Name: Visualizzazione di organelli in situ mediante tomografia crio-STEM (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-06-23T12:20:00.000+00:00
Duration: 8 min 37 s
Description: Scopri la tomografia cryo-STEM per visualizzare organelli cellulari in situ con risoluzione nanometrica. Questa tecnica non invasiva preserva le strutture biologiche nello stato nativo per studi avanzati.

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Siamo estremamente grati per il supporto continuo e costante da parte dell'autore e manutentore del pacchetto software SerialEM, David Mastronade, e Günther Resch. P.K. è stato finanziato dall'Austrian Science Fund (FWF) attraverso una Schrödinger Fellowship J4449-B. Ai fini dell'accesso aperto, gli autori hanno applicato una licenza di copyright pubblico CC-BY a qualsiasi versione del manoscritto accettato dall'autore derivante da questa presentazione. M.E. e S.G.W. riconoscono il finanziamento della Israel Science Foundation, sovvenzione n. 1696/18, e del progetto di gemellaggio Horizon 2020 dell'Unione Europea, ImpaCT (grant no.857203). M.E. riconosce il finanziamento del CER nel progetto CryoSTEM (sovvenzione n. 101055413). M.E. è il titolare della cattedra Sam e Ayala Zacks Professorial e capo del Centro Irving e Cherna Moskowitz per l'imaging nano e bio-nano. Il laboratorio di M.E. ha beneficiato della generosità storica della famiglia Harold Perlman. Riconosciamo anche il finanziamento da parte dell'Unione europea. Le opinioni e le opinioni espresse sono tuttavia esclusivamente quelle dell'autore o degli autori e non riflettono necessariamente quelle dell'Unione europea o dell'Agenzia esecutiva del Consiglio europeo della ricerca. Né l'Unione europea né l'autorità che concede l'aiuto possono essere ritenute responsabili per loro.

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Gli autori non dichiarano conflitti di interesse.

Il protocollo dovrebbe aiutare i microscopisti delle scienze della vita che sono interessati a ottenere una visione 3D degli organelli intracellulari in regioni della cellula che non sono accessibili alla tomografia TEM convenzionale. Lo stesso protocollo può essere utilizzato anche per la tomografia STEM di sezioni plastiche, con vincoli rilassati sull'esposizione. Il protocollo dovrebbe essere considerato come un punto di partenza piuttosto che un insieme di regole rigide. In effetti, il potere di STEM è la sua flessibilità; Non esiste un modo giusto per gestirlo.
Sottolineiamo che STEM, di per sé, si riferisce solo alla sonda scansionata e non definisce la formazione dell'immagine. Il contrasto dipende principalmente dalla configurazione dei rilevatori. I metodi più semplici impiegano rivelatori con simmetria assiale, un disco centrato sull'asse ottico o un anello che lo circonda. In generale, quando l'illuminazione colpisce direttamente il rivelatore, registriamo un'immagine BF in cui il campione (di diffusione elettronica) appare scuro; al contrario, quando il rivelatore raccoglie solo elettroni sparsi, registriamo un'immagine DF in cui il campione denso appare luminoso. Quando è disponibile l'hardware adatto, SerialEM può acquisire e registrare entrambi questi segnali contemporaneamente. Sono disponibili configurazioni ancora più sofisticate, che vanno dai rilevatori con più segmenti alle telecamere completamente pixelate. L'imaging a contrasto di fase può essere ottenuto, ad esempio, valutando la differenza tra gli elementi rivelatori fuori asse32,33. La raccolta dell'intero modello di scattering 2D (diffrazione) per pixel definisce il metodo noto come 4D STEM34, che consente la ricostruzione di più contrasti di immagine dagli stessi dati originali. Lo STEM quadridimensionale consente la ptychography elettronica, che fornisce un altro mezzo per ottenere il contrasto di fase35.
Ci siamo concentrati sulla particolare modalità STEM che riteniamo più utile per lo studio di organelli e cellule intatte o sezioni cellulari spesse micron. Ciò comporta in particolare l'uso dell'imaging BF con un piccolo angolo di semiconvergenza nell'illuminazione e un angolo di raccolta relativamente ampio sul rivelatore. La piccola convergenza fornisce un'ampia profondità di campo in modo che l'intero campione rimanga a fuoco per tutta la serie di inclinazione19. In pratica, con un buon stadio al microscopio, può anche eliminare la necessità di regolazione della messa a fuoco durante l'acquisizione. Il prezzo è un compromesso nella risoluzione, come descritto nella sezione 3 del protocollo. Abbiamo suggerito immagini 4k con una sonda di ~2 nm, che con una spaziatura dei pixel di 1 nm raggiunge un campo visivo di 4 μm. Tuttavia, il lettore è fortemente incoraggiato a sperimentare. La seconda considerazione è sul lato del rilevatore. Quando il disco di illuminazione riempie il rilevatore BF in asse, il contrasto di fase viene soppresso e domina il contrasto di dispersione (ampiezza); Questa condizione è stata chiamata contrasto di campo luminoso incoerente36. La domanda è da quale frazione riempire e la risposta dipende dal campione. Un campione molto sottile mostrerà il miglior contrasto con il rilevatore completamente riempito (cioè, l'angolo di raccolta corrisponde a quello dell'illuminazione), ma un campione più spesso disperderà tutta l'intensità, lasciando un segnale rumoroso con scarso contrasto. Una regola empirica utile è che più spesso è il campione, maggiore dovrebbe essere l'angolo di taglio esterno del rilevatore BF21. Le dimensioni e la posizione del rivelatore sono ovviamente fisse, quindi la dimensione del disco di diffrazione viene regolata utilizzando la lunghezza della telecamera, come descritto nella sezione 1. Se le impostazioni dell'amplificatore del rilevatore sono tali che il segnale riempie la gamma dinamica ma non satura sotto l'illuminazione diretta (1.12.3), la lunghezza della telecamera può essere aumentata fino a raggiungere un'intensità e un contrasto del segnale ragionevoli. Ancora una volta, il lettore è incoraggiato a sperimentare. L'arte, per così dire, è negli angoli.
Un altro parametro, non discusso nel protocollo, è la tensione di accelerazione del microscopio. L'interazione degli elettroni illuminanti con il campione sarà più forte a una tensione inferiore. A parità di tutto il resto, possiamo aspettarci un contrasto maggiore a una tensione inferiore. D'altra parte, è l'inizio della diffusione multipla all'interno del campione che limita lo spessore del campione utilizzabile, quindi una tensione più elevata consente l'uso di campioni più spessi. Questi effetti sono piuttosto sottili, tuttavia. Le nostre esperienze fino ad oggi con accelerazioni a 200 kV e 300 kV sono simili.
Considerando ciò che ci si può aspettare da STEM in termini di risoluzione, questo dipende ancora una volta dal campione e dalla configurazione del rivelatore. Utilizzando un approccio di analisi a singola particella, gli ioni metallici sulla ferritina potrebbero essere localizzati da STEM in campo oscuro anulare con una precisione di pochi angstrom37. Più recentemente, è stata raggiunta una risoluzione sub-nanometrica per campioni di virus e proteine utilizzando immagini ottenute mediante contrasto di fase differenziale integrato (iDPC) STEM32 e ptychography35. Per oggetti unici in campioni cellulari spessi, e con i metodi descritti qui, una risoluzione così elevata non è realistica. La risoluzione ottimale è il diametro della sonda, che si riferisce all'angolo di semiconvergenza come descritto. Altri fattori degraderanno la risoluzione, in particolare un campionamento di pixel grossolani per raggiungere un ampio campo visivo, disallineamenti nella serie di inclinazione e diffusione del fascio della sonda in trasmissione. Le immagini si confrontano bene con la tomografia a sezione plastica. Con la configurazione qui descritta, ad esempio, dovrebbe essere facile vedere il nucleo cavo dei microtubuli, ma non i singoli protofilamenti.
Per riassumere, i metodi STEM e l'hardware sono entrambi in fase di sviluppo. Possiamo aspettarci che le innovazioni nell'imaging avranno un impatto anche sulla tomografia, portando STEM in domini che non sono stati accessibili da altre tecniche. Ci aspettiamo che una convergenza con l'imaging a fluorescenza criogenica correlativa basata su moderni metodi ottici a super-risoluzione sarà particolarmente fruttuosa. La scala degli organelli, 100-1.000 nm, è un obiettivo ideale per questi metodi emergenti.

La visualizzazione tridimensionale (3D) degli organelli è un compito fondamentale nella moderna biologia cellulare. Date le scale coinvolte, che vanno da decine di nanometri per le vescicole secretorie a molti micron per il nucleo cellulare, è difficile trovare una singola tecnica di microscopia adatta a tutte le applicazioni. Mentre la moderna microscopia a fluorescenza può coprire gran parte della gamma in termini di risoluzione, appaiono solo le molecole etichettate. Il teatro cellulare rimane il regno della microscopia elettronica. I metodi convenzionali di fissazione chimica, incorporazione della plastica e colorazione con metalli pesanti sono fortemente invasivi, quindi i risultati possono dipendere dai dettagli della preparazione del campione. Cryo-EM, d'altra parte, è vincolato dalla necessità di vetrificare il mezzo acquoso; cristalli di ghiaccio che formano diffratto l'illuminazione elettronica, causando artefatti di contrasto di contrasto superiore rispetto al materiale organico di interesse.
L'ultimo decennio ha visto una proliferazione di tecniche di imaging EM sviluppate o adattate per studi cellulari1. Il congelamento ad alta pressione combinato con la fresatura iterativa a fascio ionico focalizzato (FIB) e l'imaging seriale della superficie utilizzando il microscopio elettronico a scansione (cioè FIB-SEM) è attualmente il metodo di scelta per campioni di grandidimensioni 2. La tomografia criogenica a raggi X molli (cryo-SXT) è adatta per campioni di diverse dimensioni micron, limitata dalla caratteristica lunghezza di assorbimento dei raggi X molli in acqua 3,4,5. Questa scala include molti tipi di cellule intatte e la natura quantitativa del contrasto di assorbimento dei raggi X aggiunge un aspetto della misurazione della concentrazione6 o della spettroscopia7. Se combinata con la media dei sottotomogrammi, la tomografia elettronica a criotrasmissione (cryo-ET), basata sulla microscopia elettronica a trasmissione di contrasto di fase (TEM), offre la massima risoluzione per macromolecole o complessi 8,9,10. Tuttavia, è raro che gli organelli intatti siano così regolari da poter essere mediati interi. Inoltre, il modo convenzionale di TEM a campo largo è limitato per lo spessore del campione a poche centinaia di nanometri dalla combinazione di scattering anelastico (che comporta perdita di energia) nel campione e aberrazione cromatica nella lente magnetica dell'obiettivo11,12. La grande diffusione di energia impone l'uso di un filtro di energia per rimuovere la foschia fuori fuoco risultante, ma il campione sensibile subisce ancora danni da radiazioni mentre il segnale dell'immagine diventa esponenzialmente più debole con l'aumentare dello spessore.
La modalità di imaging alternativa, la trasmissione a scansione EM (STEM), aggira la necessità di filtraggio dell'energia e mantiene gli elettroni sparsi anelasticamente per la formazione dell'immagine, anche se attualmente a una risoluzione inferiore rispetto alla tomografia TEM (Figura 1). In realtà, non si forma alcuna immagine reale. Invece, come in un EM di scansione, le misurazioni vengono effettuate punto per punto e l'immagine viene assemblata dal computer. L'ingrandimento è determinato solo dalla dimensione dei passaggi di scansione senza modificare le correnti dell'obiettivo. Se configurato correttamente, l'intervallo utile di spessore del campione per la tomografia crio-STEM (CSTET) può raggiungere 1,5 o anche 2 μm, sebbene la zona di comfort, dove l'intensità del segnale utile rimane una frazione significativa dell'illuminazione, sia di circa 600-900 nm11,13. Questo è sufficiente per vedere una grande frazione del citoplasma e occasionalmente un bordo del nucleo cellulare. In pratica, troviamo che la vetrificazione con il metodo standard di immersione nel fluido criogenico impone un vincolo più severo sullo spessore rispetto all'imaging STEM. L'obiettivo di questo articolo video è facilitare l'incorporazione di CSTET nella cassetta degli strumenti per l'imaging di cellule e organelli nei laboratori di ricerca e nelle strutture di microscopia.
La prima sfida è che le operazioni al microscopio in CSTET non sono ancora standardizzate per le applicazioni delle scienze della vita come lo sono state per la tomografia crio-TEM. L'hardware STEM è stato raramente (se non mai) destinato al mercato crio-EM. Tuttavia, questo sta cambiando con la nuova generazione di microscopi e molti strumenti esistenti possono essere adattati. STEM come tecnica è decollata e in gran parte presa in consegna nelle scienze dei materiali, dove c'è anche un interesse nascente per i metodi criogenici e a basso dosaggio14,15. La letteratura scientifica dei materiali abbonda di acronimi BF-STEM, ADF-STEM, HAADF-STEM, 4D-STEM, DPC-STEM, ecc., Che aggiungono confusione. Offriamo qui un punto di partenza consigliato che, nella nostra esperienza collettiva presso il Weizmann Institute of Science, fornisce il protocollo più generale per risultati utili basati sull'imaging STEM a campo luminoso (BF)16. In nessun modo esaurisce o addirittura esplora la gamma di possibilità, ma servirà come base per ulteriori miglioramenti. Mentre enfatizziamo il crio-STEM, la maggior parte del protocollo è ugualmente rilevante per la tomografia STEM a temperatura ambiente di sezioni incorporate in plastica.
L'essenza di STEM è scansionare il campione con una sonda elettronica focalizzata (Figura 1), il cono di illuminazione, e registrare i segnali dal piano di diffrazione (scattering) in trasmissione, pixel per pixel, per produrre immagini 2D17,18. I campioni amorfi, compresa la maggior parte dei materiali cellulari, produrranno un modello di diffusione diffuso nella trasmissione. La configurazione STEM pratica più semplice è quella di posizionare un rilevatore circolare per registrare il disco centrale (cioè l'illuminazione della sonda che verrebbe trasmessa senza un campione). Il campione disperde gli elettroni lontano da questo cono di illuminazione nella misura in cui il segnale diminuisce. Questo produce un'immagine BF: il campione appare scuro su uno sfondo luminoso. Un rivelatore anulare può anche (o invece) essere utilizzato per rilevare la dispersione dal campione al di fuori del cono di illuminazione. Con il campione rimosso, non c'è segnale. Quando un campione è sul posto, gli oggetti appaiono luminosi su uno sfondo scuro nell'immagine in campo scuro (DF). La nomenclatura per STEM (BF, campo scuro anulare [ADF], campo scuro anulare ad alto angolo [HAADF], ecc.) si riferisce principalmente agli intervalli di angoli di raccolta per i rivelatori.
L'angolo di convergenza dell'illuminazione rappresenta un adattamento essenziale dello STEM alla tomografia cellulare. Quando la priorità assoluta è l'alta risoluzione, l'angolo di convergenza dovrebbe essere il più ampio possibile. (Questo è simile alla microscopia a scansione laser confocale; la risoluzione è determinata dal diametro della sonda, che scala come la lunghezza d'onda divisa per l'apertura numerica. Si noti che ci riferiamo all'angolo di semiangolo o semiconvergenza per EM.) Quando la priorità è la profondità di campo, invece, un compromesso nella risoluzione offre un grande vantaggio, in quanto il fascio focalizzato rimane approssimativamente parallelo per una distanza pari al doppio della lunghezza d'onda divisa per semi-angolo al quadrato. Idealmente, l'intero volume della cella rimane a fuoco19. Ad esempio, a 300 keV, la lunghezza d'onda dell'elettrone di deBroglie è 0,002 nm, quindi una convergenza di 1 mrad produce una risoluzione di 2 nm e una profondità di campo di 4 micron. In queste condizioni, la tomografia può essere eseguita anche senza messa a fuoco durante il processo di raccolta dei dati, ma solo una volta all'inizio dell'acquisizione. Una STEM convenzionale con capacità di tomografia può raggiungere un angolo di semiconvergenza di 7 o 8 mrad; Pertanto, in linea di principio, potremmo raggiungere una risoluzione dell'ordine di 0,25 nm, ma poi con una profondità focale di soli 62 nm. Questo è chiaramente troppo sottile per l'imaging cellulare. I microscopi più avanzati con tre lenti a condensatore offrono una regolazione continua dell'angolo di semiconvergenza su un intervallo considerevole. Con la più tradizionale configurazione a due condensatori, la convergenza è fissata discretamente dall'apertura del condensatore (C2).
Per campioni robusti e incorporati in plastica, è possibile registrare una serie focale ad ogni inclinazione e combinarle per un'alta risoluzione20, ma per i campioni criogenici, il bilancio della radiazione è troppo severamente limitato. Infine, nel valutare i vantaggi dell'imaging BF o DF, per campioni spessi, si dovrebbero considerare gli effetti della diffusione elastica multipla nel campione. Il segnale BF è meno corrotto dallo scattering multiplo e mostra una risoluzione più elevata per campioni spessi 16,21.
Un'utile regola empirica è stata quella di impostare angoli di raccolta molte volte più grandi della convergenza. Più spesso è il campione, più grande dovrebbe essere il disco di raccolta. Un disco troppo piccolo fornirà una bassa intensità del segnale; Un disco troppo grande comporterà uno scarso contrasto dell'immagine, poiché solo la dispersione dell'angolo più alto contribuirà. Gli angoli di raccolta devono essere ottimizzati per un determinato campione. Gli angoli del rilevatore in funzione della lunghezza (diffrazione) della telecamera devono essere calibrati in modo indipendente. Possono essere visualizzati comodamente dal software del microscopio. In pratica, un fattore da due a cinque nel rapporto tra semiangoli di raccolta e illuminazione, rispettivamente da θ a α (Figura 1), è un punto di partenza raccomandato per CSTET di campioni cellulari.
Il seguente protocollo descrive l'operazione di tomografia STEM utilizzando il popolare software SerialEM per il controllo del microscopio22,23. SerialEM non è legato a un produttore specifico ed è ampiamente utilizzato nella tomografia TEM. La maggior parte delle operazioni di allestimento per la tomografia possono essere eseguite direttamente dal TEM. La strategia di SerialEM consiste nel modellare il sistema di scansione come una telecamera. Ciò consente il semplice crossover da TEM a STEM. Si dovrebbe tenere presente, tuttavia, che parametri come l'ingrandimento e il binning sono interamente artificiali. I parametri importanti sono il campo visivo in micron, il numero di pixel nel campo visivo e il tempo di esposizione. La spaziatura dei pixel, o campionamento, è il campo lineare diviso per il numero di pixel, mentre il tempo di permanenza è il numero di pixel diviso per il tempo di esposizione.
La configurazione minima per STEM e CSTET comporta tre caratteristiche sul microscopio: un generatore di scansione, un rilevatore STEM e un software di controllo della tomografia. Il protocollo fa riferimento alla nomenclatura di FEI/Thermo Fisher Scientific (TFS), ma i concetti sono generici. Il software proprietario di TFS è stato descritto in JoVE per TEM24 e il funzionamento STEM è molto simile.
Partiamo dal presupposto che il microscopio sia stato allineato in anticipo dal team di assistenza o da personale esperto e che un allineamento di colonne possa essere richiamato caricando un file. Le regolazioni minori sono chiamate allineamenti diretti e possono essere memorizzate nei cosiddetti registri FEG (microscopi TFS). Gli allineamenti diretti includono il centro di rotazione, i punti di rotazione, l'allineamento di diffrazione e la compensazione per l'astigmatismo del condensatore. Le regolazioni devono essere eseguite in modo iterativo. Si noti che i microscopi TFS implementano modalità distinte nanosonda (nP) e microsonda (μP); per una data apertura del condensatore, questi forniscono un campo visivo relativamente stretto o ampio con illuminazione parallela in TEM e un fascio di elettroni più o meno convergente (strettamente focalizzato) in STEM, rispettivamente. Altri produttori utilizzano schemi diversi per coprire la gamma di angoli di convergenza.
Prima di iniziare, è necessario scegliere il campo visivo, L, e il campionamento (larghezza dei pixel), l, a seconda del campione in studio. Ad esempio, per l = 1 nm/pixel, è necessario scegliere un'immagine di 4.000 x 4.000 pixel che coprirà un campo visivo di 4 μm2 . La risoluzione sarà, nella migliore delle ipotesi, il doppio del campionamento spaziale, quindi 2 nm, e il diametro della sonda, d, dovrebbe corrispondere a quello. La calibrazione dell'angolo della sonda va oltre lo scopo di questo protocollo, quindi supponiamo che sia disponibile una tabella o una lettura dello schermo. Il diametro della sonda è approssimativamente la lunghezza d'onda dell'elettrone divisa per l'angolo di semiconvergenza (in radianti): d = λ/θ. La lunghezza d'onda, λ, è 0,002 nm per 300 keV e 0,0025 nm per elettroni da 200 keV, quindi θ di 1 mrad fornirà un diametro spot di 2 o 2,5 nm, rispettivamente.
Il protocollo è presentato in una progressione di complessità crescente. Il primo compito è quello di produrre un'immagine STEM, che dipende dal software del produttore del microscopio, e poi una serie di inclinazione, per la quale utilizziamo SerialEM. Molti lettori avranno senza dubbio familiarità con SerialEM, quindi i compiti più complicati verranno naturalmente. Non è necessario seguire rigorosamente le procedure. Gli sviluppi relativi all'automazione possono essere implementati direttamente per STEM e per TEM. Gli utenti esperti probabilmente invertiranno il protocollo, iniziando con la registrazione correlativa delle mappe di fluorescenza e continuando a impostare la tomografia batch. Ulteriori dettagli possono essere trovati nella vasta documentazione e nelle librerie di tutorial per SerialEM stesso, incluso un recente articolo di JoVE sugli ultimi sviluppi nell'automazione25.

<table><tbody><tr><td>&nbsp; SerialEM</td><td>Università del Colorado</td><td>Veriosn 4.0</td><td>SerialEM è una piattaforma software gratuita per il controllo del microscopio e l'acquisizione dei dati.</td></tr><tr>Microscopio <td></td><td></td><td>elettronico a trasmissione compatibile con STEM</td><td>Il protocollo è stato scritto sulla base dell'esperienza con diversi microscopi di Thermo Fisher Scientific: Titan Krios, Talos Arctica e Tecnai T20-F. In linea di principio, dovrebbe essere applicabile anche ad altri produttori.</td></tr></tbody></table>

visualizzazione di organelli in situ mediante tomografia crio-stem

Visualization of Organelles In Situ by Cryo-STEM Tomography

La microscopia elettronica criogenica (cryo-EM) si basa sull'imaging di campioni biologici o organici incorporati nel loro mezzo acquoso nativo; L'acqua viene solidificata in un vetro (cioè vetrificato) senza cristallizzazione. Il metodo crio-EM è ampiamente utilizzato per determinare la struttura di macromolecole biologiche recentemente ad una risoluzione quasi atomica. L'approccio è stato esteso allo studio di organelli e cellule utilizzando la tomografia, ma la modalità convenzionale di imaging EM a trasmissione ad ampio campo subisce una grave limitazione nello spessore del campione. Ciò ha portato a una pratica di fresatura di lamelle sottili utilizzando un fascio ionico focalizzato; L'alta risoluzione è ottenuta mediante la media dei sottotomogrammi dalle ricostruzioni, ma le relazioni tridimensionali al di fuori dello strato rimanente vengono perse. La limitazione dello spessore può essere aggirata mediante imaging a scansione di sonda, simile al EM a scansione o al microscopio a scansione laser confocale. Mentre la microscopia elettronica a trasmissione a scansione (STEM) nella scienza dei materiali fornisce la risoluzione atomica in singole immagini, la sensibilità dei campioni biologici criogenici all'irradiazione elettronica richiede considerazioni speciali. Questo protocollo presenta una configurazione per la criotomografia utilizzando STEM. La configurazione topica di base del microscopio è descritta sia per i sistemi a due che a tre condensatori, mentre l'automazione è fornita dal software SerialEM non commerciale. Vengono inoltre descritti i miglioramenti per l'acquisizione dei lotti e l'allineamento correlativo alle mappe di fluorescenza acquisite in precedenza. Ad esempio, mostriamo la ricostruzione di un mitocondrio, evidenziando la membrana interna ed esterna e i granuli di fosfato di calcio, nonché i microtubuli circostanti, i filamenti di actina e i ribosomi. La tomografia crio-STEM eccelle nel rivelare il teatro degli organelli nel citoplasma e, in alcuni casi, anche la periferia nucleare delle cellule aderenti in coltura.

Un montaggio completo della griglia preparato in STEM mostra le aree con celle di interesse (Figura 4). Si noti che l'immagine è in campo scuro, quindi i fori vuoti appaiono scuri. Le celle appaiono parzialmente luminose, dove gli elettroni sono dispersi verso il rivelatore HAADF. Nelle parti più spesse, tipicamente al centro o vicino alle barre della griglia, il contrasto diventa di nuovo scuro. Ciò è dovuto allo scattering multiplo, per cui gli elettroni raggiungono angoli non catturati dal rivelatore. In pratica, queste aree saranno troppo spesse per la tomografia.
La fase successiva comprende mappe di ingrandimento intermedio (Figura 10). Queste sono spesso chiamate mappe di montaggio medio o mappe quadrate, riferendosi ai quadrati della griglia piuttosto che alla forma. Anche con la modalità STEM microprobe più bassa, saranno acquisiti anche come immagini di montaggio. Facendo clic sull'elemento nella finestra Navigatore l'immagine della mappa viene caricata nella finestra principale. All'interno di quest'area vengono scelti punti specifici per l'acquisizione del tomogramma. Utilizzare la modalità Anteprima per individuare l'area in corrispondenza dell'ingrandimento della registrazione. Tieni presente che potrebbe esserci uno spostamento laterale tra Anteprima e Registra, a seconda delle velocità di scansione. Qui può essere registrata una singola serie di inclinazione. I mitocondri, ad esempio, possono essere spesso identificati nell'immagine Anteprima e registrazione (Figura 12).
Per la tomografia batch, lo stadio viaggerà intorno alla griglia e potrebbe non tornare esattamente nella stessa posizione. Le mappe di ancoraggio vengono utilizzate per garantire che le aree di registrazione desiderate vengano identificate in modo affidabile abbinando l'immagine di anteprima a una vista di ingrandimento inferiore, anche se il movimento dello stage si è spostato. PyEM23,24 offre un'alternativa più veloce che è certamente consigliata, ma non fa ancora parte dell'installazione standard.
Nell'approccio CLEM, una mappa di fluorescenza può essere utilizzata per identificare le aree di interesse per la tomografia. La fluorescenza viene acquisita esternamente e deve essere registrata sul montaggio completo della griglia. È utile avere le barre della griglia e i fori visibili, in modo che un composito di fluorescenza + campo chiaro unito possa essere preparato prima dell'importazione, ad esempio nel software GIMP (https://www.gimp.org) o ImageJ31 (fare attenzione che ImageJ inverta l'asse verticale). Quando la gamma dinamica della fluorescenza è ampia, può essere difficile creare una tale fusione senza saturazione. In questo caso, le due mappe possono essere importate separatamente e quindi registrate insieme come descritto (Figura 13). In questo modo, un punto sulla mappa di fluorescenza nella finestra del navigatore, seguito da "Vai a XY", porta il palco nella posizione corrispondente sulla griglia montata nel TEM. Fate attenzione che piccole incongruenze nella creazione del montaggio (o della mappa di fluorescenza, se anch'essa è un montaggio) porteranno a piccoli spostamenti; Pertanto, per una precisione ottimale, la fluorescenza deve essere nuovamente registrata specificamente nella mappa quadrata. Spesso è sufficiente fare questa registrazione ad occhio, sulla base di fori nella pellicola di supporto o caratteristiche condivise con l'immagine luminosa a campo luminoso.
La ricostruzione della serie di inclinazione produce un volume 3D (Figura 14). Questo esempio ha una dimensione in pixel di 2,042 nm, che si traduce in un campo visivo di ~4 μm. I depositi di fosfato di calcio (punte di freccia arancione) si distinguono, a causa del numero atomico più elevato rispetto all'ambiente circostante. I microtubuli (punte di freccia rossa) possono essere tracciati in tutto il campo visivo. Inoltre, le membrane mitocondriali interne ed esterne (punte di freccia verdi) possono essere viste chiaramente. L'actina può essere osservata come fasci o come singoli filamenti. Per ottenere una risoluzione più isotropa, la ricostruzione può essere elaborata mediante deconvoluzione.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65052/65052fig01.jpg"> Figura 1: Confronto tra TEM e STEM. In TEM, il campo visivo è illuminato da un fascio quasi parallelo e l'obiettivo forma un'immagine ingrandita sulla telecamera. Per il crio-TEM, l'apertura dell'obiettivo viene aperta per far passare le onde elettroniche diffuse (linea rossa tratteggiata), che, con la sfocatura, producono contrasto di fase per interferenza con le onde non diffuse (verdi). STEM, d'altra parte, raster un fascio focalizzato attraverso il campione e raccoglie gli elettroni diffusi in modo pixel per pixel. Più rivelatori possono raccogliere elettroni sparsi a diverse angolazioni. Questa cifra è stata modificata da30. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65052/65052fig01large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65052/65052fig02.jpg"> Figura 2: Esempio di distorsione dell'immagine sul lato sinistro a causa dell'elevata velocità di scansione. Si noti la distorsione contrassegnata da punte di freccia gialle, così come i fori di forma ovale distorti nel Quantifoil. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65052/65052fig02large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65052/65052fig03.jpg"> Figura 3: Finestra di dialogo di impostazione del montaggio per l'intero montaggio della griglia. Scegli l'ingrandimento e il numero di pezzi in X e Y in modo che l'area totale raggiunga circa 2.000 μm per ottenere una mappa per la maggior parte della griglia. Scegliete anche Sposta stage invece di spostare l'immagine e Usa mappatura montaggio, non Registra parametri. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65052/65052fig03large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65052/65052fig04.jpg"> Figura 4: GridMap a basso ingrandimento registrato in modalità STEM. Le aree spezzate appaiono completamente nere nell'immagine in campo scuro. Le aree grigio scuro sono probabilmente troppo spesse e scarsamente vetrificate. Le buone aree candidate per la tomografia sono bianche o grigio chiaro in questa scansione. Barra di scala = 100 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65052/65052fig04large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65052/65052fig05.jpg"> Figura 5: Passaggio al processo del marcatore. Un oggetto riconoscibile è contrassegnato nella mappa a bassa risoluzione da Aggiungi punti (38 in questa immagine). Si noti lo spostamento tra la mappa a bassa risoluzione (cerchio verde) e la mappa a media risoluzione (cerchio arancione). Quindi, l'oggetto viene contrassegnato dal marcatore (croce verde, cerchio rosso) e viene avviata la finestra di dialogo Sposta su marcatore. L'opzione scelta sposta tutte le mappe a 245x della stessa quantità. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65052/65052fig05large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65052/65052fig06.jpg"> Figura 6: Finestra di dialogo di configurazione della serie Tilt per una serie di inclinazione STEM. Lo schema simmetrico di dose viene utilizzato da -60° a +60° in incrementi di 2°. La messa a fuoco automatica viene saltata a causa dell'elevata profondità di messa a fuoco quando si utilizza un angolo di convergenza basso. Non c'è bisogno di affinare l'eucentrismo come è stato fatto prima. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65052/65052fig06large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65052/65052fig07.jpg"> Figura 7: Finestra di dialogo delle proprietà dei file per mappe a media risoluzione. Salvare come file dello stack MRC, scegliere numeri interi e salvare informazioni aggiuntive in un file di metadati con estensione mdoc. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65052/65052fig07large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.</a>
<img alt="Figure 8" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65052/65052fig08.jpg"> Figura 8: Finestra di dialogo di impostazione del montaggio per il salvataggio di mappe a media risoluzione. Per un quadrato su una griglia a 200 maglie, larga 90 μm, è consigliabile un'area totale di almeno 90 μm x 90 μm. Scegliete Sposta fase invece di spostare l'immagine e Usa i parametri di visualizzazione in modalità Dose bassa. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65052/65052fig08large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.</a>
<img alt="Figure 9" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65052/65052fig09.jpg"> Figura 9: Registrazione della mappa a media risoluzione. Acquisisci nella finestra di dialogo Elementi per la registrazione di mappe a media risoluzione. Scegli Mappatura, Acquisisci e salva immagine o montaggio e seleziona Crea mappa navigatore. Nelle Attività prima o dopo la Primaria, scegli Eucentricità approssimativa e fine. In caso di assenza di assistenza, scegliere facoltativamente Nessuna finestra di messaggio quando si verifica un errore e Chiudi valvole colonna alla fine. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65052/65052fig09large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.</a>
<img alt="Figure 10" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65052/65052fig10.jpg"> Figura 10: Immagine della mappa a media risoluzione. Mappa a media risoluzione (Square Map) registrata in modalità STEM da un montaggio di 3 x 3. Le due Anchor Map a media risoluzione per la raccolta dei dati sono indicate dai quadrati blu. Barra di scala = 10 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65052/65052fig10large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.</a>
<img alt="Figure 11" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65052/65052fig11.jpg"> Figura 11: Dati della serie di inclinazione del batch. Finestra di dialogo Acquisisci elementi per la raccolta di serie di inclinazione batch. Per la raccolta dei dati delle serie di inclinazione, scegliere Dati finali e Acquisisci serie di inclinazione. In Attività prima o dopo Primario, selezionare Gestisci dewar/Vuoto (scegliere le impostazioni appropriate nel menu Imposta), Riallinea a Elemento, Eucentricità fine ed Esegui script prima dell'azione. Nelle opzioni Generali, selezionare Nessuna finestra di messaggio quando si verifica un errore e Chiudi valvole di colonna alla fine (vedere 5.14). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65052/65052fig11large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.</a>
<img alt="Figure 12" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65052/65052fig12.jpg"> Figura 12: Inclinazione 0° di una serie di inclinazioni STEM di un mitocondrio. Le punte di freccia arancioni indicano depositi di fosfato di calcio (granuli di matrice), punte di freccia verdi a cristae e punte di freccia rosse a marcatori fiduciali d'oro da 15 nm. Barra della scala = 500 nm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65052/65052fig12large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.</a>
<img alt="Figure 13" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65052/65052fig13.jpg"> Figura 13: Mappe crio-CLEM registrate. (A) La mappa STEM a media risoluzione (mappa quadrata, 26-A) è registrata sulla (B) mappa STEM a bassa risoluzione, (C) mappa crio-FM del canale BF e (D) mappa crio-FM del canale GFP. I nove punti di registrazione (etichette 4-21) sono indicati nel (E) Navigator. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65052/65052fig13large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.</a>
<img alt="Figure 14" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65052/65052fig14.jpg"> Figura 14: rendering del volume. Rendering volumetrico di sezioni spesse (A) 60 nm e (B) 40 nm attraverso un tomogramma filtrato simile a SIGT (30 cicli) a diverse profondità. La dimensione dei pixel è di 2,048 nm, il che si traduce in un campo visivo di circa 4 μm. Si noti la densità invertita rispetto alla Figura 12, il che significa che le caratteristiche ad alta intensità sono luminose. Le punte di freccia arancioni, bianche, rosse, verdi e azzurre indicano rispettivamente depositi di fosfato di calcio, ribosomi, microtubuli, membrana mitocondriale interna ed esterna e filamenti di actina. Barra della scala = 500 nm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65052/65052fig14large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.</a>

La tomografia crio-STEM fornisce un mezzo per visualizzare organelli di cellule intatte senza incorporamento, sezionamento o altre preparazioni invasive. La risoluzione 3D ottenuta è attualmente nell'intervallo di pochi nanometri, con un campo visivo di diversi micrometri e uno spessore accessibile nell'ordine di 1 μm.

Visualizzazione di organelli in situ mediante tomografia crio-STEM

Cryogenic electron microscopy (cryo-EM) relies on the imaging of biological or organic specimens embedded in their native aqueous medium; water is ...

La tomografia TEM è ampiamente utilizzata per l'imaging delle cellule, ma è molto limitata in termini di spessore del campione. FIB SEM e tomografia a raggi X morbida possono essere utilizzati per campioni più grandi, anche se a risoluzione inferiore. La tomografia STEM colma perfettamente questa lacuna.La tomografia STEM fornisce uno sguardo a campioni spessi micron con una risoluzione di pochi nanometri. La combinazione con la preparazione criogenica ci consente di esaminare campioni biologici e sezioni in 3D. Rivedi le basi dell'ottica STEM per comprendere la formazione delle immagini e assicurarti che il tecnico dell'assistenza abbia allineato bene le modalità stelo e stelo Lomax e che le fasi di calibrazione siano simili a quelle del video.Per iniziare, caricare il file di allineamento delle colonne e aprire i valori delle colonne. Se si utilizza un supporto criogenico ad ingresso laterale, aprire la crioprotezione e avviare la modalità TEM. Il raggio dovrebbe apparire sullo schermo.Ridurre l'ingrandimento se il raggio non viene visualizzato. Portare il microscopio alla messa a fuoco eucentrica premendo il pulsante sul pannello di controllo. Impostare la dimensione dello spot su un valore conveniente per visualizzare lo schermo fluorescente direttamente o con la fotocamera integrata.Impostare il microscopio in modalità STEM e verificare che la messa a fuoco utilizzi le lenti del condensatore anziché l'obiettivo. Sul pannello, impostare la messa a fuoco eucentrica e uscire dalla modalità di diffrazione per le regolazioni iniziali. Assicurarsi che il raggio non sia vuoto e ridurre l'ingrandimento fino a quando il raggio non appare sullo schermo.Regolare lo spostamento del fascio verso il centro e aumentare l'ingrandimento in passi fino a 70.000, mantenendo il raggio al centro. Quindi inserire l'apertura del condensatore desiderata, in genere 50 micrometri per la modalità micro sonda, e controllare la centratura dell'apertura. Mentre si ruota la manopola di messa a fuoco avanti e indietro, il punto dovrebbe espandersi e contrarsi, ma rimanere al suo posto, come se un aereo tagliasse una clessidra verticale immaginaria.Se l'apertura non è centrata, l'illuminazione si sposterà lateralmente come se la clessidra fosse inclinata. Porta il raggio a fuoco, premi lo stato attivo dell'elenco di intensità nella scheda Allineamenti o torna alla messa a fuoco eucentrica. Regolare nuovamente la posizione del fascio al centro e regolare il centro di rotazione.Ora, ruotare la rotellina di messa a fuoco al minimo, o un gradino sopra, in modo che il raggio pulsi delicatamente e assicurarsi che rimanga fermo mentre la messa a fuoco si sposta su e giù. Selezionare i punti pivot e riunire i due punti con le regolazioni X e Y. Regolare gli stigma del condensatore per rendere il fascio rotondo.Vai su e giù attraverso la messa a fuoco per ottimizzare. Non ci dovrebbe essere alcuna tendenza ad allungarsi in una direzione o nell'altra quando si passa attraverso la messa a fuoco. Normalizzare le lenti, quindi aumentare progressivamente l'ingrandimento a circa 240.000, utilizzando lo spostamento del fascio per mantenere il punto centrato e ripetere le regolazioni del centro di rotazione e del punto di rotazione.Tornare alla modalità di diffrazione. In questa fase, il raggio dovrebbe apparire come un disco uniforme sullo schermo fluorescente. La lunghezza della telecamera ora controlla efficacemente la distanza ottica dal rivelatore come una cristallografia a raggi X.Cambialo e osserva come il disco si contrae e si allarga come se la posizione dello schermo si spostasse verso o lontano dal campione. Questo cono rappresenta l'illuminazione a campo chiaro. Per attivare la modalità STEM ad alto ingrandimento, iniziare con il rilevatore dello stelo a campo chiaro e regolare l'allineamento della diffrazione per centrare il fascio utilizzando la lunghezza della fotocamera desiderata.Attivare la marcatura a campo chiaro sullo schermo, ridurre la lunghezza della fotocamera a 330, sollevare lo schermo e inserire i rilevatori. Avviare una scansione nel software del microscopio. Utilizzare il display dell'oscilloscopio per facilitare la regolazione delle impostazioni di luminosità e contrasto come descritto nel manoscritto.Ripetere la regolazione più volte. Riportare il microscopio a un ingrandimento relativamente basso nel registro ad alto ingrandimento, senza entrare in modalità di ingrandimento basso. Inserire lo schermo fluorescente e annotare la corrente dello schermo come riferimento.Come in TEM, la corrente può essere modificata con l'obiettivo della pistola e le impostazioni delle dimensioni dello spot con numeri crescenti corrispondenti a una corrente ridotta. A questo punto, salvare un registro FEG per facilitare il ritorno ai valori standard. Passare alla modalità LMTEM per vedere il campione.Inserire il campione. Portare il campione ad altezza eucentrica. Esistono diversi metodi per farlo.Ad esempio, usate lo stage wobbler per inclinare la griglia mentre spostate l'altezza del campione lungo l'asse Z fino a quando l'immagine non smette di spostarsi lateralmente. In alternativa, contrassegna alcune caratteristiche sullo schermo di visualizzazione e inclina il palco da 10 a 30 gradi. La feature si sposterà lateralmente.Regolare l'altezza del campione per riportarlo nella posizione originale. Aumentate l'ingrandimento o l'inclinazione dello stage per perfezionare e riportare l'inclinazione a zero gradi. Ora torna alla modalità STEM e inserisci il rilevatore STEM.Assicurarsi che l'opzione Abilita scansione LM sia deselezionata. Vai alla modalità di ingrandimento più basso. Sintonizzare l'astigmatismo del condensatore con il metodo.Con il fascio su un'area di campionamento sottile, mettere a fuoco il punto in cui il fascio trasmesso esplode tra le immagini in ombra del campione su entrambi i lati. Quindi regolare la sintonizzazione del condensatore per rendere il disco centrale rotondo. Ciò richiede una certa pratica, specialmente per i campioni criogenici.Torna all'apertura di 50 micrometri e aggiorna il registro FEG. Vai alla modalità LMSTEM e continua la scansione per trovare un'area interessante. Se necessario, regolare nuovamente le impostazioni di luminosità e contrasto del rilevatore approssimativamente a questo punto.Premere la messa a fuoco eucentrica, aumentare l'ingrandimento e perfezionare la messa a fuoco durante la scansione utilizzando il loop di messa a fuoco fornito dal microscopio e controllare l'astigmatismo sulle perle d'oro. Fino ad ora, tutto viene eseguito in modalità nano sonda. Si noti che l'inserimento di un'apertura del condensatore più piccola riduce l'angolo di semiconvergenza, il che è utile per campioni spessi.Un approccio alternativo con gli strumenti TFS consiste nel passare alla modalità microsonda, che porta a un angolo di semiconvergenza ridotto. Quindi, regolare la lunghezza della telecamera in modo da avere l'angolo di raccolta tre volte maggiore dell'angolo di convergenza; cioè, i segni dell'area del rilevatore BF sullo schermo sono circa tre volte più grandi del raggio.Stimare la dose per la registrazione utilizzando un'equazione. Come regola generale, mirare da 100 a 150 elettroni per inkstrom quadrato per l'intero tomografo. Riportare lo stadio su un intero e regolare la corrente del fascio utilizzando le dimensioni dello spot e/o le impostazioni dell'obiettivo della pistola per raggiungere la corrente dello schermo desiderata.La mappa della griglia a basso ingrandimento registrata in modalità STEM mostra le aree con celle di interesse. Le celle appaiono parzialmente luminose con elettroni sparsi verso il rivelatore HAADF. La mappa a media risoluzione registrata in modalità STEM mostrava due mappe di ancoraggio a media risoluzione.L'inclinazione di zero gradi di una serie di inclinazioni dello stelo ha permesso la visualizzazione dei depositi di fosfato di calcio, cristae e marcatori fiduciali d'oro di un mitocondrio. Viene mostrato il rendering del volume di sezioni spesse 60 nanometri e 40 nanometri. La tomografia staminale criogenica, o CSTET, fornisce un ponte tra la biologia strutturale e la biologia cellulare, nonché un contesto per la fluorescenza a super risoluzione.Senza la necessità di sezionare o preparare lamelle, possiamo vedere l'intero teatro cellulare in uno stato quasi nativo.

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