Name: Metodo per visualizzare e analizzare membrana proteine interagenti con microscopia elettronica a trasmissione (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-03-05T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 49 s
Description: Scopri come visualizzare il legame di proteine di membrana estrinseche su nanodischi mediante microscopia elettronica a trasmissione con colorazione negativa. Questa tecnica rivela interazioni proteina-membrana essenziali per la biologia strutturale.

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Gli autori ringraziano il Consiglio di ricerca svedese, Stoccolma County Council, e fondi KI per il loro sostegno. L&#39;espressione e la purificazione di MSP è stato eseguito presso il Karolinska Institutet / SciLifeLab Proteina Scienza Nucleo Facility (http://PSF.ki.se). Gli autori desiderano inoltre ringraziare il dottor Pasi Purhonen e il Dr. Mathilda Sjöberg per condividere la loro competenza tecnica e per la loro assistenza tempestiva.

1. Preparazione di Nanodiscs <ol><li> Espressione e purificazione della proteina di membrana ponteggio 8, 35 <ol><li> Esprimere il MSP1E3D1 His-tag nel E. coli BL21 (DE3) ceppo T1R pRARE2 in fiaschi. Preparare una coltura starter durante la notte da 50 ml con terreno LB integrato con 50 mg / ml kanamicina a 37 ° C. Diluire la coltura starter durante la notte in 2 litri di brodo di medio formidabile integrato con 50 mg / ml kanamicina. </li><li> Crescere le cellule a 37 ° C fino a quando la densità ottica a 600 nm (OD 600) raggiunge circa 3. indurre l&#39;espressione di proteine con 0,5 mM isopropil β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) per 3 ore a 18 ° C. </li><li> Preparare il tampone di lisi (100 mM Tris-HCl, pH 8,0, 100 mM NaCl e 10% glicerolo). Aggiungere 1 mM TCEP immediatamente prima dell&#39;uso. </li><li> Dopo 3 h di induzione a 18 ° C, raccogliere le cellule per centrifugazione per 10 min a 4500 xge 4 ° C. Eliminare il supernatante, pesare le cellule raccolte, e risospendere in tampone di lisi con un rapporto di 2 ml di tampone di lisi per g di cellule. </li><li> Lyse le cellule mediante ultrasuoni pulsato (frequenza di ripetizione: 4 s ON, 4 s OFF) per 3 minuti a 80% di ampiezza. </li><li> Centrifugare i lisati per 20 min a 49.000 xg e 4 ° C. Eliminare il pellet da questo centrifugazione. </li><li> Iniettare il surnatante in 5 mL Ni + colonna chelante collegato ad un sistema di cromatografia liquida automatizzato preferibilmente mantenuto a 4 ° C. </li><li> Prima della fase di eluizione (fase 1.1.9), lavare la colonna con tamponi 1 - 3 di seguito per rimuovere tutte le proteine ​​tranne il His-tag MSP. Monitorare il contenuto proteico a 280 nm per seguire il processo di purificazione; la registrazione UV a 280 nm dovrebbe tornare ai valori basali dopo ogni lavaggio. <ol><li> Lavare con tampone di lavaggio 1: 40 mM Tris-HCl, 300 mM NaCl, 10 mM imidazolo, e l&#39;1% Triton, pH 8,0. </li><li> Lavare con tampone di lavaggio 2: 40 mM Tris-HCl, 300 mmNaCl, 20 mM imidazolo, e 50 mM sodio colato, pH 8,0. </li><li> Lavare con tampone di lavaggio 3: 40 mM Tris-HCl, 300 mM NaCl, 50 mM imidazolo, pH 8,0. </li></ol></li><li> Eluire il MSP con 40 mM Tris-HCl, 300 mM NaCl, e 500 mm imidazolo, pH 8,0. </li><li> Cambiare il buffer a MSP tampone standard (20 mM Tris-HCl, pH 7.5, 100 mM NaCl e 0,5 mM EDTA) mediante gel filtrazione 8, 35; la resa per lotto dovrebbe essere intorno a 7 mg L-1. </li></ol></li><li> Preparazione della soluzione madre fosfolipidi <ol><li> Aggiungere 305 ml di 1-palmitoil-2-oleoyl- sn -glycero-3-fosfocolina (POPC) sciolto in cloroformio a una concentrazione di 25 mg / mL in un bicchiere di vetro e si evapora il cloroformio eliminandola con una leggera corrente di azoto . Essiccare la notte lipide in un essiccatore sotto vuoto. NOTA: Questo passaggio viene eseguita per rimuovere il solvente dal lipide, che lascia una sottile pellicola di lipidi sul fondo del bicchiere di vetro.</li><li> Risospendere la torta di lipidi in 200 ml di MSP tampone standard contenente 100 mM sodio colato vortex il tubo fino a quando la soluzione diventa trasparente; questo fornirà una soluzione con una concentrazione di 50 mM POPC. NOTA: In generale, il rapporto molare di lipidi di detersivo a questo punto dovrebbe essere 1: 2 (lipidi: detergente) 8. Questa miscela lipidica detergente può essere conservato a -80 ° C per circa 2 mesi. </li></ol></li><li> Preparazione di perline idrofobici per la rimozione del detersivo <ol><li> Porre 5 g di perline (peso secco) in una provetta da 50 ml. </li><li> Lavare le perline con 30 mL di metanolo 100% e poi con 40 ml di acqua ultrapura. </li><li> Lavare le perline con 10 ml di MSP tampone standard. Infine, memorizzare le perline con 15 mL di tampone standard PSM a 4 ° C. </li></ol></li><li> Nanodisc ricostituzione <ol><li> Dispensare 190 ml di MSP1E3D1 (0,124 mM) in una provetta per microcentrifuga e aggiungere 61,5 ml di soluzione madre fosfolipidi (50 mm POPC) al tubo stesso. Incubare la miscela ricostituzione in ghiaccio per 1 ora. NOTA: Questo corrisponde ad un rapporto molare di 1: 130 (MSP1E3D1: POPC). </li><li> Aggiungere perline idrofobi ad una concentrazione di 0,5 g di perline per ml di miscela ricostituzione di avviare il processo di auto-assemblaggio. Incubare in un incubatore rotativo per 16 ore a 4 ° C. </li><li> Dopo incubazione, centrifugare per 10 min a 13.000 xg e 4 ° C per rimuovere i precipitati ed aggregati. Eliminare il pellet e salvare il surnatante. </li><li> Equilibrare la colonna cromatografia ad esclusione sterica (montato su un sistema di cromatografia liquida automatizzato) con tampone standard MSP finché l&#39;assorbanza a 280 nm è stabile. Iniettare il surnatante nella colonna e raccogliere le frazioni di picco. </li><li> Misurare le concentrazioni di nanodiscs nelle frazioni di picco a 280 nm. Utilizzare il coefficiente di estinzione molare MSP1E3D1 (e = 29,91 mila centimetri -1 M -1) per il calcolo della concentrazione nanodisc. Notare lanumero di lipidi per nanodisc può essere misurata con una combinazione di lipidi radiomarcati e analisi dei fosfati 4 o mediante analisi fosfato sola. </li></ol></li></ol> 2. Preparazione del Protein Monotopic 5 lipossigenasi 35 <ol><li> Preparare una coltura starter durante la notte. Supplemento 50 ml di terreno LB con 100 mg / ml ampicillina. Seminare il terreno con E. coli BL21 (DE3) contenente il plasmide del gene 5-lipossigenasi (ALOX5). Diluire la coltura starter durante la notte in mezzo di espressione contenente 42 mM Na 2 HPO 4, 24 mm KH 2 PO 4, 9 mm NaCl, 19 mM NH 4 Cl, 1 mM MgSO 4, 0.1 mM CaCl 2, 0,2% D-glucosio, 0,1 %, 5 mM FeSO 4, e 100 mg / ml di ampicillina. Crescere le cellule fino a quando la OD 600 è ~ 0,5 a 25 ° C. Indurre l&#39;espressione di proteine con 0,2 mM IPTG per 16 ore a 20 ° C 35. </li><li> Harvest per centrifugazione per 10 min a 7000 xg e 4 ° C e scartare il surnatante. Pesare il pellet nella parte inferiore del tubo contenente le cellule raccolte e risospendere le cellule raccolte in tampone di lisi (100 mM Tris-HCl, pH 8,0, 100 mM NaCl, 10% glicerolo e 1 mM TCEP) contenente inibitori delle proteasi e 0,5 mg / mL 35 lisozima in un rapporto di 2 ml di tampone di lisi per g di cellule. </li><li> Lisare le cellule mediante sonicazione per 5 x 15 s a 80% di ampiezza. Rimuovere i detriti cellulari mediante centrifugazione per 10 min a 7000 xg e 4 ° C. Eseguire ammonio solfato precipitazione a 30 - 60% della saturazione per precipitare le proteine nella soluzione 35. Centrifugare per 15 min a 16.000 xg e 4 ° C. NOTA: Il pellet 5LO può essere rapidamente congelato e conservato a -80 ° C per 6 mesi. </li><li> Risospendere il pellet con 20 ml di tampone di lisi e centrifugare per 15 min a 40.000 xg e 4 ° C. </li><li> Incubare il surnatante su<html> una colonna di agarosio ATP a 4 ° C per 30 min. Lavare la colonna una volta con una colonna volumi di tampone di lisi contenente 0,5 M NaCl. Eluire il 5LO con 20 mM ATP in tampone di lisi contenente 10 mM FeSO 4 e 20 mg / mL catalasi. Eseguire cromatografia su gel filtrazione per rimuovere ATP 35. NOTA: Il 5LO è instabile e deve essere utilizzato immediatamente dopo la depurazione. Altrimenti, si raccomanda di fermare nella fase di solfato di ammonio precipitazioni (vedi la nota dopo passo 2.1.3). </li></ol> 3. Preparazione del complesso Nanodisc-proteina <ol><li> Preparare un volume totale di 100 ml di complesso. Mescolare 0,8 mM ND e 0,8 mM 5LO con 1 mM Ca 2+ presente nel tampone standard MSP (20 mM Tris-HCl, pH 7.5, 100 mM NaCl; 0,5 mM EDTA e 1,5 mM CaCl 2) e incubare per 10 min sul ghiaccio. NOTA: Il campione può essere conservato per un massimo di un mese a 4 ° C 35. </li></ol>ove_title &quot;&gt; 4. analisi dei campioni <ol><li> elettroforesi su gel <ol><li> Non-denaturazione elettroforesi <ol><li> Mescolare 15 ml di campione con 5 ml di tampone di caricamento (50 mM BisTris, 6 N HCl, 50 mM NaCl, 10% (w / v) di glicerolo, e 0,001% Ponceau S, pH 7,2) 49 e caricarlo su 4 - 16% gel Bis-Tris per eseguire l&#39;elettroforesi. </li><li> Riempire il serbatoio catodo con tampone luce catodo (50 mM Bis Tris; 50 mM Tricine, pH 6,8, e 0,002% Coomassie G-250) e il serbatoio anodo con tampone di corsa (50 mM Bis Tris 50 mM Tricine, pH 6,8). Avviare la separazione con una tensione costante a 150 V. </li><li> Arrestare la separazione elettroforetica quando il fronte Coomassie raggiunge la fine del gel. </li><li> Colorare il gel con un protocollo standard blu Coomassie. </li></ol></li><li> denaturazione elettroforesi <ol><li> Mescolare 40 ml di campione con 10 ml di tampone di caricamento contenente SDS (0,05% (w / v) blu di bromofenolo, 0,2 M Tris-HCl,pH 6.8; 20% (v / v) di glicerolo; 10% (w / v) di SDS; e 10 mM 2-mercaptoetanolo) e caricarlo su un 4 - gel glicina 20% Tris eseguire elettroforesi. </li><li> Riempire i serbatoi catodo e anodo con tampone di corsa (25 mM Tris-HCl, pH 6,8; 200 mM glicina, e 0,1% (w / v) di SDS). Avviare la separazione con una tensione costante a 150 V. </li><li> Arrestare la separazione elettroforetica quando la carica frontale colorante raggiunge la fine del gel. </li><li> Colorare il gel con un protocollo standard blu Coomassie. </li></ol></li></ol></li><li> Preparazione della soluzione NAPT <ol><li> Sciogliere 1 g di sale sodico fosfotungstato in 50 mL di acqua mediante agitazione a temperatura ambiente per dare un 2% (w / v) soluzione acida. </li><li> Regolare il pH a 7,4 con 1 M NaOH. Rimuovere le particelle utilizzando un filtro a siringa da 0,22 micron. Conservare la soluzione a temperatura ambiente oa 4 ° C. </li></ol></li><li> Preparazione del campione per analisi TEM <ol><li> Glow-scarico griglie di rame di carbonio rivestita (400 maglie) per 20 s a 30 mA per rendere le griglie idrofile prima l&#39;adsorbimento del campione. Collocare 3,5 ml di campione (0,8 mM rispetto ai nanodiscs) sulla griglia e incubare per 30 s. NOTA: Il volume applicata può variare tra 2,5 e 5 microlitri, a seconda della concentrazione del campione. Un intervallo di concentrazione adatta per nanodiscs è di 0,5 - 1 micron. </li><li> Blot off soluzione in eccesso con carta da filtro. </li><li> Subito macchiare la griglia con un calo del 2% NAPT per 30 s. Blot off soluzione in eccesso e lasciare la griglia di aria secca. </li><li> Valutare le griglie di TEM. Un microscopio con 120-200 keV tensione di accelerazione sufficiente per valutare il grado di impilamento. NOTA: Per la presente protocollo, un microscopio elettronico a trasmissione calibrato è stato usato, equipaggiato con una pistola ad emissione di campo di 200 keV. </li><li> Registrare le immagini TEM. Per le immagini che mostrano lunghe pile, non elaborare ulteriormente; immagini mostrano il complesso di nanodiscs, con proteine ​​estrinseca che può contenere alcunishort stacks, ma la maggior parte delle particelle sono nel complesso. Registrare varie immagini e procedimenti questi secondo i metodi standard per ottenere di classe medie e una a bassa risoluzione, 3 modello tridimensionale del complesso. NOTA: per la raccolta di dati negativi-macchia, griglie sono state effettuate in almeno tre giorni diversi. Per ogni giorno, sono state fatte incubazione campione fresco (come nel passaggio 3.1) prima che è stata applicata la macchia negativo. </li></ol></li></ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Il metodo può essere suddiviso in tre parti: la ricostituzione di nanodiscs vuoti, la preparazione di complessi proteina-nanodisc, e la colorazione negativa per il TEM di questi complessi. Ogni parte sarà affrontata separatamente per quanto riguarda i limiti della tecnica, passaggi critici, e le modifiche utili. Ricostituzione di nanodiscs vuote. passaggi critici e limitazioni nella produzione e l&#39;uso di nanodiscs. Per la preparazione dei nanodiscs vuoti, è esse...

Nella ricerca medica, molta attenzione è focalizzata sulle proteine ​​di membrana, sia intrinseci o estrinseci, coinvolti in una varietà di interazioni lipidi. Utilizzo di proteine lipidi interagenti comprende sia selezionando un sostituto dei lipidi, quali detergenti, amphipols 1 o piccole proteine 2, o trovare un sostituto membrana che mantiene la proteina solubile ed attiva. Sostituti membrana lipoico includono liposomi e nanodiscs (ND) 3, 4. Nanodiscs sono piattaforme membrana vicino native sviluppate progettando la parte proteica, ApoA-1, della lipoproteina ad alta densità (HDL) naturalmente nel sangue. ApoA-1 è un residuo di 243-lunga catena di brevi anfipatiche alfa-eliche e presenta una conformazione solubile privo di lipidi. In vitro quando in presenza di lipidi, due copie della proteina ApoA-1 spontaneamente riorganizzano per circondare il hydrophobic porzione catena acilica di un doppio strato lipidico cerotto 5. versioni Engineered di ApoA-1 sono generalmente chiamati ponteggi proteine ​​di membrana (MSP), e un numero crescente sono disponibili in commercio come plasmidi o proteine ​​purificate. Ripetizioni o cancellazioni delle alfa-eliche in ApoA-1 risultato in più 6 o più brevi ponteggi proteine di membrana 7. Questo a sua volta rende possibile l&#39;ottenimento di dischi circa 6 nm 7 a 17 nm 8 di diametro. Ci sono diversi tipi di applicazioni per il nanodiscs 3, 9. L&#39;applicazione più comunemente usato è quello di fornire un ambiente membrana quasi nativa per la stabilizzazione di una proteina integrale di membrana 8, recensito in precedenza 3, 9. Un uso meno esplorato è quello di realizzare una superficie di membrana nanoscala per lo studioperiferica di membrana proteine 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17. Sezione 1 del protocollo di sotto visualizza la procedura relativa alle nanodiscs composte da fosfolipidi e proteine ​​di membrana impalcature. La preparazione del campione è un collo di bottiglia nella maggior parte dei metodi. campioni specifici del metodo può aggiungere informazioni particolari, ma anche fare i confronti dei risultati difficili. Pertanto, è più semplice quando i campioni sono multimodale e possono essere utilizzati direttamente in diversi metodi. Un vantaggio con l&#39;uso di nanodiscs è la piccola dimensione del nanodisc rispetto ai liposomi (ad esempio, i campioni possono essere utilizzati direttamente per entrambi TEM e non denaturante gel elettroforesi, come nel presente protocollo). <p class = &quot;jove_content&quot;&gt; vescicole e liposomi sono da tempo utilizzati per comprendere la funzione delle proteine ​​di membrana interagenti. Per gli studi strutturali e visualizzazione, un esempio della determinazione strutturale di una proteina transmembrana in liposomi è disponibile 18. Tuttavia, nessuna struttura 3D ad alta risoluzione di una proteina di membrana monotopic incorporato in una membrana liposomiale è stato ancora pubblicata, per quanto ne sappiamo. Nanoparticelle d&#39;oro o anticorpi possono essere utilizzati per visualizzare proteine leganti di liposomi o vescicole usando TEM 19. Anche se queste sonde sono molto specifici, potrebbero interferire con proteine ​​di membrana vincolante velando il sito di legame della membrana o mascherando le aree di interesse con le parti flessibili. Gold-etichettato o proteine ​​anticorpi complessato potrebbe probabilmente essere analizzati su un gel, ma ciò aumenterebbe il costo dell&#39;esperimento. Anche se liposomi sono un&#39;eccellente piattaforma, non si può essere certi che il poplamento ha un rapporto particolare di proteine per liposoma, una caratteristica che può essere esplorato con l&#39;uso di nanodiscs 20. In un liposoma, cofattori e substrati possono essere intrappolati all&#39;interno solubile. Le sostanze che sono membrana-solubili condivideranno lo stesso destino per entrambi i tipi di mimetici di membrana. Tuttavia, come la zona doppio strato è più piccola in nanodiscs, una minore quantità di sostanza è necessaria per saturare le membrane nanodisc. proteina funzione intesa attraverso la determinazione della struttura atomica è essenziale per molti campi di ricerca. Metodi per la determinazione della struttura proteica comprendono raggi X 21; risonanza magnetica nucleare (NMR) 22, 23; e microscopia elettronica a trasmissione (TEM) 24 a temperature criogeniche, cryoEM. La risoluzione cryoEM ultimamente è stata notevolmente migliorata, principalmente per l&#39;uso di elettroni de direttatectors 25, 26. Le macromolecole vengono esposte in un sottile, ghiaccio vitreo 27 in uno stato quasi native. Tuttavia, a causa del basso contrasto di molecole biologiche, diventano difficili da individuare nella gamma di dimensioni 100 - 200 kDa. Per i campioni di dimensioni opportune, raccolta dei dati può essere fatta e il metodo di ricostruzione singola particella può essere applicato per ottenere una struttura 28. Tuttavia, la determinazione della struttura delle proteine ​​mediante TEM è un processo a più fasi. Di solito inizia con la valutazione di monodispersity campione negativo-macchia TEM 29 con sali di metalli pesanti come phosphotungsten (PT) 30 31 o uranio. Ricostruzione di un modello a bassa risoluzione della macromolecola macchiato negativamente è di solito fatta e può fornire informazioni importanti sulla struttura molecolare 29. In parallelo,la raccolta dei dati utilizzando cryoEM può iniziare. Si deve prestare attenzione quando si valutano i dati TEM negativo-macchia per evitare l&#39;errata interpretazione di formazione manufatto. Un particolare manufatto è l&#39;effetto della macchia PT su fosfolipidi e liposomi 32, con conseguente formazione di lunghe aste somiglianti pile di monete viste dal lato 33. Tale &quot;rouleau&quot; o &quot;stack&quot; (di seguito indicato come &quot;stack&quot;) sono stati osservati nella fase iniziale per HDL 34, e più tardi anche per nanodiscs 35. L&#39;accatastamento e rimodellamento delle membrane possono verificarsi per molte ragioni. Ad esempio, può essere indotta da cofattori come il rame, mostrate da immagini TEM in ammonio molibdato macchia 36. Una frazione dei lipidi di membrana in liposomi conteneva un gruppo di testa di acido iminodiacetico imitando metallo complessazione da EDTA, impilamento così liposomi dopo l&#39;aggiunta di ioni rame <sfino class = &quot;xref&quot;&gt; 36. Stacking potrebbe anche essere dovuto ad una interazione proteina-proteina mediante una proteina nei o sui doppi strati lipidici (la macchia utilizzato non è menzionato) 37. La formazione pila di fosfolipidi da PT è stato osservato nella fase iniziale; Tuttavia, il lavoro in seguito si è concentrata sulla rimozione o abolire questa formazione artefatto 38. Qui, vi proponiamo un metodo per sfruttare la nanodisc NAPT indotto accatastamento per lo studio delle proteine ​​di membrana-binding da TEM. In breve, vincolante per le proteine ​​nanodiscs impedirebbe i nanodiscs da accatastamento. Sebbene le ragioni per l&#39;impilamento non sono chiari, è stato proposto 39 che vi è una interazione elettrostatica tra i fosfolipidi e il gruppo fosforile di PT, causando i dischi di aderire l&#39;uno all&#39;altro (Figura 1A). L&#39;ipotesi dietro il nostro protocollo è che quando una proteina si lega ad un nanodisc, la maggior parte della superficie fosfolipide non è dispo<html> BLE per l&#39;interazione con il terminale a causa dell&#39;impedimento sterico dalla proteina. Ciò impedisce la formazione di stack (Figura 1B). Due conclusioni possono essere tratte. In primo luogo, la prevenzione di impilamento significa che la proteina di interesse è legato alla membrana. In secondo luogo, il complesso proteina-ND può essere trattato con metodi di lavorazione singola particella standard di 24, 40 per ottenere una morfologia ruvida del complesso. Inoltre, le analisi con metodi come non-denaturazione elettroforesi su gel o dispersione della luce dinamica può essere eseguita. Per dimostrare questa ipotesi, abbiamo utilizzato la proteina di membrana-binding 5-lipossigenasi (5LO), che è coinvolto in molte malattie infiammatorie 41, 42. Questa proteina 78-kDa richiede ioni di calcio di legarsi alla sua membrana 43. Anche se questa associazione membrana è stata ampiamente studiata utilizzando liposomis = &quot;xref&quot;&gt; 44, 45, 46 e frazioni di membrana 47, questi non possono essere utilizzati per l&#39;analisi TEM e determinazione della struttura. La preparazione di nanodiscs inizia MSP con lipidi risospese nel colato di sodio detergente miscelazione. Dopo incubazione in ghiaccio per 1 h, il detersivo viene lentamente rimosso dalla miscela ricostituzione con una resina adsorbente. Questo tipo di materiale è spesso realizzato in polistirene forma in piccole perline. Essi sono relativamente idrofobo e hanno una forte preferenza per il detersivo vincolante rispetto ai lipidi 48. Dopo aver rimosso le perline idrofobiche e l&#39;esecuzione di un chiarimento mediante centrifugazione, i nanodiscs sono purificati mediante cromatografia dimensione esclusione (SEC). I nanodiscs purificati vengono miscelati con una proteina di membrana monotopic (ed eventuali cofattori) in rapporto equimolare (o più rapporti per una titolazione) e sono lasciate rEACT (15 min). Analisi mediante TEM viene effettuata applicando microlitri-quantità di campione attraverso, griglie di carbonio rivestiti bagliore scarica e poi effettuando colorazione negativa con NAPT. Lo stesso campione da cui le aliquote sono state applicate alle griglie TEM può essere utilizzato per l&#39;analisi non-denaturazione o SDS PAGE gel elettroforesi, nonché da vari tipi di misure di attività, con grandi cambiamenti.

<table><tbody><tr><td>Microscopio elettronico a trasmissione: JEOL2100F</td> telecamera <td>CCD JEOL</td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>Tiez Video and Imaging Processing System GmbH, Germania</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Scaricatore di bagliore</td><td>Griglia TEM Baltec</td><td></td><td></td></tr><tr><td>: 400 mesh</td><td>TAAB</td><td>GM016/C</td><td></td></tr><tr><td>Cromatografia ad esclusione dimensionale: Agilent SEC-5</td><td>Agilent Technologies</td><td>5190-2526</td><td></td></tr><tr><td>Superdex 200 HR 10/300</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td>17-5172-01</td><td></td></tr><tr><td>Plasmide: MSP1E3D1</td><td>Addgene</td><td>20066</td><td></td></tr><tr><td>Batteri: BL21DE3</td><td>NEB</td><td>C2527H</td><td></td></tr><tr><td>Batteri: BL21 (DE3) T1R pRARE2</td><td>Protein Science Facility, KI, Solna</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Matrice di purificazione: ATP agarosio</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A2767</td><td></td></tr><tr><td>Matrice di purificazione: HisTrap HP-5 mL</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td>17-5247-01</td><td></td></tr><tr><td>Lipidi: POPC</td><td>Avanti lipidi polari</td><td>850457C</td><td>25 mg/mL in cloroformio</td></tr><tr><td>Perle idrofobiche: Bio-Beads, resina SM-2</td><td>Bio-Rad</td><td>1523920</td><td></td></tr><tr><td>Filtro per siringa da 13 mm: 0,2 &mu; m</td><td>Pall scienze della vita</td><td>PN 4554T</td><td></td></tr><tr><td>Colorante: Sodio fosfotonato idrato tribasico</td><td>Sigma Aldrich</td><td>31648</td><td></td></tr><tr><td>2-mercaptoetanolo</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M3148-250ML</td><td></td></tr><tr><td>Sodio dodecil solfato (SDS)</td><td>Bio-Rad</td><td>161-0301</td><td></td></tr><tr><td>Cocktail di inibitori della proteasi</td><td>Sigma Aldrich</td><td>4693132001</td><td></td></tr><tr><td>TCEP</td><td>Detergente Sigma Aldrich</td><td>646547</td><td></td></tr><tr><td>: Acido di sodio idrato</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C6445-10G</td><td></td></tr><tr><td>Sodium Cholate</td><td></td><td></td><td>500 mM Sodium Cholate. Risospendere in acqua miliQ e conservare a -20 °C.</td></tr><tr><td>Stock</td><td></td><td></td> lipidico <td>50 mM POPC, 100 mM di colato di sodio, 20 mM Tris-HCl pH 7,5, 100 mM NaCl. <bt />Conservare a 4 gradi C per una settimana; o Negozio -80 &deg; C per un mese, dopo aver spurgato la soluzione con azoto.</td></tr><tr><td>Tampone</td><td></td><td></td> standard MSP <td>20 mM Tris-HCl, pH 7,5, 100 mM NaCl, 0,5 mM EDTA. Conservare a 4 °C.</td></tr><tr><td>Tampone anodico per elettroforesi non denaturante</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>BN2001</td><td>50 mM Bis-Tris, 50 mM Tricine, pH 6,8</td></tr><tr><td>Tampone catodico per elettroforesi non denaturante</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>BN2002</td><td>50 mM Bis-Tris, 50 mM Tricine, pH 6,8, 0,002% Coomassie G-250</td></tr><tr><td>Elettroforesi non denaturante 4x Tampone per il caricamento del campione</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>BN2003</td><td>50 mM di Bis-Tris, pH 7,2, 6 N HCl, 50 mM di NaCl, 10% (p/v) di glicerolo, 0,001% di Ponceau S</td></tr><tr><td>Tampone di corsa per elettroforesi denaturante Ricetta</td><td></td><td></td><td>interna: 25 mM di Tris-HCl, pH 6,8, 200 mM di glicina, 0,1% (p/v) SDS</td></tr><tr><td>Elettroforesi denaturante 5x Caricamento del campione Tampone</td><td></td><td></td><td>Ricetta interna: 0,05% (p/v) di bromofenoloblu, 0,2 M di Tris-HCl, pH 6,8, 20% (v/v) di glicerolo, 10% (p/v) SDS, 10 mM 2-mercaptoetanolo</td></tr><tr><td>Brodo</td><td></td><td></td> formidabile <td>Triptone - 12,0 g, estratto di lievito - 24,0 g, 100 mL 0,17 M KH2PO4 e 0,72 M K2HPO4, Glicerolo - 4 mL. Triptone, estratto di lievito e glicerolo sono stati preparati a 900 mL e sterilizzati in autoclave separatamente. KH2PO4 e K2HPO4 sono stati preparati e sterilizzati in autoclave separatamente. Entrambi sono stati miscelati prima di utilizzare il mezzo.</td></tr></tbody></table>

metodo per visualizzare e analizzare membrana proteine ​​interagenti con microscopia elettronica a trasmissione

Method to Visualize and Analyze Membrane Interacting Proteins by Transmission Electron Microscopy

Le proteine monotopiche esercitano la loro funzione quando sono attaccate alla superficie di una membrana, e tali interazioni dipendono dalla specifica composizione lipidica e dalla disponibilità di un'area sufficiente per svolgere la funzione. I nanodischi sono utilizzati per fornire una superficie di membrana di dimensioni e contenuto lipidico controllati. In assenza di proteine estrinseche legate, i nanodischi colorati con fosfotungstato di sodio appaiono come pile di monete se osservati lateralmente mediante microscopia elettronica a trasmissione (TEM). Questo protocollo è quindi progettato per promuovere intenzionalmente lo stacking; Di conseguenza, la prevenzione dell'impilamento può essere interpretata come il legame della proteina legante la membrana al nanodisco. In una fase successiva, le immagini TEM dei complessi proteina-nanodisco possono essere elaborate con metodi standard a singola particella per produrre strutture a bassa risoluzione come base per il lavoro di crioEM a risoluzione più elevata. Inoltre, i nanodischi forniscono campioni adatti sia per l'elettroforesi TEM che per l'elettroforesi su gel non denaturante. Per illustrare il metodo, viene presentato il legame indotto dal Ca2+ della 5-lipossigenasi sui nanodischi.

Il metodo proponiamo dipende dalla preparazione di nanodiscs per fornire la superficie della membrana per il legame monotopic membrana proteine. Poiché non esiste una proteina transmembrana integrato nel doppio strato lipidico nanodisc, i nanodiscs sono qui indicati come &quot;nanodiscs vuoti&quot; (Figura 2A). Questi hanno un peso molecolare calcolato di 256 kDa per una composizione di due proteine MSP1E3D1 ponteggi e circa 260 molecole di POPC 8.</sup...

Molte proteine svolgono la loro funzione quando sono attaccate alle superfici della membrana. Il legame di proteine estrinseche sulle membrane dei nanodischi può essere indirettamente ripreso mediante microscopia elettronica a trasmissione. Mostriamo che il caratteristico impilamento (rouleau) dei nanodischi indotto dal fosfotungstato di sodio con colorazione negativa è impedito dal legame della proteina estrinseca.

Metodo per visualizzare e analizzare membrana proteine ​​interagenti con microscopia elettronica a trasmissione

Monotopic proteins exert their function when attached to a membrane surface, and such interactions depend on the specific lipid composition and on the ...

L'obiettivo generale di questa procedura è visualizzare il legame di una proteina di membrana estrinseca sulla superficie di una membrana in nanodisc mediante microscopia elettronica a trasmissione con colorazione negativa, come primo passo verso la determinazione della struttura ad alta risoluzione della proteina. Questo metodo può contribuire a rispondere a domande fondamentali in diversi settori di ricerca, poiché riguarda attività proteiche che avvengono all'interno e sulla superficie delle membrane cellulari. Il principale vantaggio di questa tecnica è la formazione caratteristica di strutture a stack nei nanodisc qualora la proteina non riesca a legarsi alle membrane.Questi impilamenti sono chiaramente visibili mediante microscopia elettronica a trasmissione. L'utilizzo di questa tecnica ha implicazioni nello sviluppo di farmaci, poiché consente di esaminare facilmente composti per la loro capacità di bloccare o favorire le interazioni tra proteine di membrana. Sebbene questo metodo possa fornire informazioni sulle condizioni ottimali per il legame della proteina monotopica alla membrana, esso fornisce anche una struttura a bassa risoluzione del complesso proteina-nanodisco.Per iniziare la procedura, esprimere e purificare la proteina di impalcatura della membrana, come MSP1E3D1. Successivamente, utilizzando una siringa di vetro con ago metallico, dispensare 305 microlitri di 25 milligrammi per millilitro di POPC in cloroformio in un pallone di vetro a fondo rotondo. Evaporare il cloroformio sotto un flusso delicato di azoto gassoso in una cappa da laboratorio.Essiccare il lipide rimanente durante la notte in un essiccatore sotto vuoto. Quindi sciogliere il lipide essiccato in 200 microlitri di tampone standard MSP arricchito con 100 millimoli di colato di sodio come detergente. Vortexare la miscela fino a ottenere una soluzione trasparente per preparare una sospensione di 50 millimoli di POPC in tampone.Successivamente, lavare cinque grammi di perline idrofobe con 30 millilitri di metanolo al 100% e poi con 40 millilitri di acqua ultrapura e infine con 10 millilitri di tampone standard MSP. Conservare le perline in 15 millilitri di tampone standard a quattro gradi Celsius. Quindi mescolare 190 microlitri di una soluzione 0,124 millimolare di MSP1E3D1 e 61,5 microlitri di una sospensione 50 millimolare di POPC in tampone, ottenendo un rapporto molare di MSP a POPC di uno a 130 e una concentrazione di colato di sodio di 25 millimolare.Il rapporto ideale tra il lipide e la MSP varia a seconda del tipo di lipide e della MSP scelta, e deve essere ottimizzato per ottenere una preparazione omogenea di nanodischi. Incubare la miscela su ghiaccio bagnato per un'ora. Successivamente, aggiungere la soluzione a un tubo contenente 0,5 grammi di perle idrofobiche lavate per millilitro di miscela di ricostituzione, al fine di avviare l'autoassemblaggio dei nanodischi.Incubare la miscela a quattro gradi Celsius per 16 ore a sette-otto rotazioni al minuto. Al termine dell'incubazione, lasciare sedimentare le perle per gravità. Rimuovere e conservare il soprannatante a quattro gradi Celsius fino al momento di eseguire la cromatografia a esclusione dimensionale.Prima della cromatografia a esclusione dimensionale, centrifugare il campione a 13.000 g per 10 minuti a quattro gradi Celsius. Versare con cautela il soprannatante e scartare il pellet. Equilibrare una colonna per cromatografia a esclusione dimensionale con tampone standard MSP finché la linea di base a 280 nanometri non risulti stabile.Iniettare il surnatante sulla colonna e raccogliere il prodotto in frazioni da 0,5 millilitri. Misurare l'assorbanza delle frazioni a 280 nanometri mediante uno spettrofotometro UV-vis. Calcolare la concentrazione dei nanodischi utilizzando il coefficiente di estinzione molare per la MSP scelta.Per eseguire l'elettroforesi su gel non denaturante, mescolare prima 15 microlitri del campione con cinque microlitri del tampone di caricamento appropriato. Riempire il serbatoio catodico con il tampone catodico chiaro e il serbatoio anodico con il tampone di corsa. Caricare il campione su un gel Bis-Tris al 4-16% e avviare la corsa. Colorare il gel seguendo le istruzioni del produttore. Per iniziare la preparazione di un complesso proteico monotopico su nanodisco con cinque lipossigenasi come proteina, preparare un lotto di tampone MSP standard arricchito con cloruro di calcio 1,5 millimolare. Esprimere e purificare la proteina 5LO.Preparare immediatamente una miscela di 100 microlitri contenente 0,8 micromolare di 5LO e 0,8 micromolare di nanodischi in un buffer standard MSP arricchito di calcio. Il nostro esempio di una proteina monottopica, la cinque lipossigenasi, dipende dalle quantità di calcio per legarsi alla membrana. La 5LO è altamente sensibile e deve essere utilizzata entro poche ore dalla preparazione.Incubare la miscela su ghiaccio per 10 minuti. Conservare il campione del complesso proteico di nanodischi ottenuto a quattro gradi Celsius per un massimo di un mese. Per iniziare la preparazione all'analisi al microscopio elettronico a trasmissione (TEM), sciogliere un grammo di sale sodico di fosfotungstato in 50 millilitri di acqua ultrapura a temperatura ambiente.Regolare il pH della soluzione a 7,4 utilizzando una soluzione monomolare di idrossido di sodio. Filtrare la soluzione di fosfotungstato di sodio attraverso un filtro per siringa da 0,22 micrometri e conservare la soluzione a temperatura ambiente. Successivamente, eseguire una scarica al plasma su una griglia di rame ricoperta di carbonio da 400 mesh per 20 secondi a 30 milliampere per rendere la superficie della griglia idrofila.Posizionare tra 2,5 e cinque microlitri del campione del complesso proteico monotopico nei nanodischi sulla griglia e lasciare riposare il campione per 30 secondi. Quindi utilizzare carta da filtro per asportare la soluzione in eccesso dalla griglia. Applicare immediatamente una goccia di soluzione di fosfotungstato di sodio e lasciare a riposo per 30 secondi.Asciugare delicatamente l'eccesso di soluzione e lasciare asciugare la griglia all'aria. Eseguire la microscopia elettronica in trasmissione con una tensione accelerata compresa tra 120 e 200 chilovolt. Escludere le immagini che mostrano impilamenti allungati dal successivo processamento delle immagini.Per le immagini selezionate, utilizzare metodi di elaborazione standard per determinare le medie delle classi e generare un modello tridimensionale a bassa risoluzione della proteina monotopica nel nanodisco. Utilizzando questo metodo, sono stati preparati nanodischi vuoti con un rapporto di una proteina di impalcatura della membrana ogni 130 lipidi. È stato osservato un solo picco principale durante la cromatografia a esclusione dimensionale e una sola banda è stata rilevata nell'elettroforesi su gel nativo blu.Quando i nanodischi vuoti vengono trattati con una soluzione di sale sodico di fosfotungstato, si induce un impilamento. Questi lunghi impilamenti possono quindi essere osservati mediante microscopia elettronica a trasmissione (TEM). Tale impilamento non è stato interrotto dall'aggiunta di ioni calcio nella soluzione dei nanodischi prima dell'applicazione della soluzione di sale sodico di fosfotungstato.Quando una proteina monotopica come la 5-lipossigenasi è legata alla superficie del nanodisco, l'impilamento è ostacolato dall'ingombro sterico causato dalla proteina. Entrambi i lati del nanodisco sono disponibili per il legame, consentendo la formazione di complessi nanodisco-5LO in rapporto uno a uno e due a uno. Il campione di complessi nanodisco-5LO in rapporto due a uno ha mostrato un impilamento minore rispetto al campione uno a uno.Il legame della 5LO richiede la presenza di ioni calcio. Questo è stato confermato dall'osservazione di impilamento in una miscela di 5LO e nanodischi priva di calcio, che ha indicato che la 5LO non si era legata alle superfici della membrana. Una volta preparata la proteina monotopica e i nanodischi, la valutazione del legame proteico alla membrana può essere completata in un pomeriggio, se eseguita correttamente.Nel tentativo di eseguire questa procedura, è importante stimare l'area della proteina sul nanodisco per scegliere la lunghezza corretta della MSP. Per dimensioni ben compatibili, al massimo due proteine estrinseche possono legarsi, una su ciascun lato del disco. È inoltre fondamentale utilizzare il sale sodico del fosfotungstato per il contrasto negativo, al fine di garantire un impilamento massimo, poiché il legame viene confermato confrontando l'assenza di impilamenti con gli impilamenti lunghi di un campione privo di proteina monotopica.L'utilizzo di nanodischi invece di liposomi permette di impiegare la diffusione dinamica della luce e la diffrazione a raggi X a piccolo angolo per rispondere ad ulteriori domande riguardo l'omogeneità, le dimensioni o la struttura molecolare del campione. La struttura tridimensionale a bassa risoluzione di una proteina di membrana monotopica legata a un nanodisco potrebbe rappresentare un primo passo facilmente accessibile verso la struttura ad alta risoluzione di queste proteine legate.

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