Visualizzazione di ATP sintetasi Dimeri nei mitocondri da Electron Cryo-tomografia

L'obiettivo generale di questa procedura è determinare la struttura e l'organizzazione delle proteine mitocondriali in C due. Ciò si ottiene generando prima una griglia per microscopio elettronico idratato congelata contenente il campione. Successivamente, una serie di inclinazione a dose limitata del campione viene registrata in un criomicroscopio elettronico.

Quindi la serie di inclinazione viene elaborata per generare un volume tomografico. Infine, viene calcolata la media delle densità proteiche per determinare la struttura delle proteine e le membrane vengono segmentate per rivelare la loro struttura 3D. Riposizionando le medie delle proteine nelle Tom Graham, viene rivelata la struttura e l'organizzazione delle proteine nella membrana.

Quindi facciamo la tomografia a cri elettronici dei mitocondri perché vogliamo capire come funzionano a livello molecolare. Il vantaggio principale di questa tecnica rispetto ad altri metodi, come la microscopia elettronica di sezioni di plastica sottili, è che la risoluzione è più elevata. Il materiale non è fissato chimicamente in alcun modo e i dettagli molecolari delle proteine sono preservati.

La tecnica della critografia elettronica può richiedere un po' di tempo per essere padroneggiata, ma gli utenti esperti possono acquisire da cinque a sei fondi TOM di buona qualità per sessione. La parte più difficile della procedura consiste nel produrre griglie idratate congelate di spessore ottimale del ghiaccio Dopo aver isolato e pellettato i mitocondri, secondo il protocollo di testo, utilizzare 250 triosi T millimolari in tampone HEPA da 10 millimolari per risospendere il pellet a una concentrazione di circa cinque milligrammi per millilitro di scarica proteica totale di glow. Griglie EM interamente in carbonio con il lato del carbonio rivolto verso l'alto in un dispositivo a vuoto secondo le istruzioni del produttore, liquefare alcuni millilitri di etano dirigendo un flusso di gas etano sul lato interno di un contenitore di alluminio raffreddato ad azoto liquido.

Usa un paio di pinzette per raccogliere una griglia DM a scarica luminosa e posizionarla sul banco mescola la proteina, una sospensione fiduciale d'oro coniugata, uno a uno con la sospensione mitocondriale, e applica immediatamente tre microlitri della soluzione sulla griglia. Quindi, posiziona le pinzette in un dispositivo di vetrificazione come una ghigliottina fatta in casa con un cuneo di carta da filtro, asciuga il liquido in eccesso dalla griglia e rilascia il grilletto per immergere immediatamente la griglia nell'etano liquido. Quindi trasferire la griglia dall'etano liquido all'azoto liquido.

Rimuovere l'etano in eccesso dalla griglia inserendo la punta di un nuovo cuneo di carta da filtro nell'etano liquido. Man mano che il liquido sale, trascinare delicatamente la griglia verso l'alto sulla carta da filtro, mantenendola sotto la parte anteriore del liquido, quindi trasferirla immediatamente in azoto liquido per conservarla per un uso successivo. Posizionare la griglia in una scatola a griglia e conservarla in un esecutore riempito di azoto liquido per registrare una serie di inclinazioni tomografiche.

Iniziare assicurandosi che i dosatori di azoto liquido siano pieni e verificare che la temperatura dello stadio del campione e del dispositivo di trasferimento della griglia sia inferiore a 100 kelvin. Verificare che il microscopio elettronico sia ben allineato acquisendo un'immagine di una griglia di prova e controllando la qualità degli anelli di spine Gli anelli devono essere rotondi ed estendersi fino al bordo dell'immagine. Quindi, inserire una griglia con mitocondri idratati congelati.

Quindi, in modalità di ricerca, cercare le aree con lo spessore del ghiaccio e la qualità del campione appropriati. Scatta un'immagine di ricerca di sei secondi di aree promettenti per determinare l'idoneità per la raccolta dei dati. Dopo aver individuato una buona area del campione, inclinare il tavolino di più o meno 60 gradi per determinare l'intervallo di inclinazione massimo disponibile senza ostruzione dell'esposizione o dell'area di messa a fuoco da barre della griglia o cristalli di ghiaccio su un foro vicino pieno di ghiaccio di aspetto simile, passare alla modalità di esposizione e regolare l'intensità del raggio o il tempo di acquisizione dell'immagine.

Quindi ogni immagine registrata ha una dose di elettroni da 30 a 50 elettroni per pixel per i CCD o da sei a otto elettroni per pixel al secondo. Per i rivelatori diretti di elettroni, calcolare il rapporto di distribuzione della dose o I zero su I 60 dividendo il conteggio medio degli elettroni per un'immagine di un secondo acquisita a zero gradi per quello di un'immagine di 60 gradi su un foro vuoto. Acquisisci un'immagine di un secondo in modalità di esposizione e annota il conteggio degli elettroni per angstrom al quadrato.

Tenendo conto del rapporto di distribuzione della dose, calcolare il numero totale di immagini e l'intervallo di inclinazione che possono essere registrati per una specifica dose totale di elettroni utilizzando un software di raccolta dati automatico appropriato. Imposta e registra un Tom Agram con i parametri appena determinati tomo tipici. Per questi campioni, iniziare con più o meno 20 gradi e passare attraverso zero gradi prima di raggiungere inclinazioni elevate.

Per creare e segmentare i tomo, convertire la serie di inclinazione in un formato di file appropriato per il software di ricostruzione. Utilizzando un programma di ricostruzione Tom Graham come Im mod, allinea le immagini segnando la posizione dei marcatori fiduciali d'oro. Una volta allineato, generate un Tommo Graham.

Migliora il contrasto del tommo Graham utilizzando un filtro immagine come il non lineare, un filtro di diffusione isotropo distribuito con IM o per la visualizzazione. Utilizzare i programmi disponibili in commercio per segmentare manualmente il Tom. Assegna i voxel corrispondenti alla membrana interna ed esterna per separare gli strati una volta assegnati, crea una superficie per visualizzare le membrane.

Utilizzando l'opzione clicker nel plug-in del pacchetto EM per emira, contrassegnare la posizione di una particella di sintasi TP utilizzando le particelle contrassegnate come input e un pacchetto software appropriato come la stima delle particelle. Per il programma di tomografia elettronica, calcolare una media di agrammi per una stima della risoluzione. Calcola la correlazione della shell del foyer tra due medie sub tommo determinate in modo indipendente utilizzando il programma di visualizzazione gratuito.

Chimera inserisce strutture a raggi X note nella media sub Tom Agram prima manualmente, poi automaticamente con il comando fit come si vede in questa figura, la segmentazione manuale delle membrane in un grido di elettroni mitocondriali rivela la struttura del Christi in un mitocondrio. Mediante imaging dei mitocondri da ceppi knockout di lievito privi di determinate proteine. L'effetto di queste proteine sulla morfologia di Christi può essere valutato.

Qui è mostrato un mitocondrio di un ceppo di lievito privo di una subunità di sintesi TP E, che è necessaria per la formazione di un dimero di sintesi TP. A differenza del normale Lala Christi dei mitocondri wild type, questi organelli contengono invece un certo numero di strutture di membrana interne che sono prive di Christi o contengono piccole invaginazioni di membrana a forma di palloncino. Negli Ingram con un buon contrasto, i dimeri A TP Synthes sono facilmente visibili, come indicato qui dalle punte di freccia gialle.

Segmentando le membrane, la posizione della sintesi di A TP ora rappresentata dalla sfera gialla può essere visualizzata in relazione alla morfologia di Christi. In questo caso, la sintesi di A TP forma file di dimeri lungo i bordi altamente curvi del Lo Meer Christi Sub tommo la media consente di determinare le strutture delle proteine a risoluzioni di quattro nanometri o superiori. Inserendo strutture a raggi X note nel sub tomo Graham, è possibile assemblare modelli atomici medi di complessi proteici nel loro ambiente nativo.

In questo esempio, i volumi medi possono essere reinseriti nel Tomo Graham per aiutare l'organizzazione dei singoli complessi l'uno rispetto all'altro e ad altri complessi proteici nella membrana. Il nostro protocollo dimostra come è possibile utilizzare la criotomografia elettronica per determinare la struttura e l'organizzazione dei complessi proteici all'interno della membrana mitocondriale interna. Questo protocollo può essere utilizzato anche per determinare la struttura e l'organizzazione di altre proteine legate alla membrana all'interno di diversi compartimenti cellulari.

La preparazione del campione è la chiave per acquisire buoni termogrammi. La griglia idratata congelata deve contenere occhi perfettamente vitrei di spessore compreso tra 70 e 150 nanometri. Normalmente esaminiamo da cinque a sei griglie fino a quando non si trova un'area con uno spessore del ghiaccio e una qualità ottimali del campione.

Per la raccolta di grammi, è meglio un microscopio elettronico a trasmissione da 300 kilovolt con stadio criogenico dedicato e filtro di energia e una fotocamera con rivelatore di elettroni diretto, ma potrebbe essere utilizzato anche uno strumento da 200 kilovolt con stadio criogenico a ingresso laterale e una telecamera CCD. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come preparare una griglia cry m. Raccogli una serie di inclinazione, ricostruisci il termogramma e calcola una media sub tommo.

Queste sono le competenze di base necessarie per studiare come l'organizzazione delle proteine in una cellula influenzi la capacità di quella cellula di svolgere funzioni biologiche come l'efficiente sintesi di A TP. Non dimenticare che lavorare con l'azoto liquido e l'Ethan liquido può essere molto pericoloso e gli occhiali e i guanti di sicurezza devono essere indossati in ogni momento.