Elettrico Cell-substrato Impedance Sensing per la quantificazione dei Endothelial proliferazione, Barriera funzione e motilità

L'obiettivo generale del seguente esperimento è utilizzare il rilevamento dell'impedenza elettrica tra cellule e substrato, noto come eis, per caratterizzare i comportamenti cellulari. Questo viene ottenuto coltivando le cellule su elettrodi disposti in un array ed effettuando misurazioni in diverse modalità per quantificare la formazione e la maturazione della barriera endoteliale. Vengono quindi effettuate manipolazioni, come il danno elettrico e l'aggiunta di stimolanti, per testare la motilità cellulare e la funzione della barriera. I risultati ottenuti descrivono l'adesione cellulare, la proliferazione, la migrazione, il rilevamento della permeabilità endoteliale e la valutazione dei contatti tra cellule e tra cellule e substrato, basandosi sull'esis.

Questo metodo può contribuire a rispondere a domande fondamentali nel campo della biologia cellulare, ad esempio fornendo la generazione in tempo reale di dati quantitativi e caratterizzando le cellule nel loro stato naturale di confluenza nelle comuni condizioni di coltura cellulare. Generalmente, chi si approccia per la prima volta a questo metodo potrebbe incontrare difficoltà, poiché la teoria sottostante appare complessa e occorre tenere presenti diverse considerazioni di base prima di iniziare un esperimento. Per cominciare, gli array devono essere puliti e stabilizzati per prevenire la deriva degli elettrodi, migliorare la riproducibilità e aumentare il rapporto segnale/rumore.

Pertanto, aggiungere 200 microlitri di EL ine 10 millimolare in ogni pozzetto di un array a otto pozzetti dopo 15 minuti. A temperatura ambiente, rimuovere la cistina EL con due lavaggi in acqua ultrapura, non con tamponi fosfato. Inoltre, non esporre gli elettrodi a soluzioni contenenti siero prima del rivestimento, poiché potrebbero interferire con l'assorbimento delle proteine. Successivamente, aggiungere 200 microlitri di gelatina al 1% riscaldata in ogni pozzetto e incubare l'array per mezz'ora a 37 gradi Celsius.

Per rimuovere la gelatina, utilizzare acqua ultrapura e non permettere alle superfici degli elettrodi di asciugarsi. Successivamente, riempire i pozzetti con 400 microlitri di mezzo di coltura completo, che ora può contenere siero. Inserire l'array nel supporto.

Verificare i nove quadrati dorati. Questi devono entrare in contatto con i perni POGO. Fissare con attenzione l'array a posto manualmente, serrando la vite di regolazione sul computer.

Aprire il software di misurazione. Premere su "set up" e quindi verificare nella sezione "collect data" per eseguire una misurazione rapida dell'impedenza di ogni pozzetto alla frequenza predefinita di 4.000 hertz. I valori verranno memorizzati nella sezione dei commenti.

Verificare che il controllo abbia individuato correttamente il tipo di matrice di EIS utilizzata nella sezione configurazione del pozzetto sul diagramma della matrice. Il rosso e il verde indicano la funzionalità delle connessioni. Se la pulizia e la codifica sono state eseguite correttamente, otto matrici W one E sys dovrebbero registrare circa cinque-sei NANOFARAD e otto matrici W 10 E.

La resistenza di base di 50-60 nanofarad prima della semina cellulare corrisponde quindi a circa 2000 ohm. Per modellare i dati utilizzando RB alpha e cm, avviare una registrazione MFT con l'array a mezzo fallito. Acquisire 15 minuti di dati privi di cellule e quindi terminare l'esperimento aggiungendo le cellule.

Ora rimuovere la matrice e seminare 400 microlitri di sospensione monocellulare in ciascun pozzetto. Per lo studio della crescita cellulare, utilizzare 10.000 cellule per centimetro quadrato; per ottenere una popolazione iniziale quasi confluenza, utilizzare 60.000 cellule per centimetro quadrato. Dopo aver inserito la matrice nel supporto, nella sezione di configurazione dei pozzetti, selezionare i pozzetti da misurare.

Quindi andare alle opzioni di raccolta dati e selezionare una modalità di misurazione per una serie temporale a frequenza fissa: selezionare SFT e scegliere la frequenza di misurazione per misurare la copertura dell'elettrodo e modellare RB e alpha; selezionare MFT e il dispositivo eseguirà automaticamente le misurazioni su tutte le frequenze disponibili. Eseguire la misurazione in modalità multifrequenza ogni volta che possibile. Questo richiede dati a tutte le frequenze disponibili e pertanto fornisce le informazioni più approfondite.

Per l'analisi della micro-motilità, selezionare RTC e regolare la frequenza di campionamento. La risoluzione temporale standard è un hertz, ma può essere aumentata per rilevare rapidi variazioni dell'impedenza. Il valore può essere aumentato fino a 25 hertz per lo z theta.

Per misurare in modo sequenziale il micro movimento da molte pozzette, selezionare il menu della guida. Quindi scegliere Mostra elementi della barra degli strumenti esperto e acquisisci RTC multipozzetta. Nella sezione Raccogli dati, assicurarsi di specificare il limite temporale in ore.

Quando si utilizza questa impostazione, il software chiederà il numero di cicli dopo l'avvio dell'acquisizione dei dati. Quando si raccolgono dati utilizzando SFT o MFT, selezionare l'intervallo di tempo tra le misurazioni specificato in secondi. Per un'acquisizione dati massima, lasciare questa opzione deselezionata.

Ora premere avvio e specificare dove i dati devono essere memorizzati. L'esecuzione viene interrotta premendo fine. Premendo pausa, l'acquisizione dei dati si interromperà, ma l'orologio sperimentale continuerà a funzionare.

Ora rimuovere l'array e, sotto una cappa a flusso laminare, manipolare le pozzette. Dopo aver reinserito l'array nel supporto, fare clic su "verifica connessione" per controllare i collegamenti elettrici e quindi su "riprendi esperimento" per continuare l'acquisizione dei dati. Se le cellule non devono rimanere sterili dopo la manipolazione, è possibile aggiungere direttamente una stimolazione, come la trombina, a una pozzetta durante l'acquisizione dei dati.

Le variazioni introdotte in questo modo possono essere segnate sull'orologio sperimentale premendo "mark" e aggiungendo un commento. Un'altra opzione è ferire elettricamente le cellule. Le impostazioni necessarie richiedono alcuni aggiustamenti per ottenere un tempo di ferita breve ed efficace, senza prolungarlo troppo, altrimenti si rischia di danneggiare gli elettrodi.

Inizia semplicemente con le impostazioni predefinite fornite dal software e procedi da lì. Vai alla sezione Impostazione della parata elettro della ferita ed abilita la ferita. Ora seleziona le pozzette da ferire nella configurazione delle pozzette.

Solo le pozzette selezionate verranno ferite. Cliccando su attiva verrà visualizzata una finestra pop-up che richiede l'esecuzione della ferita. Dopo la ferita, verificare che il segnale diminuisca fino a un valore corrispondente a un elettrodo quasi privo di cellule.

Se non è necessario ripetere generalmente la ferita per lavorare con i dati, utilizzare l'opzione di esportazione dei dati e selezionare Excel. Tuttavia, la modellizzazione di RB e alfa può essere eseguita direttamente all'interno del software. Dati MFT, ricordare che la modellizzazione è valida solo per strati cellulari confluenti.

E non dimenticare di aggiungere il riferimento privo di cellule. Inizia selezionando automaticamente un riferimento privo di cellule utilizzando la funzione di ricerca nella sezione di modellazione e analisi della scansione di frequenza. Accetta il valore con impostato.

Quindi premere modello per avviare i calcoli. Non allarmarsi se ciò richiede diversi minuti. Durante un esperimento tipico, le cellule passano da una fase di crescita a una fase di plateau.

Quando raggiungono la confluenza, le immagini vengono acquisite direttamente dall'elettrodo durante questo processo. La fase successiva è la formazione e la maturazione della barriera EC. Successivamente, una ferita elettrica viene utilizzata per studiare la migrazione cellulare.

Un caratteristico calo del segnale fino al livello di base è seguito dal ripristino dello stato di confluenza. Infine, la risposta agli stimoli viene monitorata in tempo reale. In questo caso, è stato applicato l'agente vasoattivo trombina.

Questo ha causato una contrazione cellulare e, di conseguenza, l'apertura transitoria di piccole fessure nella barriera, determinando una riduzione dell'impedenza. Le misurazioni della resistenza e della capacità forniscono informazioni complementari sull'adesione cellulare e sulla resistenza alla crescita, in particolare nel punto di misurazione più sensibile. La frequenza rappresenta la qualità e la funzionalità della barriera cellulare e tiene conto della resistenza al flusso di corrente paracellulare e transcellulare. Quando le cellule si attaccano agli elettrodi, limitano il passaggio di corrente e la capacità diminuisce in modo proporzionale.

Questa fase fornisce una misurazione complessiva della copertura dell'elettrodo ed è meglio quantificata registrando la capacità a una frequenza superiore a 40 kilohertz. La resistenza fornisce un'indicazione chiara della capacità delle cellule di ostacolare il flusso di corrente e quindi della qualità della barriera cellulare. Pertanto, cellule appartenenti a passaggi diversi e di tipi diversi presentano resistenze differenti.

Il nostro RB e alpha consentono di distinguere tra adesioni cellula-cellula e adesioni cellula-matrice. RB è la resistività dei contatti cellula-cellula al passaggio della corrente, ovvero una misura inversa della permeabilità. Alpha è una misura dei contributi all'impedenza provenienti dalle giunzioni cellula-elettrodo.

I valori di RB e di alpha possono essere calcolati all'interno del software ISIS. Piccole fluttuazioni nel segnale di resistenza possono essere dovute a lievi movimenti dello strato cellulare confluenziale o a micro movimenti. Possono essere misurati con un array E alla frequenza più sensibile e analizzati mediante trasformata di Fourier veloce all'interno del software EIS; manipolazioni che forniscono informazioni sul comportamento cellulare possono essere eseguite con precisione.

Ad esempio, è possibile creare una ferita elettrica di 250 micron che si richiude nel giro di poche ore per studiare la migrazione cellulare. La spettroscopia di impedenza è anche particolarmente adatta per analizzare l'effetto di sostanze aggiunte. Come osservato in precedenza, la trombina rende l'barriera cellulare iperpermeabile riducendo la tensione basale delle cellule; con un inibitore della chinasi ARO, l'effetto della trombina potrebbe essere ridotto. Nel tentativo di eseguire questa procedura, è importante ricordare che l'ESIS è estremamente sensibile ai cambiamenti nell'ambiente cellulare, come temperatura, pH, esaurimento del mezzo e così via.

Dopo il suo sviluppo, questa tecnica ha aperto la strada ai ricercatori nel campo dell'ologia per studiare in tempo reale le tendenze e gli effetti degli agenti vasocoattivi su colture cellulari confluenti.