Name: Visualizzazione di ATP sintetasi Dimeri nei mitocondri da Electron Cryo-tomografia (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-09-14T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 39 s
Description: Scopri la crio-tomografia elettronica per visualizzare la struttura e l'organizzazione delle proteine mitocondriali. Questo metodo preserva i dettagli molecolari nello stato nativo senza fissazione chimica.

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Questo lavoro è stato sostenuto dalla Max Planck Society (KMD, BD, AWM, la tubercolosi, TBB, DJM, e WK), il Cluster di Eccellenza Francoforte &quot;complessi macromolecolari&quot;, finanziato dalla Deutsche Forschungsgemeinschaft (WK) e un post-dottorato EMBO a lungo termine Fellowship (VAMG).

1 Preparazione di mitocondri da cellule o tessuti mediante centrifugazione differenziale Questa sezione descrive una procedura generale per l&#39;isolamento dei mitocondri intatti da vari organismi eucarioti. I componenti del tampone e velocità di centrifugazione precise devono essere ottimizzate per ogni tessuto / specie studiate. <ol><li> Rompere le cellule in tampone isotonico (ad esempio, saccarosio 250 mm, 10 HEPES mM pH 7.4), utilizzando un mulino vetro tallone (micelio fungino) 28, digestione enzimatica della parete cellulare (Saccharomyces cerevisiae) 29, un omogeneizzatore-cuscinetto a sfere (singolo -cell eucarioti / cultura cellule / nematodi) 30, o un frullatore (tessuti animali o vegetali) 31. </li><li> Rimuovere detriti cellulari mediante filtrazione attraverso mussola seguita da centrifugazione a bassa velocità (2000 xg, a 4 ° C, 10 min). </li><li> Raccogliere il surnatante e pellet mitocondri mediante centrifugazione ad alta velocità (9.000 xg, a 4 ° C, 10 min). </li><li> Se necessario, utilizzare un gradiente di densità passo isotonica per la purificazione ulteriore della frazione mitocondriale 32. </li></ol> 2 Preparazione di mitocondri per Electron Cryo-tomografia La sezione seguente descrive come ottenere i campioni congelati-idratata per crio-ET. NOTA: Il metodo prevede l&#39;uso di azoto liquido estremamente freddo ed etano, che può causare gravi ustioni. Occhiali di sicurezza e guanti di crio-protezione devono essere indossati. Etano liquido, che è anche infiammabile, deve essere gestito in una cappa aspirante. <ol><li> Risospendere mitocondri pellet in trealosio 250 mM, 10 mM tampone HEPES a pH 7,4 ad una concentrazione di circa 5 mg / ml di proteine ​​totali. </li><li> Glow-scarico griglie EM carbonio bucata, laterali carbonio alto, in un dispositivo a depressione secondo le istruzioni del produttore. </li><li> Liquefare pochi millilitri di etano dirigendo un flusso di gas etano sul lato interno di un fresco azoto liquidocontenitore di alluminio ed. </li><li> Mescolare oro proteina A-coniugato sospensione fiduciale 1: 1 con sospensione mitocondriale e applicare immediatamente 3 microlitri di una griglia EM bagliore-scarico in pinzetta. </li><li> Mettere le pinzette in un dispositivo di vetrificazione, ad esempio, una ghigliottina fatta in casa. Asciugare il liquido in eccesso con un cuneo di carta da filtro (~ 5 secondi o fino a quando si ferma liquidi diffusione) e immergersi immediatamente la griglia in etano liquido rilasciando il grilletto. </li><li> Trasferire la griglia da etano liquido in azoto liquido. Durante il trasferimento, rimuovere l&#39;eccesso di etano dalla griglia con carta da filtro. Posizionare la punta di un pezzo a forma di cuneo di carta filtro in etano liquido. Come la etano liquido sale, trascinare delicatamente la griglia la carta da filtro ma tenerlo sotto la parte frontale del liquido. Etano liquido viene rimosso dalla rete per azione capillare e una volta che tutto etano liquido è stato rimosso, trasferire immediatamente la griglia in azoto liquido. </li><li> Posizionare la griglia vetrificata in una scatola di immagazzinaggio griglia, unand conservare in azoto liquido per un uso successivo come appropriato. </li></ol> 3 Registrazione di tomografica Tilt Series La sezione seguente descrive come impostare e raccogliere una serie di inclinazione tomografica di un mitocondrio con un microscopio elettronico Polara dotato di un filtro di energia post-colonna e camera CCD. Protocolli simili sono utilizzati con tutti i microscopi elettronici crio-dotati di CCD o telecamere dirette rivelatore di elettroni. <ol><li> Allineare il microscopio <ol><li> Inserire provino ad esempio, grafite e le isole d&#39;oro su pellicola di carbonio bucata. </li><li> Selezionare la modalità di ricerca nel sistema di basse dosi del microscopio. </li><li> Portare campione altezza eucentrica. Questo è il punto di minimo movimento xy quando si inclina il supporto del campione. Centrare un punto di interesse a 0 ° di inclinazione, inclinare la fase a 20 ° e ricentrare il punto alterando lo z-altezza. Torna a 0 ° e ripetere fino a spostamento laterale è ridotto al minimo. </li><li> Selezionaremodalità di esposizione. Scegli ingrandimento desiderato per la raccolta di un tomogramma (ad esempio, 25,000X sul rivelatore ≈ 0,6 nm CAMPIONE dimensione dei pixel). </li><li> Scegli una piccola apertura del condensatore (50-70 mm) e selezionare la dimensione dello spot e l&#39;intensità del fascio in modo che il fascio è solo più largo del dispositivo di imaging e dà una lettura di 60 pixel e - / pixel (CCD) o 14 e - / pixel / sec (rivelatore di elettroni diretto, modalità conteggio). </li><li> Apertura del condensatore Center. </li><li> Trova gaussiana fuoco ad esempio, il punto di contrasto minimo. Ripristino lettura microscopio defocus e corretti punti di articolazione e il centro di rotazione secondo le istruzioni del produttore. </li><li> Quadrante in defocus desiderata per la registrazione tomogram. NOTA: Alta defocus (8 micron) aumenta il contrasto, ma riduce la risoluzione, considerando che la bassa defocus (2-4 micron) aumenta la risoluzione a scapito del contrasto. </li><li> Su un buco vuoto, generare un nuovo guadagno di riferimento e allineare filtro di energia secondo il fornitore diistruzioni. </li><li> Allineare ricerca e di esposizione modi. Nel modo di esposizione, centrare un punto di interesse e passare alla modalità di ricerca. Selezionare ingrandimento di 1,500X (0,033 micron / pixel di campione sul rivelatore) e la sfocatura di 100 micron (per aumentare il contrasto). Punto di interesse schiena Portare a centrare utilizzando bobine di spostamento immagine. </li><li> Nel modo di ricerca, regolare la dimensione dello spot e l&#39;intensità del fascio in modo che il fascio è solo più largo del dispositivo di imaging e dà una lettura pixel di ~ 20 e - / pixel (CCD) o ~ 8 e - / pixel / sec (rivelatore di elettroni diretto, modalità conteggio). </li></ol></li><li> Trovare un buon Area campione <ol><li> Inserire la griglia con mitocondri congelati-idratata nel microscopio elettronico a temperatura dell&#39;azoto liquido (fare riferimento alle istruzioni del produttore EM). </li><li> Nel modo di ricerca, cercare la griglia per le zone di spessore del ghiaccio e del campione di qualità appropriato. Prendete un 6 sec ricerca di immagini di settori promettenti per determinare l&#39;idoneità per la raccolta tomogram. Both la membrana mitocondriale interna ed esterna deve essere visibile in questo ingrandimento. </li></ol></li><li> Registrazione di un tomografica Tilt Series <ol><li> Una volta che una buona zona esemplare si trova, inclinare la fase ± 60 ° per determinare la portata massima inclinazione che è disponibile senza alcun ostacolo di esposizione o di messa a fuoco da bar griglia o grumi di ghiaccio. </li><li> Su un buco pieno di ghiaccio nelle vicinanze di aspetto simile, passare alla modalità di esposizione e regolare il tempo di intensità del fascio o l&#39;acquisizione delle immagini in modo che ogni immagine registrata ha una dose di 30-50 elettrone e - / pixel per CCD o 6-8 e - / pixel / s rivelatori di elettroni diretti, modalità di conteggio. </li><li> Calcolare il rapporto di distribuzione della dose (I 0 / I 60) dividendo il numero medio di elettroni per un&#39;immagine 1 sec acquisita a 0 ° con quella di un&#39;immagine di 60 °. Questo rapporto descrive l&#39;aumento del tempo di esposizione necessario per mantenere costante il numero di elettroni per ogni immagine con l&#39;aumentare dell&#39;angolo di inclinazione (tempo di esposizione = 1 / cos (α) n dove (I 0 / I 60) = 2 n). Il rapporto serve anche come una buona indicazione dello spessore del ghiaccio. Buone tomogrammi di mitocondri sono generalmente registrati con un I 0 / I 60 = 2,3-2,6. </li><li> Su un buco vuoto, acquisire un&#39;immagine 1 sec in modalità di esposizione e notare il conteggio elettronico per Å 2. Tenendo conto del rapporto di distribuzione della dose, calcolare il numero totale di immagini che possono essere registrate per una dose totale di elettroni specifico (ad esempio, &lt;40 e - / a 2 per la determinazione della struttura &amp; ~ 160 e - / A 2 per morfologia). </li><li> Determinare l&#39;intervallo di inclinazione appropriata per la raccolta tomografia dividendo il range di inclinazione totale (ad esempio, 120 ° per ± 60 °) per il numero totale di immagini calcolati in 3.3.4. </li></ol></li><li> Impostare e registrare un tomogramma con i parametri determinati in precedenza utilizzando il software appropriato raccolta automatica dei dati 33, 34. Serie Tilt sono di solito avviati a ± 20 ° e passare attraverso 0 ° prima di raggiungere elevate inclinazioni al fine di massimizzare il contenuto informativo delle immagini a bassa inclinazione, che viene distrutto aumentando la dose di elettroni. </li></ol> 4 Creazione e segmentazione di volumi tomografiche Questa sezione descrive come volumi tomografiche di mitocondri sono generati da serie tilt e come sono presenti per la visualizzazione generale dei volumi. <ol><li> Salvare la serie tomografico inclinazione a una directory appropriata. Generare una serie di immagini e convertire in un formato di file appropriato con il software open-source, come ad esempio dm2mrc o tif2mrc (pacchetto IMOD), che convertono .dm3, .dm4 o tif file stack MRC. pile MRC sono necessari per la ricostruzione tomografica con IMOD 35. Altri pacchetti richiedono diversi formati. </li><li> Allineare le immagini e generare un tomogramma seguendo la procedura descritta nel tutorial IMOD ( <ahref=&quot;http://bio3d.colorado.edu/imod/doc/etomoTutorial.html&quot;&gt;http://bio3d.colorado.edu/imod/doc/etomoTutorial.html ). </li><li> Migliora il contrasto del tomogramma utilizzando il filtro anisotropico diffusione non lineare distribuito con MDI. Questo filtro funziona bene per le membrane e particelle associate alla membrana, come ATP sintasi. </li><li> Per la visualizzazione, segmento manualmente il tomogramma utilizzando programmi disponibili in commercio per esempio, Amira. Assegnare voxel corrispondenti alla membrana interna o esterna e generare una superficie. Utilizzando l&#39;opzione clicker nel plugin EM-pacchetto per AMIRA 36 contrassegnare la posizione delle particelle ATP sintetasi. </li></ol> 5. Subtomogram della media dell&#39;ATP sintasi dimeri e montaggio di strutture X-Ray La sezione seguente descrive come medie subtomogram di ATP sintasi dimeri possono essere ottenuti. <ol><li> Utilizzando le particelle contrassegnate come input e un pacchetto software appropriato, come il &#39;ParteStima icolo per il programma Electron Positron &#39;, calcolare una media subtomogram. </li><li> Per un preventivo risoluzione, confrontare due medie subtomogram determinati autonomamente da Fourier shell correlazione 37. </li><li> Se disponibili, dock noto strutture a raggi X nel medio subtomogram di corpo rigido raccordo, manualmente o utilizzando le routine di docking automatico sequenziale come quelli nel programma Chimera 38. </li></ol>

Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari in competizione.

Il protocollo qui presentato fornisce un&#39;introduzione alla crio-ET e subtomogram media dei mitocondri, ma essenzialmente la stessa procedura può essere applicata a qualsiasi altro compartimento cellulare o membrana. Per ottenere i migliori dati possibili, fasi critiche nel corso della procedura sono la preparazione del campione, la strategia di acquisizione processo di congelamento tuffo e dati. Qualità del campione, che è fondamentale per il successo, dipende da un protocollo di congelamento ottimizzato per garantire lo spessore del ghiaccio adatto, che è di fondamentale importanza per il buon contrasto dell&#39;immagine. La strategia ottimale di acquisizione dati dipende dallo strumento ed il campione. Parametri da ottimizzare includono dose di elettroni per immagine, sistema di inclinazione e sfocatura. Acquisire una buona tomogramma di un buon campione rende ogni ulteriore trasformazione passaggi più facili e garantisce un risultato finale soddisfacente. Cryo-ET combinato con subtomogram media e montaggio di modello atomico fornisce dettagli su come complessi proteici sono disposti in thambiente cellulare nativo EIR. La tecnica è ideale per indagare la struttura di grandi complessi proteici di membrana, come supercomplessi catena respiratoria (1.7 MDA), dimeri ATP sintasi (2x500 kDa), o il complesso del poro nucleare (~ 120 MDA) 8, 9, 17. L&#39;organizzazione di ATP dimeri sintasi in righe non può essere osservato con tecniche ad alta risoluzione come la cristallografia a raggi X, NMR o singola particella crio-EM, perché le righe dimero sono interrotti per estrazione detergente, che è un passo necessario per l&#39;isolamento e purificazione di complessi proteici di membrana. La disposizione della ATP sintasi in file di dimeri lungo crinali creste è un principio organizzativo universale dei mitocondri in tutte le specie. I complessi protone-pompaggio della catena di trasporto degli elettroni, in particolare complesso I (NADH deidrogenasi), sono situati nelle zone di membrana lati delle righe 8,9. Questa organizzazione della catena respiratoria ha un impatto profondo sulla bioenergetica mitocondriale. Se le righe dimero non possono formare a causa dell&#39;assenza di subunità proteiche specifica-dimero, le cellule presentano tempi di generazione più lunghi e ridotta idoneità cellulare, come osservato nel mutante di lievito mostrato in Figura 3 41. Con il crescente interesse per le malattie mitocondriali, una dettagliata comprensione delle basi molecolari che governano ultrastruttura e funzione mitocondriale è di fondamentale importanza. Electron crio-tomografia fornisce un collegamento tra struttura proteica determinata mediante metodi ad alta risoluzione, e la distribuzione e la disposizione di queste proteine ​​nella membrana sulla scala dei nanometri. Questo rende crio-ET uno strumento essenziale per comprendere la struttura e la funzione mitocondriale in salute e malattia. Ulteriori sviluppi tecnici e miglioramenti in crio-ET includono strategie di proteina-etichettatura per identificare la posizione di Protein subunità in complessi macromolecolari o la posizione delle proteine ​​distinte più piccole o meno (&lt;0,5 MDA) nelle cellule. Inoltre, i metodi di lavorazione EM ibridi, che combinano subtomogram media con l&#39;analisi singola particella o ricostruzione elicoidale hanno recentemente determinato strutture proteiche a ~ 8 A 42, 43. Questi metodi di lavorazione sono attualmente limitati alle proteine ​​purificate, che sono ben separati in ghiaccio o si formano gruppi elicoidali e non sono attualmente applicabili agli ambienti cellulari affollati come i mitocondri e le membrane creste. Per la raccolta dei dati, nuovi strumenti informatici e hardware sono in fase di sviluppo per l&#39;acquisizione tomogram automatizzato, aumentare il contrasto dell&#39;immagine e ridurre la dose totale richiesta di elettroni. L&#39;unica limitazione fondamentale in crio-ET è danni da radiazioni al campione dal fascio di elettroni. Ciò significa che solo dosi molto basse di elettroni possono essere usati per registrare ogni immagine di una serie tomografica inclinazione, con conseguente scarsa segnale-trapporto che in ultima analisi, limita la risoluzione ottenibile o-rumore. I nuovi rivelatori di elettroni diretto, uscito meno di un anno fa, stanno rivoluzionando il campo di singolo-particella crio-EM 44, 45. Questi nuovi rivelatori forniscono un maggiore contrasto e una migliore risoluzione a dosi più basse di elettroni. Per elettrone crio-tomografia, questo significa che serie tilt con dimensioni di passo più piccole o addirittura tomogrammi biassiali possono essere raccolti senza preoccupazioni per i danni da radiazioni eccessive (una sola immagine CCD è equivalente a dosaggio elettronico a 5 immagini dirette rivelatore di elettroni). Le grandi quantità di dati prodotti da questi rilevatori di creare le proprie sfide nella gestione dei dati, trasformazione e stoccaggio, che dovranno essere superate. Inoltre, le piastre di fase, che lavorano su principi simili a quelli utilizzati di routine in microscopia ottica per aumentare il contrasto di fase, sono attualmente in fase di sviluppo per la microscopia elettronica a trasmissione 46, 47. Ciò dovrebbe permettere tomogrammi da rilevare più vicino al fuoco e quindi a maggiore risoluzione, mentre allo stesso tempo conservando bassa risoluzione caratteristiche necessarie per l&#39;allineamento e l&#39;interpretazione dei volumi tomografiche. Presi insieme, questi progressi tecnologici espandere notevolmente la gamma di questioni biologiche che possono essere affrontati con crio-ET.

I mitocondri sono i power-case del cellulare. Con la conversione di un gradiente protonico elettrochimico attraverso la membrana mitocondriale interna in energia legame chimico, la ATP sintetasi mitocondriale produce la maggior parte del ATP che guida i processi cellulari. Al fine di comprendere i meccanismi che stanno dietro la conversione di energia mitocondriale, abbiamo bisogno di determinare la struttura della ATP sintasi in situ, e per scoprire come è organizzato e distribuito nella membrana mitocondriale interna. Sebbene strutture ad alta risoluzione della maggior parte dei componenti mitocondriali ATP sintasi 1-3 e cartine bassa risoluzione dell&#39;intero complesso 4 sono disponibili, è importante stabilire la struttura e conformazione dell&#39;enzima di lavoro nella membrana. La distribuzione della ATP sintasi nella membrana mitocondriale interna è stato ampiamente ipotizzato essere casuale, ma uno dei primi 5 e trovare i nostri risultati iniziali 6 indicato che questo non è tche caso. Studi successivi del nostro gruppo e altri 7 hanno confermato che l&#39;ATP sintasi è organizzato in lunghe file di dimeri lungo i crinali strettamente curve della membrana mitocondriale interna creste 8, mentre le pompe protoniche della catena di trasporto degli elettroni sembrano essere situato su entrambi i lati delle file 9. Questa disposizione ha importanti implicazioni per i meccanismi di conversione energetica mitocondriale. La tecnica che abbiamo utilizzato per determinare tale disposizione è crio-elettroni tomografia (crio-ET). Cryo-ET è attualmente l&#39;unico metodo che fornisce accurate tridimensionale (3D) I volumi delle cellule, compartimenti cellulari o organuli a risoluzione molecolare. Cryo-ET è particolarmente adatto per studiare i grandi complessi di membrane biologiche, perché le membrane appaiono con un buon contrasto e sono facili da tracciare in volumi tomografiche 3D. Altri metodi per studiare la struttura 3D delle cellule o organelles non forniscono dettagli molecolare. Super-risoluzione microscopia ottica 10, 11 è eccellente a rivelare la posizione o distanze tra etichette luminescenti collegati a proteine ​​di interesse con una precisione di decine di nm, ma non rivela la struttura della proteina stessa, anche a bassa risoluzione . Microscopia elettronica a trasmissione di sezioni seriali di 12 o di imaging block-face da microscopia elettronica a scansione 13 di campioni biologici di plastica-embedded offrono viste a bassa risoluzione di volumi cellulari, ma allo stesso modo non rivelano dettaglio molecolare. Microscopia a forza atomica 14 può in linea di principio di fornire risoluzione molecolare o atomica, ma solo alla superficie degli oggetti su un atomicamente piatta sostegno, solido. Infine, tomografia a raggi X 15 o dispersione di impulsi di raggi X intensi da laser ad elettroni liberi 16 è improbabile per rivelare la struttura di grandi e complessi, oggetti aperiodici come le cellule intere o organelli a mRisoluzione olecular nel prossimo futuro. Quindi allo stato attuale, non vi è alcuna alternativa al crio-ET per studi sulla struttura 3D di cellule o organuli a risoluzione nanometrica. Cryo-ET è il metodo di scelta per l&#39;esame della struttura e la conformazione dei gruppi di proteine ​​associate alla membrana, tra cui il complesso del poro nucleare 17, il picco dell&#39;influenza complessi 18, e flagelli proteine ​​motrici 22, 23 ma anche l&#39;organizzazione di intere cellule batteriche 19 e l&#39;entrata di virus patogeni come l&#39;HIV nelle cellule 20-23. Cryo-ET ha un valore inestimabile per la visualizzazione di proteine ​​filamentose e le loro interazioni nella cellula, compresi i filamenti di actina 24 o axonemes 25. La risoluzione può essere migliorata a 2 nm o meglio subtomogram media di 26, in base al quale subvolumes di ripetute, lineamenti regolari sono tagliati fuori da un volume tomografica e media per singola particella Image Protecniche di lavorazione. Cryo-ET comporta l&#39;acquisizione di una serie di immagini di proiezione di un esemplare sottile (&lt;250nm) prese a diversi angoli di inclinazione in un microscopio elettronico a trasmissione (TEM). Il campione deve essere sottile in modo che gli elettroni, che interagiscono fortemente con la materia, sono sparsi in non più di una volta. Scattering multiplo rende le immagini risultanti difficili da interpretare e riduce il contrasto. Immagini dell&#39;area campione selezionato sono allineati l&#39;uno rispetto all&#39;altro e proiettati in uno spazio 3D da un programma per computer adatto, generando un volume 3D del campione. L&#39;allineamento delle immagini è aiutata da marker fiduciali oro, che si mescolano con il campione prima del congelamento. Marker fiduciali Idealmente 10 o più equamente distribuiti dovrebbero essere presenti in ogni immagine per ottenere un buon allineamento. Per osservare dettaglio molecolare, i campioni sono tuffo congelati in etano liquido, che conserva il loro stato idratato nativo. Congelamento di liquidoetano è così veloce (~ 10 5 ° C / sec) 27 che l&#39;acqua non cristallizza, ma rimane in uno stato simile al vetro vetrificato. Cristalli di ghiaccio danneggia formazione strutture biologiche sensibili. Come campioni biologici soffrono di danni da radiazioni, c&#39;è un limite al numero totale di eventi di scattering il campione può tollerare. Le immagini vengono quindi acquisiti in modalità a basso dosaggio: Una zona di interesse è identificata a basso ingrandimento (1,500X) con una dose inferiore a 1 elettrone e - / nm 2 (modalità di ricerca). L&#39;immagine viene poi messo a fuoco con un ingrandimento maggiore, l&#39;area di interesse (modalità di messa a fuoco). Solo quando l&#39;immagine viene acquisita, l&#39;area di interesse viene irradiata con una dose elevata di elettroni (modo di esposizione). Qui, vi presentiamo una panoramica di come raccogliere e di elettroni processo di crio-tomografie, utilizzando ATP sintasi dimeri nella membrana mitocondriale interna come un esempio. Il seguente protocollo descrive come preparare i mitocondri per crio-ET, come impostaree raccogliere una serie di inclinazione con una dose specifica di elettroni totale, e come elaborare la serie di inclinazione per ottenere un volume 3D della zona di interesse. Una panoramica della procedura è illustrata nella figura 1.

<table><tbody><tr><td>Saccarosio</td><td>Roth</td><td>4621.2</td><td></td></tr><tr><td>Trealosio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T9449</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3375</td><td></td></tr><tr><td>Zimalosi</td><td>biomol</td><td>Z1000.1</td><td></td></tr><tr><td>Gradiente di densità medio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D1556 o P1644</td><td></td></tr><tr><td>Proteina A oro</td><td>Aurion</td><td>810.111</td><td>10 nm</td></tr><tr><td>Ethane</td><td>Air Liquide</td><td>P0502S02R0A001</td><td></td></tr><tr><td>Azoto</td><td>Air Liquide</td><td>I4150RG</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Consumables</td></tr><tr><td>Carta da filtro</td><td>Whatman, GE Healthcare</td><td>1004 090</td><td>Nr 4</td></tr><tr><td>Pinzette</td><td>Dumont</td><td>T506</td><td>Non magnetico, modello #5</td></tr><tr><td>Griglia di prova combinata EM</td><td>Plano GmbH</td><td>S142</td><td>grapite e isole d'oro su film di carbonio holey</td></tr><tr><td>Griglie in carbonio Holey</td><td>Quantifoil Micro Tools GmbH o C-flat</td><td></td><td>R2/2 300 Cu mesh</td></tr><tr><td>Scatole a griglia</td><td>Cryo Plano GmbH</td><td>160-42</td><td>Scatole metalliche alternative fatte in casa</td></tr><tr><td>Potter</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P7984</td><td></td></tr><tr><td>Blender</td><td>Waring</td><td>8011S</td><td></td></tr><tr><td>Mulino per perline di vetro - battitore di perline</td><td>BioSpec Prodotti</td><td>1107900-105</td><td>Incluse perline da 0,5 mm</td></tr><tr><td>Omogeneizzatore con cuscinetti a sfera (Balch)</td><td>Centrifuga isobiotec</td><td>H8</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Thermo Scientific</td><td>46915</td><td>Sorvall RC6+</td></tr><tr><td>Apparecchio a scarica a bagliore</td><td>Bal-Tec A.G.</td><td>CTA 010</td><td></td></tr><tr><td>Dispositivo di vetrificazione a griglia</td><td>FEI, Gatan o Leica</td><td></td><td>Stantuffo alternativo fatto in casa</td></tr><tr><td>Microscopio elettronico a trasmissione</td><td>FEI o Jeol</td><td></td><td>300 keV</td></tr><tr><td>Rivelatore diretto di elettroni</td><td>Gatan</td><td>K2 summit</td><td>4k x 4k pixel, modalità contata</td></tr><tr><td>Dispositivo ad accoppiamento di carica (CCD)</td><td>Gatan</td><td>US4000</td><td>4k x 4k pixel (alternativa al rivelatore diretto di elettroni)</td></tr><tr><td>Filtro energetico</td><td>Gatan o Jeol</td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Software</td></tr><tr><td>Software di acquisizione immagini</td> Software di acquisizione tomogrammi <td>Gatan</td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>, FEI, USCF o UC-Boulder</td><td></td><td>4 alternative</td></tr> Software <tr><td>di elaborazione tomogrammi</td><td>FEI, UCSF o UC-Boulder</td><td></td><td>3</td></tr><tr><td>Subtomogram media software</td><td>UC-Boulder, o Università di Basilea</td><td></td><td>2 alternative</td></tr><tr><td>Software di visualizzazione Tomogramma</td><td>UC-Boulder, FEI, o University of Utah</td><td></td><td>3 alternative</td></tr><tr><td>Software di visualizzazione Goethe</td><td>university</td><td></td><td>http://www.biophys.uni-frankfurt.de/frangakis/</td></tr> <tr><td>Software di visualizzazione</td><td>UCSF</td><td></td><td>http://www.cgl.ucsf.edu/chimera/</td></tr> <tr><td>Software di calcolo numerico</td><td>MathWorks</td><td></td><td>http://www.mathworks.de/academia/</td></tr></tbody></table>

visualizzazione di atp sintetasi dimeri nei mitocondri da electron cryo-tomografia

Visualization of ATP Synthase Dimers in Mitochondria by Electron Cryo-tomography

Electron crio-tomografia è un potente strumento per la biologia strutturale, in grado di visualizzare la struttura tridimensionale di campioni biologici, come le cellule, organelli, vescicole di membrana, o virus al dettaglio molecolare. Per raggiungere questo obiettivo, il campione acquoso viene rapidamente vetrificato in etano liquido, che conserva in uno stato congelato-idratata close-to-native. Nel microscopio elettronico, serie inclinazione sono rilevati alla temperatura dell&#39;azoto liquido, da cui tomografie 3D sono ricostruiti. Il rapporto segnale-rumore del volume tomografica è intrinsecamente bassa. Riconoscibile, caratteristiche ricorrenti sono arricchite da subtomogram media, con la quale i singoli subvolumes sono tagliati fuori, allineati e media per ridurre il rumore. In questo modo, le mappe 3D con una risoluzione di 2 nm o migliore può essere ottenuto. Una forma di strutture ad alta risoluzione disponibili al volume 3D allora produce modelli atomici di complessi di proteine ​​nel loro ambiente nativo. Qui mostriamo come usiamo elettrone crio-tomograpHY per studiare in situ organizzazione di grandi complessi proteici di membrana in mitocondri. Troviamo che sintasi ATP sono organizzati in file di dimeri lungo apici molto curve della membrana interna creste, mentre io complesso è distribuito in modo casuale nelle regioni di membrana su entrambi i lati delle righe. Con subtomogram media abbiamo ottenuto una struttura mitocondriale ATP sintasi dimero all&#39;interno della membrana creste.

Electron crio-tomografie di mitocondri rivelano chiaramente la morfologia 3D del organello (Figura 2). Segmentazione manuale delle membrane in un volume tomografica illustra la struttura delle creste in un mitocondrio. Con l&#39;imaging mitocondri provenienti da diversi ceppi di lievito eliminazione diretta che mancano alcuni componenti proteiche, l&#39;effetto di queste proteine ​​su creste morfologia può venire valutato. Figura 3 mostra un mitocondrio da un ceppo di lievito privo di ATP sintetasi subunità e. Questo componente è necessario del complesso ATP sintasi per la dimerizzazione della ATP sintasi mitocondriale. I mitocondri da questo ceppo manca la normale lamellare creste dei mitocondri di tipo selvatico (Figura 2) e invece contiene una serie di compartimenti membrana interna. Questi comparti sono o privi di creste o contengono piccole invaginazioni di membrana a forma di palloncino (Figura 3). In tomograms con un buon contrasto, grandi complessi di proteine ​​mitocondriali, in questo caso ATP sintasi dimeri, sono facilmente visibili (figura 4; Movie 1). Le strutture dei complessi possono essere determinati a 2-3 nm risoluzione da subtomogram media (figura 5; Movie 2). I volumi medi possono essere riposti nella tomografia per valutare l&#39;organizzazione dei singoli complessi rispetto all&#39;altro e ad altri complessi proteici nella membrana (Figura 6; film 3). <img alt="Figura 1" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51228/51228fig1highres.jpg" width="500" /> Figura 1 Flow-chart che mostra le fasi di elettroni crio-tomografia. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51228/51228fig1highres.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere l&#39;immagine ingrandita.</a> Figura 2 Morfologia di un mitocondrio di tipo selvatico S. Cerevisiae. Fetta centrale attraverso un volume tomografica di un tipo selvatico S. mitocondrio cerevisiae (a sinistra) e il corrispondente volume-superficie di rendering (a destra). Il volume segmentato della membrana esterna è visualizzata in grigio e volumi del limite interno e creste membrane in azzurro. Adattato da Davies et al 8. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51228/51228fig2highres.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere l&#39;immagine ingrandita.</a> <img alt="Figura 3" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51228/51228fig3highres.jpg" width="500" /> Figura 3 mitocondrio da una S. Cerevisiae ceppo manca una subunità necessarie perATP sintasi dimerizzazione. Tagliate attraverso il volume tomografica (a sinistra), che accompagna il volume-superficie di rendering (a destra) di un mitocondrio da una S. Cerevisiae ceppo manca la proteina subunità e necessario per l&#39;ATP sintasi dimerizzazione. Quando confrontato con la figura 2, il mitocondrio dal ceppo mutante manca la normale lamellare creste dei mitocondri tipo selvatico. Invece, il mitocondrio ha molti compartimenti di membrana interna sia con senza creste o creste a forma di palloncino. Così elettrone crio-tomografia evidenzia alterazioni della morfologia della membrana a causa di delezioni geniche. Adattato da Davies et al 8. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51228/51228fig3highres.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere l&#39;immagine ingrandita.</a> <img alt="Figura 4" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51228/51228fig4highres.jpg" width="500" /> Figure 4 mitocondrio dal fungo P. anserina. Affettare attraverso il volume tomografica (a sinistra) e di volume-superficie di rendering di accompagnamento (a destra) di un mitocondrio dal fungo filamentoso P. anserina. In questo tomogramma, filari di 10 particelle nm (frecce gialle) si trovano sopra le creste molto curve di membrana in membrana creste interna (vedi filmato 1). Queste particelle sono state identificate come dimeri ATP sintasi di subtomogram media. Da Davies et al 9. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51228/51228fig4highres.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere l&#39;immagine ingrandita.</a> <img alt="Figura 5" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51228/51228fig5highres.jpg" width="500" /> Figura 5 Struttura e organizzazione della ATP sintasi mitocondriale. Laterale e vista dall&#39;alto che mostra la densità elettronica di un dimero ATP sintasi da S. c<html> erevisiae come determinato dal subtomogram media con modelli atomici a muro (a sinistra). Mitocondriale vescicola membrana interna che mostra l&#39;organizzazione di ATP sintasi dimeri in righe (a destra). Il dato è stato generato posizionando la media subtomogram della sintasi dimero ATP nel volume segmentato della vescicola membrana, utilizzando le coordinate calcolate durante media. Adattato da Davies et al 8. Modelli atomici: F 1 / rotore-ring [PDB: 2WPD] 39 (blu e viola); oligomicina sensitive conferendo proteina-OSCP [PDB: 2BO5] 40 (verde); frammento gambo periferico [PDB: 2CLY] 1 con residui N-terminali da [PDB: 2WSS] 2 (giallo e rosso) (vedi Movie 2). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51228/51228fig6highres.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere l&#39;immagine ingrandita.</a> <html> _upload / 51228 / 51228fig6highres.jpg &quot;width =&quot; 500 &quot;/&gt; Figura 6 Isolato Crista vescicola da un P. anserina mitocondrio. Fette da un volume tomografica (a sinistra) e di volume-superficie di rendering di accompagnamento (a destra) di una vescicola crista da P. anserina. Densità di proteine ​​che sporgono dalla membrana sono chiaramente visibili. Le densità indicati da frecce gialle sono dimeri ATP sintetasi, come individuate dalla subtomogram media. Frecce verdi indicano densità individuati mediante l&#39;etichettatura degli anticorpi come NADH deidrogenasi (complesso 1, per i dettagli vedere 9). Segmentazione delle densità di proteine ​​rivela la loro organizzazione in creste, con i dimeri ATP sintasi (rosso e giallo) che formano righe lungo i crinali creste molto curve e complessi NADH deidrogenasi (verdi) nelle regioni di membrana su entrambi i lati delle righe (vedi Movie 3). Da Davies et al 9.28 / 51228fig7highres.jpg &quot;target =&quot; _blank &quot;&gt; Clicca qui per vedere l&#39;immagine ingrandita. Movie 1 Electron crio-tomogramma di un P. anserina mitocondrio. Il filmato mostra le fette successive attraverso un volume tomografica presa di un mitocondrio dal fungo filamentoso P. anserina. Righe di ATP sintasi sono indicati da frecce gialle. Il volume segmentato superficie rendering mostra la posizione di ATP sintasi (sfere gialle) in relazione alla struttura creste 3D. Membrana esterna, grigio; membrana limite interno, blu trasparente; creste membrane, blu opaco. Da Davies et al 9. Vedere anche la Figura 4. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51228/movie1.mp4" target="_blank">Clicca qui per vedere il video.</a> Movie 2 media Subtomogram della sintasi mitocondriale dimero ATP da S. Cerevisiae con modelli atomici a muro. La media è statacalcolata da 121 subvolumes. La densità viene visualizzata a tre livelli di contorno: 1s - maglia, 2s - grigio chiaro e 3s - grigio scuro. Modelli atomici sono stati montati nella densità utilizzando la routine in forma sequenziale in Chimera. Modelli atomici: F 1 / rotore-ring [PDB: 2WPD] 39 (blu e viola); oligomicina sensitive conferendo proteina-OSCP [PDB: 2BO5] 40 (verde); frammento gambo periferico [PDB: 2CLY] 1 con residui N-terminali da [PDB: 2WSS]. 2 (giallo e rosso) <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51228/movie2.mov" target="_blank">Clicca qui per vedere il video.</a> Adattato da Davies et al 8. Vedere anche Figura 5. Movie 3 Isolati creste vescicola da un P. anserina mitocondrio. fette successive attraverso il volume tomografica sono presenti, seguito dal volume-superficie resi segmentato. Densità di proteine ​​sporgenti dal membrane sono chiaramente visibili. Densità rossi e gialli sono dimeri ATP sintetasi. Densità verdi sono NADH deidrogenasi (complesso I), come determinato mediante l&#39;etichettatura degli anticorpi. Da Davies et al 9. Vedere anche Figura 6. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51228/movie3.mpg" target="_blank">Clicca qui per vedere il video.</a>

Vi presentiamo un protocollo di come raccogliere e elettrone processo di crio-tomografie di tutta mitocondri. La tecnica fornisce approfondimenti dettagliati sulla struttura, funzione, e l&#39;organizzazione di grandi complessi proteici di membrana nelle membrane biologiche autoctone.

Visualizzazione di ATP sintetasi Dimeri nei mitocondri da Electron Cryo-tomografia

Electron cryo-tomography is a powerful tool in structural biology, capable of visualizing the three-dimensional structure of biological samples, such as ...

L'obiettivo generale di questo procedimento è determinare la struttura e l'organizzazione delle proteine mitocondriali in C two. Questo viene raggiunto innanzitutto generando una griglia per microscopia elettronica vitrificata contenente il campione. Successivamente, viene registrata una serie di inclinazioni con dose limitata del campione in un microscopio elettronico criogenico.Successivamente, la serie di inclinazioni viene elaborata per generare un volume tomografico. Infine, le densità proteiche vengono mediate per determinare la struttura delle proteine e le membrane vengono segmentate per rivelarne la struttura tridimensionale. Riposizionando le medie delle proteine all'interno delle tomografie di Tom Graham, viene rivelata la struttura e l'organizzazione delle proteine nella membrana.Praticchiamo la tomografia crioelettronica dei mitocondri perché vogliamo comprendere il loro funzionamento a livello molecolare. Il vantaggio principale di questa tecnica rispetto ad altri metodi, come la microscopia elettronica di sezioni sottili in plastica, è che la risoluzione è più elevata. Il materiale non viene fissato chimicamente in alcun modo e i dettagli molecolari delle proteine vengono preservati.La tecnica della criotomografia elettronica può richiedere del tempo per essere padroneggiata, ma gli utenti esperti possono acquisire da cinque a sei buone tomografie di qualità per sessione. La parte più difficile della procedura consiste nel produrre griglie congelate idratate con uno spessore ottimale del ghiaccio. Dopo aver isolato e centrifugato i mitocondri, secondo il protocollo descritto, utilizzare 250 millimolar T triosi in 10 millimolar HEPA buffer per risospendere il pellet a una concentrazione di circa cinque milligrammi per millilitro di proteina totale. Sottoporre a glow discharge griglie EM in carbonio, con il lato in carbonio rivolto verso l'alto, in un dispositivo a vuoto seguendo le istruzioni del produttore. Liquefare alcuni millilitri di etano indirizzando un flusso di gas etano sulla superficie interna di un contenitore in alluminio raffreddato con azoto liquido.Utilizzare un paio di pinzette per prendere una griglia DM sottoposta a glow discharge e posizionarla sul banco. Mescolare la proteina con una sospensione di marcatori aurei coniugati in rapporto uno a uno con la sospensione mitocondriale e applicare immediatamente tre microlitri della soluzione sulla griglia. Successivamente, inserire le pinzette in un dispositivo di vetrificazione, ad esempio una ghigliottina fatta in casa, con un cuneo di carta filtro per asportare il liquido in eccesso dalla griglia e rilasciare l'innesto per immergere immediatamente la griglia nell'etano liquido. Quindi trasferire la griglia dall'etano liquido all'azoto liquido.Rimuovere l'eccesso di etano dalla griglia posizionando la punta di una nuova striscia di carta da filtro nell'etano liquido. Mentre il liquido risale, trascinare delicatamente la griglia lungo la carta da filtro, mantenendola al di sotto del fronte liquido, quindi trasferirla immediatamente in azoto liquido per conservarla per un uso successivo. Posizionare la griglia in una scatola per griglie e conservarla in un contenitore riempito di azoto liquido per registrare una serie tomografica con inclinazione.Cominciare verificando che i contenitori di azoto liquido siano pieni e controllare che la temperatura dello stadio del campione e del dispositivo di trasferimento delle griglie sia inferiore a 100 kelvin. Verificare che il microscopio elettronico sia correttamente allineato acquisendo un'immagine di una griglia di prova e controllando la qualità degli anelli di diffrazione; gli anelli dovrebbero essere rotondi ed estendersi fino al bordo dell'immagine. Successivamente, inserire una griglia con mitocondri congelati in stato idratato.Quindi, in modalità di ricerca, cercare aree con spessore del ghiaccio e qualità del campione adeguati. Acquisire un'immagine di ricerca di sei secondi di aree promettenti per determinarne l'idoneità alla raccolta dati. Dopo aver individuato un'area campione adatta, inclinare la platina di più o meno 60 gradi per determinare l'intervallo massimo di inclinazione disponibile senza ostruzioni della zona di esposizione o messa a fuoco da parte delle sbarrette della griglia o dei cristalli di ghiaccio in un foro vicino pieno di ghiaccio e di aspetto simile, passare alla modalità di esposizione e regolare l'intensità del fascio o il tempo di acquisizione dell'immagine.Pertanto, ogni immagine registrata ha una dose di elettroni compresa tra 30 e 50 elettroni per pixel per i CCD oppure tra sei e otto elettroni per pixel al secondo. Per i rivelatori diretti di elettroni, calcolare il rapporto di distribuzione della dose, o I zero su I 60, dividendo il conteggio medio di elettroni per un'immagine di un secondo acquisita a zero gradi per quello di un'immagine di 60 gradi su un foro vuoto. Acquisire un'immagine di un secondo in modalità esposizione e annotare il conteggio di elettroni per ångström quadrato.Considerando il rapporto di distribuzione della dose, calcolare il numero totale di immagini e l'intervallo di inclinazione che possono essere registrati per una specifica dose totale di elettroni utilizzando un software appropriato per la raccolta automatica dei dati. Configurare e registrare una Tom Agram con i parametri appena determinati, tipici delle tomografie. Per questi campioni, iniziare a più o meno 20 gradi e passare attraverso zero gradi prima di raggiungere alte inclinazioni.Per creare e segmentare tomogrammi, convertire la serie di inclinazioni in un formato di file appropriato per il software di ricostruzione. Utilizzando un programma di ricostruzione Tom Graham come Im mod, allineare le immagini segnando la posizione dei marcatori fiduciali d'oro. Una volta allineate, generare un Tommo Graham.Incrementare il contrasto della tomografia di Graham utilizzando un filtro d'immagine come il filtro di diffusione anisotropa non lineare distribuito con IM o per la visualizzazione. Utilizzare programmi disponibili in commercio per segmentare manualmente la tomografia. Assegnare i voxel corrispondenti alla membrana interna ed esterna a strati separati; una volta assegnati, creare una superficie per visualizzare le membrane.Utilizzando l'opzione clicker nel plugin EM package per emira, segnare la posizione delle particelle di TP sintasi usando le particelle marcate come input e un pacchetto software appropriato come la stima delle particelle. Per il programma di tomografia elettronica, calcolare una media dell'agram per una stima della risoluzione. Calcolare la correlazione tra guscio foyer tra due medie sub-tommo determinate indipendentemente usando il programma di visualizzazione gratuito.Le chimere sono adattate alle strutture a raggi X note all'interno della media sub-Tom Agram, prima manualmente e poi automaticamente con il comando "fit", come mostrato in questa figura. La segmentazione manuale delle membrane in una criotomografia elettronica mitocondriale rivela la struttura delle creste in un mitocondrio. Mediante l'analisi di mitocondri provenienti da ceppi di lievito con knockout di proteine specifiche, è possibile valutare l'effetto di tali proteine sulla morfologia delle creste.Qui è mostrato un mitocondrio di un ceppo di lievito privo della subunità E della sintesi della TP, necessaria per la formazione dei dimeri della TP sintetasi. A differenza delle normali creste dei mitocondri di tipo selvatico, questi organelli contengono invece numerose strutture della membrana interna che o sono prive di creste o presentano piccole invaginazioni a forma di palloncino. In immagini con un buon contrasto, i dimeri della TP sintetasi sono facilmente visibili, come indicato qui dalle frecce gialle.Segmentando le membrane, la localizzazione della sintesi di ATP, ora rappresentata dalla sfera gialla, può essere visualizzata in relazione alla morfologia delle creste. In questo caso, la sintesi di ATP forma file di dimeri lungo i bordi fortemente curvi delle creste mitocondriali. La media delle sotto-tomografie consente di determinare la struttura delle proteine a risoluzioni di quattro nanometri o migliori. Adattando strutture a raggi X note all'interno della media della sotto-tomografia, è possibile assemblare modelli atomici di complessi proteici nel loro ambiente nativo, come mostrato.In questo esempio, i volumi medi possono essere reinseriti nel Tomo Graham per facilitare l'organizzazione dei singoli complessi relativamente tra loro e rispetto ad altri complessi proteici nella membrana. Il nostro protocollo dimostra come è possibile utilizzare la tomografia crioelettronica per determinare la struttura e l'organizzazione dei complessi proteici all'interno della membrana mitocondriale interna. Questo protocollo può essere utilizzato anche per determinare la struttura e l'organizzazione di altre proteine associate alla membrana in diversi compartimenti cellulari.La preparazione del campione è fondamentale per ottenere termogrammi di buona qualità. La griglia idratata congelata deve contenere ghiaccio perfettamente vetreo con uno spessore compreso tra 70 e 150 nanometri. Di norma, si esaminano da cinque a sei griglie finché non si individua un'area con spessore ottimale del ghiaccio e qualità ideale del campione.Per la raccolta di tomogrammi, è ideale un microscopio elettronico a trasmissione da 300 chilovolt dotato di stadio criogenico dedicato, filtro energetico e fotocamera con rilevatore elettronico diretto, ma si può utilizzare anche uno strumento da 200 chilovolt con stadio criogenico ad inserimento laterale e una fotocamera CCD. Dopo aver visto questo video, si dovrebbe avere una buona comprensione delle modalità di preparazione di una griglia criogenica, raccolta di una serie di inclinazioni, ricostruzione del tomogramma e calcolo di una media sub-tomografica.Queste sono le competenze di base necessarie per studiare come l'organizzazione delle proteine all'interno di una cellula influisce sulla capacità della cellula stessa di svolgere funzioni biologiche, come la sintesi efficiente di ATP. Non dimenticare che lavorare con azoto liquido ed etano liquido può essere molto pericoloso e che occhiali di sicurezza e guanti devono essere indossati in ogni momento.

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