Metodo per visualizzare e analizzare membrana proteine ​​interagenti con microscopia elettronica a trasmissione

L'obiettivo generale di questa procedura è quello di visualizzare il legame di una proteina estrinseca di membrana sulla superficie di una membrana di nanodisco mediante microscopia elettronica a trasmissione di colorazione negativa come primo passo verso la determinazione della struttura ad alta risoluzione della proteina. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave in diversi campi di ricerca per quanto riguarda le attività proteiche che si verificano all'interno e sulle membrane cellulari. Il vantaggio principale di questa tecnica è la caratteristica pila di forme di nanodischi se la proteina non può legarsi alle membrane.

Queste pile sono chiaramente visibili mediante microscopia elettronica a trasmissione. Le implicazioni di questa tecnica si estendono allo sviluppo di farmaci in quanto i composti possono essere facilmente sottoposti a screening per la capacità di bloccare o abilitare le interazioni proteiche di membrana. Sebbene questo metodo possa fornire informazioni sulle condizioni ottimali per il legame delle proteine monotopiche alla membrana, fornisce anche una struttura a bassa risoluzione del complesso di nanodischi proteici.

Per iniziare la procedura, esprimere e purificare la proteina dell'impalcatura di membrana come MSP1E3D1. Successivamente, utilizzando una siringa di vetro con ago di metallo, erogare 305 microlitri di 25 milligrammi per millilitro di POPC in cloroformio in un pallone di vetro a fondo tondo. Far evaporare il cloroformio sotto un leggero getto di azoto gassoso in una cappa aspirante.

Asciugare il lipide rimanente per una notte in un essiccatore sottovuoto. Quindi sciogliere il panello lipidico essiccato in 200 microlitri di tampone standard MSP arricchito con 100 millimolare di colato di sodio come detergente. Agitare la miscela fino a renderla trasparente per ottenere una sospensione di 50 millimolari di POPC in tampone.

Successivamente, lavare cinque grammi di perle idrofobiche con 30 millilitri di metanolo al 100%, quindi con 40 millilitri di acqua ultrapura e infine con 10 millilitri di tampone standard MSP. Conservare le perle sotto 15 millilitri di tampone standard a quattro gradi Celsius. Quindi combinare 190 microlitri di una soluzione 0,124 millimolare di MSP1E3D1 e 61,5 microlitri di una sospensione di 50 millimolari di POPC in tampone, ottenendo un rapporto da uno a 130 molari di MSP rispetto a POPC e una concentrazione di colato di sodio di 25 millimolari.

Il rapporto ideale tra i lipidi per MSP varia a seconda del tipo di lipidi e della lente MSP e deve essere ottimizzato per ottenere una preparazione omogenea di nanodischi. Incubare la miscela su ghiaccio bagnato per un'ora. Quindi aggiungere la soluzione in un tubo contenente 0,5 grammi di fagioli idrofobici lavati per millilitro di miscela di ricostituzione per avviare l'autoassemblaggio del nanodisco.

Incubare la miscela a quattro gradi Celsius per 16 ore a sette-otto rotazioni al minuto. Dopo l'incubazione, lasciare che le perle si depositino per gravità. Rimuovere e conservare il surnatante a quattro gradi Celsius fino al momento di eseguire la cromatografia ad esclusione dimensionale.

Prima della cromatografia ad esclusione dimensionale, centrifugare la miscela a 13.000 g per 10 minuti a quattro gradi Celsius. Decantare il surnatante e scartare il pellet. Equilibrare una colonna per cromatografia ad esclusione dimensionale con tampone standard MSP fino a quando la linea di base a 280 nanometri non è stabile.

Iniettare il surnatante sulla colonna e raccogliere il prodotto in frazioni di 0,5 millilitri. Misurare l'assorbanza delle frazioni a 280 nanometri con uno spettrofotometro UV-vis. Calcolare la concentrazione di nanodischi utilizzando il coefficiente di estinzione molare per l'MSP scelto.

Per eseguire l'elettroforesi su gel non denaturante, mescolare prima 15 microlitri di campione con cinque microlitri del tampone di caricamento appropriato. Riempire il serbatoio del catodo con un tampone catodico leggero e il serbatoio dell'anodo con un tampone di marcia. Caricare il campione su un gel Bis-Tris dal 4 al 16% e iniziare la corsa.

Colorare il gel secondo le istruzioni del produttore del gel. Per iniziare la preparazione di un complesso proteico monotopico a nanodischi con cinque lipossigenasi come proteina, preparare un lotto di tampone standard MSP arricchito con cloruro di calcio da 1,5 millimolari. Esprimi e purifica la proteina 5LO.

Preparare immediatamente una miscela da 100 microlitri di nanodischi 0,8 micromolari 5LO e 0,8 micromolari in tampone standard MSP arricchito di calcio. Il nostro esempio di una proteinasi monotopica a cinque lipossigenasi dipende dalle quantità di calcio per legarsi alla membrana. 5LO è altamente sensibile e deve essere utilizzato entro poche ore dalla preparazione.

Incubare la miscela con ghiaccio per 10 minuti. Conservare il campione risultante del complesso proteico del nanodisco a quattro gradi Celsius per un massimo di un mese. Per iniziare la preparazione per l'analisi TEM, sciogliere un grammo di sale sodico fosfotunggato in 50 millilitri di acqua ultrapura a temperatura ambiente.

Regolare il pH della soluzione a 7,4 con una soluzione monomolare di idrossido di sodio. Filtrare la soluzione di fosfotungstato sodico attraverso un filtro a siringa da 0,22 micrometri e conservare la soluzione a temperatura ambiente. Successivamente, scarica a bagliore della griglia di rame rivestita di carbonio da 400 mesh per 20 secondi a 30 milliampere per rendere idrofila la superficie della griglia.

Posizionare tra 2,5 e cinque microlitri del campione del complesso proteico monotopico nanodisc sulla griglia e lasciare riposare il campione per 30 secondi. Quindi utilizzare la carta da filtro per asciugare la soluzione in eccesso dalla griglia. Applicare immediatamente una goccia di soluzione di fosfotungstato sodico e lasciare riposare la soluzione per 30 secondi.

Asciugare la soluzione in eccesso e lasciare asciugare la griglia all'aria. Eseguire la microscopia elettronica a trasmissione con una tensione accelerata da 120 a 200 kilovolt. Escludi le immagini che mostrano pile lunghe dalla successiva elaborazione delle immagini.

Per le immagini selezionate, utilizzare metodi di elaborazione standard per determinare le medie di classe e generare un modello 3D a bassa risoluzione della proteina monotopica del nanodisco. Utilizzando questo metodo, sono stati preparati nanodischi vuoti con un rapporto di uno a 130 tra proteine di impalcatura di membrana e lipidi. Durante la cromatografia ad esclusione dimensionale è stato osservato un solo picco maggiore e nell'elettroforesi su gel nativo blu è stata osservata una sola banda.

Quando i nanodischi vuoti vengono trattati con una soluzione di sale sodico fosfotungstato, viene indotto l'impilamento. Questi lunghi stack possono quindi essere osservati da TEM. Questo impilamento non è stato interrotto dall'inclusione di ioni calcio nella soluzione di nanodischi prima dell'applicazione della soluzione di sodio fosfotungstato.

Quando una proteina monotopica come la cinque lipossigenasi è legata alla superficie del nanodisco, l'impilamento è ostacolato dall'ostruzione stearica da parte della proteina. Entrambi i lati del nanodisco sono disponibili per il legame consentendo la formazione di complessi di nanodischi 5LO uno a uno e due a uno. Il campione di due a uno di complessi di nanodischi 5LO ha mostrato un impilamento inferiore rispetto al campione uno a uno.

Il legame con 5LO richiede la presenza di ioni calcio. Ciò è stato confermato dall'osservazione dell'impilamento in una miscela di 5LO e nanodischi senza calcio, il che ha indicato che il 5LO non si era legato alle superfici della membrana. Una volta che la proteina monotopica e i nanodischi sono stati preparati, la valutazione del legame delle proteine alla membrana può essere effettuata in un pomeriggio se viene eseguita correttamente.

Durante il tentativo di questa procedura, è importante stimare l'area della proteina sul nanodisco per scegliere la lunghezza corretta dell'MSP. Per dimensioni ben abbinate, al massimo due proteine estrinseche possono legarsi una su ciascun lato del disco. È anche importante che il sale sodico del fosfototungsteno sia utilizzato per il supporto negativo per garantire il massimo impilamento, poiché il legame è confermato dal confronto tra l'assenza di pile e le pile lunghe di un campione senza una proteina monotopica.

L'uso dei nanodischi al posto dei liposomi consente l'uso della diffusione dinamica della luce, della diffusione di raggi X a piccolo angolo per rispondere a ulteriori domande sull'omogeneità del campione, sulle dimensioni o sulla struttura molecolare. La struttura 3D a bassa risoluzione di una proteina monotopica di membrana legata a un nanodisco potrebbe essere un primo passo facilmente accessibile nel percorso verso una struttura ad alta risoluzione di tali proteine legate.