbiche, esaminare la segregazione spaziale e studiare l'influenza della densità delle cellule fondatrici.