Visualizzazione di organelli in situ mediante tomografia crio-STEM

La tomografia crio-STEM fornisce un mezzo per visualizzare organelli di cellule intatte senza incorporamento, sezionamento o altre preparazioni invasive. La risoluzione 3D ottenuta è attualmente nell'intervallo di pochi nanometri, con un campo visivo di diversi micrometri e uno spessore accessibile nell'ordine di 1 μm.

La tomografia TEM è ampiamente utilizzata per l'imaging delle cellule, ma è molto limitata in termini di spessore del campione. FIB SEM e tomografia a raggi X morbida possono essere utilizzati per campioni più grandi, anche se a risoluzione inferiore. La tomografia STEM colma perfettamente questa lacuna.

La tomografia STEM fornisce uno sguardo a campioni spessi micron con una risoluzione di pochi nanometri. La combinazione con la preparazione criogenica ci consente di esaminare campioni biologici e sezioni in 3D. Rivedi le basi dell'ottica STEM per comprendere la formazione delle immagini e assicurarti che il tecnico dell'assistenza abbia allineato bene le modalità stelo e stelo Lomax e che le fasi di calibrazione siano simili a quelle del video.

Per iniziare, caricare il file di allineamento delle colonne e aprire i valori delle colonne. Se si utilizza un supporto criogenico ad ingresso laterale, aprire la crioprotezione e avviare la modalità TEM. Il raggio dovrebbe apparire sullo schermo.

Ridurre l'ingrandimento se il raggio non viene visualizzato. Portare il microscopio alla messa a fuoco eucentrica premendo il pulsante sul pannello di controllo. Impostare la dimensione dello spot su un valore conveniente per visualizzare lo schermo fluorescente direttamente o con la fotocamera integrata.

Impostare il microscopio in modalità STEM e verificare che la messa a fuoco utilizzi le lenti del condensatore anziché l'obiettivo. Sul pannello, impostare la messa a fuoco eucentrica e uscire dalla modalità di diffrazione per le regolazioni iniziali. Assicurarsi che il raggio non sia vuoto e ridurre l'ingrandimento fino a quando il raggio non appare sullo schermo.

Regolare lo spostamento del fascio verso il centro e aumentare l'ingrandimento in passi fino a 70.000, mantenendo il raggio al centro. Quindi inserire l'apertura del condensatore desiderata, in genere 50 micrometri per la modalità micro sonda, e controllare la centratura dell'apertura. Mentre si ruota la manopola di messa a fuoco avanti e indietro, il punto dovrebbe espandersi e contrarsi, ma rimanere al suo posto, come se un aereo tagliasse una clessidra verticale immaginaria.

Se l'apertura non è centrata, l'illuminazione si sposterà lateralmente come se la clessidra fosse inclinata. Porta il raggio a fuoco, premi lo stato attivo dell'elenco di intensità nella scheda Allineamenti o torna alla messa a fuoco eucentrica. Regolare nuovamente la posizione del fascio al centro e regolare il centro di rotazione.

Ora, ruotare la rotellina di messa a fuoco al minimo, o un gradino sopra, in modo che il raggio pulsi delicatamente e assicurarsi che rimanga fermo mentre la messa a fuoco si sposta su e giù. Selezionare i punti pivot e riunire i due punti con le regolazioni X e Y. Regolare gli stigma del condensatore per rendere il fascio rotondo.

Vai su e giù attraverso la messa a fuoco per ottimizzare. Non ci dovrebbe essere alcuna tendenza ad allungarsi in una direzione o nell'altra quando si passa attraverso la messa a fuoco. Normalizzare le lenti, quindi aumentare progressivamente l'ingrandimento a circa 240.000, utilizzando lo spostamento del fascio per mantenere il punto centrato e ripetere le regolazioni del centro di rotazione e del punto di rotazione.

Tornare alla modalità di diffrazione. In questa fase, il raggio dovrebbe apparire come un disco uniforme sullo schermo fluorescente. La lunghezza della telecamera ora controlla efficacemente la distanza ottica dal rivelatore come una cristallografia a raggi X.

Cambialo e osserva come il disco si contrae e si allarga come se la posizione dello schermo si spostasse verso o lontano dal campione. Questo cono rappresenta l'illuminazione a campo chiaro. Per attivare la modalità STEM ad alto ingrandimento, iniziare con il rilevatore dello stelo a campo chiaro e regolare l'allineamento della diffrazione per centrare il fascio utilizzando la lunghezza della fotocamera desiderata.

Attivare la marcatura a campo chiaro sullo schermo, ridurre la lunghezza della fotocamera a 330, sollevare lo schermo e inserire i rilevatori. Avviare una scansione nel software del microscopio. Utilizzare il display dell'oscilloscopio per facilitare la regolazione delle impostazioni di luminosità e contrasto come descritto nel manoscritto.

Ripetere la regolazione più volte. Riportare il microscopio a un ingrandimento relativamente basso nel registro ad alto ingrandimento, senza entrare in modalità di ingrandimento basso. Inserire lo schermo fluorescente e annotare la corrente dello schermo come riferimento.

Come in TEM, la corrente può essere modificata con l'obiettivo della pistola e le impostazioni delle dimensioni dello spot con numeri crescenti corrispondenti a una corrente ridotta. A questo punto, salvare un registro FEG per facilitare il ritorno ai valori standard. Passare alla modalità LMTEM per vedere il campione.

Inserire il campione. Portare il campione ad altezza eucentrica. Esistono diversi metodi per farlo.

Ad esempio, usate lo stage wobbler per inclinare la griglia mentre spostate l'altezza del campione lungo l'asse Z fino a quando l'immagine non smette di spostarsi lateralmente. In alternativa, contrassegna alcune caratteristiche sullo schermo di visualizzazione e inclina il palco da 10 a 30 gradi. La feature si sposterà lateralmente.

Regolare l'altezza del campione per riportarlo nella posizione originale. Aumentate l'ingrandimento o l'inclinazione dello stage per perfezionare e riportare l'inclinazione a zero gradi. Ora torna alla modalità STEM e inserisci il rilevatore STEM.

Assicurarsi che l'opzione Abilita scansione LM sia deselezionata. Vai alla modalità di ingrandimento più basso. Sintonizzare l'astigmatismo del condensatore con il metodo.

Con il fascio su un'area di campionamento sottile, mettere a fuoco il punto in cui il fascio trasmesso esplode tra le immagini in ombra del campione su entrambi i lati. Quindi regolare la sintonizzazione del condensatore per rendere il disco centrale rotondo. Ciò richiede una certa pratica, specialmente per i campioni criogenici.

Torna all'apertura di 50 micrometri e aggiorna il registro FEG. Vai alla modalità LMSTEM e continua la scansione per trovare un'area interessante. Se necessario, regolare nuovamente le impostazioni di luminosità e contrasto del rilevatore approssimativamente a questo punto.

Premere la messa a fuoco eucentrica, aumentare l'ingrandimento e perfezionare la messa a fuoco durante la scansione utilizzando il loop di messa a fuoco fornito dal microscopio e controllare l'astigmatismo sulle perle d'oro. Fino ad ora, tutto viene eseguito in modalità nano sonda. Si noti che l'inserimento di un'apertura del condensatore più piccola riduce l'angolo di semiconvergenza, il che è utile per campioni spessi.

Un approccio alternativo con gli strumenti TFS consiste nel passare alla modalità microsonda, che porta a un angolo di semiconvergenza ridotto. Quindi, regolare la lunghezza della telecamera in modo da avere l'angolo di raccolta tre volte maggiore dell'angolo di convergenza; cioè, i segni dell'area del rilevatore BF sullo schermo sono circa tre volte più grandi del raggio.

Stimare la dose per la registrazione utilizzando un'equazione. Come regola generale, mirare da 100 a 150 elettroni per inkstrom quadrato per l'intero tomografo. Riportare lo stadio su un intero e regolare la corrente del fascio utilizzando le dimensioni dello spot e/o le impostazioni dell'obiettivo della pistola per raggiungere la corrente dello schermo desiderata.

La mappa della griglia a basso ingrandimento registrata in modalità STEM mostra le aree con celle di interesse. Le celle appaiono parzialmente luminose con elettroni sparsi verso il rivelatore HAADF. La mappa a media risoluzione registrata in modalità STEM mostrava due mappe di ancoraggio a media risoluzione.

L'inclinazione di zero gradi di una serie di inclinazioni dello stelo ha permesso la visualizzazione dei depositi di fosfato di calcio, cristae e marcatori fiduciali d'oro di un mitocondrio. Viene mostrato il rendering del volume di sezioni spesse 60 nanometri e 40 nanometri. La tomografia staminale criogenica, o CSTET, fornisce un ponte tra la biologia strutturale e la biologia cellulare, nonché un contesto per la fluorescenza a super risoluzione.

Senza la necessità di sezionare o preparare lamelle, possiamo vedere l'intero teatro cellulare in uno stato quasi nativo.