Visualizzazione di ATP sintetasi Dimeri nei mitocondri da Electron Cryo-tomografia

L'obiettivo generale di questo procedimento è determinare la struttura e l'organizzazione delle proteine mitocondriali in C two. Questo viene raggiunto innanzitutto generando una griglia per microscopia elettronica vitrificata contenente il campione. Successivamente, viene registrata una serie di inclinazioni con dose limitata del campione in un microscopio elettronico criogenico.

Successivamente, la serie di inclinazioni viene elaborata per generare un volume tomografico. Infine, le densità proteiche vengono mediate per determinare la struttura delle proteine e le membrane vengono segmentate per rivelarne la struttura tridimensionale. Riposizionando le medie delle proteine all'interno delle tomografie di Tom Graham, viene rivelata la struttura e l'organizzazione delle proteine nella membrana.

Praticchiamo la tomografia crioelettronica dei mitocondri perché vogliamo comprendere il loro funzionamento a livello molecolare. Il vantaggio principale di questa tecnica rispetto ad altri metodi, come la microscopia elettronica di sezioni sottili in plastica, è che la risoluzione è più elevata. Il materiale non viene fissato chimicamente in alcun modo e i dettagli molecolari delle proteine vengono preservati.

La tecnica della criotomografia elettronica può richiedere del tempo per essere padroneggiata, ma gli utenti esperti possono acquisire da cinque a sei buone tomografie di qualità per sessione. La parte più difficile della procedura consiste nel produrre griglie congelate idratate con uno spessore ottimale del ghiaccio. Dopo aver isolato e centrifugato i mitocondri, secondo il protocollo descritto, utilizzare 250 millimolar T triosi in 10 millimolar HEPA buffer per risospendere il pellet a una concentrazione di circa cinque milligrammi per millilitro di proteina totale. Sottoporre a glow discharge griglie EM in carbonio, con il lato in carbonio rivolto verso l'alto, in un dispositivo a vuoto seguendo le istruzioni del produttore. Liquefare alcuni millilitri di etano indirizzando un flusso di gas etano sulla superficie interna di un contenitore in alluminio raffreddato con azoto liquido.

Utilizzare un paio di pinzette per prendere una griglia DM sottoposta a glow discharge e posizionarla sul banco. Mescolare la proteina con una sospensione di marcatori aurei coniugati in rapporto uno a uno con la sospensione mitocondriale e applicare immediatamente tre microlitri della soluzione sulla griglia. Successivamente, inserire le pinzette in un dispositivo di vetrificazione, ad esempio una ghigliottina fatta in casa, con un cuneo di carta filtro per asportare il liquido in eccesso dalla griglia e rilasciare l'innesto per immergere immediatamente la griglia nell'etano liquido. Quindi trasferire la griglia dall'etano liquido all'azoto liquido.

Rimuovere l'eccesso di etano dalla griglia posizionando la punta di una nuova striscia di carta da filtro nell'etano liquido. Mentre il liquido risale, trascinare delicatamente la griglia lungo la carta da filtro, mantenendola al di sotto del fronte liquido, quindi trasferirla immediatamente in azoto liquido per conservarla per un uso successivo. Posizionare la griglia in una scatola per griglie e conservarla in un contenitore riempito di azoto liquido per registrare una serie tomografica con inclinazione.

Cominciare verificando che i contenitori di azoto liquido siano pieni e controllare che la temperatura dello stadio del campione e del dispositivo di trasferimento delle griglie sia inferiore a 100 kelvin. Verificare che il microscopio elettronico sia correttamente allineato acquisendo un'immagine di una griglia di prova e controllando la qualità degli anelli di diffrazione; gli anelli dovrebbero essere rotondi ed estendersi fino al bordo dell'immagine. Successivamente, inserire una griglia con mitocondri congelati in stato idratato.

Quindi, in modalità di ricerca, cercare aree con spessore del ghiaccio e qualità del campione adeguati. Acquisire un'immagine di ricerca di sei secondi di aree promettenti per determinarne l'idoneità alla raccolta dati. Dopo aver individuato un'area campione adatta, inclinare la platina di più o meno 60 gradi per determinare l'intervallo massimo di inclinazione disponibile senza ostruzioni della zona di esposizione o messa a fuoco da parte delle sbarrette della griglia o dei cristalli di ghiaccio in un foro vicino pieno di ghiaccio e di aspetto simile, passare alla modalità di esposizione e regolare l'intensità del fascio o il tempo di acquisizione dell'immagine.

Pertanto, ogni immagine registrata ha una dose di elettroni compresa tra 30 e 50 elettroni per pixel per i CCD oppure tra sei e otto elettroni per pixel al secondo. Per i rivelatori diretti di elettroni, calcolare il rapporto di distribuzione della dose, o I zero su I 60, dividendo il conteggio medio di elettroni per un'immagine di un secondo acquisita a zero gradi per quello di un'immagine di 60 gradi su un foro vuoto. Acquisire un'immagine di un secondo in modalità esposizione e annotare il conteggio di elettroni per ångström quadrato.

Considerando il rapporto di distribuzione della dose, calcolare il numero totale di immagini e l'intervallo di inclinazione che possono essere registrati per una specifica dose totale di elettroni utilizzando un software appropriato per la raccolta automatica dei dati. Configurare e registrare una Tom Agram con i parametri appena determinati, tipici delle tomografie. Per questi campioni, iniziare a più o meno 20 gradi e passare attraverso zero gradi prima di raggiungere alte inclinazioni.

Per creare e segmentare tomogrammi, convertire la serie di inclinazioni in un formato di file appropriato per il software di ricostruzione. Utilizzando un programma di ricostruzione Tom Graham come Im mod, allineare le immagini segnando la posizione dei marcatori fiduciali d'oro. Una volta allineate, generare un Tommo Graham.

Incrementare il contrasto della tomografia di Graham utilizzando un filtro d'immagine come il filtro di diffusione anisotropa non lineare distribuito con IM o per la visualizzazione. Utilizzare programmi disponibili in commercio per segmentare manualmente la tomografia. Assegnare i voxel corrispondenti alla membrana interna ed esterna a strati separati; una volta assegnati, creare una superficie per visualizzare le membrane.

Utilizzando l'opzione clicker nel plugin EM package per emira, segnare la posizione delle particelle di TP sintasi usando le particelle marcate come input e un pacchetto software appropriato come la stima delle particelle. Per il programma di tomografia elettronica, calcolare una media dell'agram per una stima della risoluzione. Calcolare la correlazione tra guscio foyer tra due medie sub-tommo determinate indipendentemente usando il programma di visualizzazione gratuito.

Le chimere sono adattate alle strutture a raggi X note all'interno della media sub-Tom Agram, prima manualmente e poi automaticamente con il comando "fit", come mostrato in questa figura. La segmentazione manuale delle membrane in una criotomografia elettronica mitocondriale rivela la struttura delle creste in un mitocondrio. Mediante l'analisi di mitocondri provenienti da ceppi di lievito con knockout di proteine specifiche, è possibile valutare l'effetto di tali proteine sulla morfologia delle creste.

Qui è mostrato un mitocondrio di un ceppo di lievito privo della subunità E della sintesi della TP, necessaria per la formazione dei dimeri della TP sintetasi. A differenza delle normali creste dei mitocondri di tipo selvatico, questi organelli contengono invece numerose strutture della membrana interna che o sono prive di creste o presentano piccole invaginazioni a forma di palloncino. In immagini con un buon contrasto, i dimeri della TP sintetasi sono facilmente visibili, come indicato qui dalle frecce gialle.

Segmentando le membrane, la localizzazione della sintesi di ATP, ora rappresentata dalla sfera gialla, può essere visualizzata in relazione alla morfologia delle creste. In questo caso, la sintesi di ATP forma file di dimeri lungo i bordi fortemente curvi delle creste mitocondriali. La media delle sotto-tomografie consente di determinare la struttura delle proteine a risoluzioni di quattro nanometri o migliori. Adattando strutture a raggi X note all'interno della media della sotto-tomografia, è possibile assemblare modelli atomici di complessi proteici nel loro ambiente nativo, come mostrato.

In questo esempio, i volumi medi possono essere reinseriti nel Tomo Graham per facilitare l'organizzazione dei singoli complessi relativamente tra loro e rispetto ad altri complessi proteici nella membrana. Il nostro protocollo dimostra come è possibile utilizzare la tomografia crioelettronica per determinare la struttura e l'organizzazione dei complessi proteici all'interno della membrana mitocondriale interna. Questo protocollo può essere utilizzato anche per determinare la struttura e l'organizzazione di altre proteine associate alla membrana in diversi compartimenti cellulari.

La preparazione del campione è fondamentale per ottenere termogrammi di buona qualità. La griglia idratata congelata deve contenere ghiaccio perfettamente vetreo con uno spessore compreso tra 70 e 150 nanometri. Di norma, si esaminano da cinque a sei griglie finché non si individua un'area con spessore ottimale del ghiaccio e qualità ideale del campione.

Per la raccolta di tomogrammi, è ideale un microscopio elettronico a trasmissione da 300 chilovolt dotato di stadio criogenico dedicato, filtro energetico e fotocamera con rilevatore elettronico diretto, ma si può utilizzare anche uno strumento da 200 chilovolt con stadio criogenico ad inserimento laterale e una fotocamera CCD. Dopo aver visto questo video, si dovrebbe avere una buona comprensione delle modalità di preparazione di una griglia criogenica, raccolta di una serie di inclinazioni, ricostruzione del tomogramma e calcolo di una media sub-tomografica.

Queste sono le competenze di base necessarie per studiare come l'organizzazione delle proteine all'interno di una cellula influisce sulla capacità della cellula stessa di svolgere funzioni biologiche, come la sintesi efficiente di ATP. Non dimenticare che lavorare con azoto liquido ed etano liquido può essere molto pericoloso e che occhiali di sicurezza e guanti devono essere indossati in ogni momento.