Elettrico Cell-substrato Impedance Sensing per la quantificazione dei Endothelial proliferazione, Barriera funzione e motilità

L'obiettivo generale del seguente esperimento è quello di utilizzare il rilevamento dell'impedenza del substrato delle celle elettriche noto come eis per caratterizzare i comportamenti cellulari. Ciò si ottiene facendo crescere le cellule su elettrodi in un array ed effettuando misurazioni in diverse modalità per quantificare la formazione, la maturazione e le manipolazioni della funzione della barriera endoteliale, come l'avvolgimento elettrico e l'aggiunta di stimolanti, per testare la motilità cellulare e la funzione di barriera. Si ottengono risultati che descrivono l'attaccamento cellulare, la proliferazione, la migrazione, il rilevamento della permeabilità endoteliale e la valutazione dei contatti cellulari, cellulari e del substrato cellulare in base all'esis.

Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo della biologia cellulare, come fornire la generazione online di dati quantitativi, caratterizzare le cellule nel loro stato di confluenza naturale nelle loro condizioni standard di coltura cellulare. In generale, le persone nuove a questo metodo hanno difficoltà perché la teoria sottostante sembra complessa e devi essere consapevole di diverse considerazioni di base prima di iniziare un esperimento. Per iniziare, gli array devono essere puliti e stabilizzati per prevenire la deriva degli elettrodi, migliorare la riproducibilità e aumentare il rapporto di intensità del segnale.

Pertanto, aggiungere 200 microlitri di EL ine da 10 millimolari a ciascun pozzetto di un array di otto pozzetti dopo 15 minuti A temperatura ambiente, rimuovere la cistina EL con due lavaggi di acqua ultrapura, non tamponi fosfato. Inoltre, non esporre gli elettrodi a soluzioni contenenti siero prima del rivestimento in quanto possono interferire con l'assorbimento delle proteine. Quindi, aggiungi 200 microlitri di gelatina riscaldata all'1% in ciascun pozzetto e incuba l'array per mezz'ora a 37 gradi Celsius.

Per rimuovere la gelatina, utilizzare acqua ultrapura e non lasciare che le superfici degli elettrodi si secchino. Quindi riempire i pozzetti con 400 microlitri di terreno di coltura completo, che ora può contenere siero. Caricare l'array nel supporto.

Controlla i nove quadrati d'oro. Dovrebbero contattare i pin POGO. Fissare con cura l'array in posizione a mano, serrando la vite di regolazione sul computer.

Aprire il software di misurazione. Premere set up e quindi controllare nella sezione Raccogli dati per eseguire una rapida misurazione dell'impedenza di ciascun pozzetto alla frequenza predefinita di 4.000 hertz. I valori verranno memorizzati nella sezione commenti.

Assicurati che il controllo abbia scelto accuratamente il tipo di array EIS in uso nella sezione di configurazione del pozzo sul diagramma array. Il rosso e il verde indicano la funzionalità delle connessioni. Se la pulizia e la codifica hanno avuto successo, otto array di sistema W one E dovrebbero registrare circa cinque o sei array NANOFARAD e otto array W 10 E.

La resistenza di base da 50 a 60 nanofarad prima della semina cellulare è quindi di circa 2000 ohm. Per modellare i dati utilizzando RB alfa e cm, avviare una registrazione MFT con l'array medio guasto. Prendi 15 minuti di dati senza celle e termina l'esperimento per aggiungere le celle.

Ora rimuovi l'array e semina 400 microlitri di sospensione a cellula singola in ogni pozzetto. Per studiare i semi di crescita cellulare, 10.000 cellule per centimetro quadrato per iniziare con un seme di popolazione quasi confluente, 60.000 cellule per centimetro quadrato. Dopo aver caricato l'array nel supporto, nella sezione di configurazione dei pozzetti, selezionare i pozzetti da misurare.

Quindi vai alle opzioni di raccolta dati e seleziona una modalità di misurazione per una serie temporale a una frequenza fissa, seleziona SFT e scegli la frequenza di misurazione per misurare la copertura dell'elettrodo e modellare RB e alfa seleziona MFT e il dispositivo eseguirà automaticamente misurazioni a tutte le frequenze disponibili. Eseguire la misurazione in modalità multifrequenza quando possibile. Ciò richiede dati a tutte le frequenze disponibili e quindi fornisce la maggior parte delle informazioni.

Per l'analisi del micromovimento, selezionare RTC e regolare la frequenza di campionamento. La risoluzione temporale standard è di un hertz, ma può essere aumentata per tenere traccia di rapidi cambiamenti di impedenza. Il valore può essere aumentato a 25 hertz per lo z theta.

Per misurare il micromovimento in sequenza da molti pozzetti, selezionare il menu di aiuto. Quindi scegli Mostra voci di menu della barra degli strumenti avanzata e acquisisci e RTC a più pozzetti. Nella sezione Raccogli dati, assicurati di specificare il limite di tempo in ore.

Quando si utilizza questa impostazione, il software richiederà il numero di cicli dopo l'avvio dell'acquisizione dei dati. Quando si raccolgono dati utilizzando SFT o MFT, selezionare l'intervallo di tempo tra le misurazioni specificato in secondi. Per la massima acquisizione dei dati, lasciare questa opzione deselezionata.

Ora premi start e specifica dove devono essere archiviati i dati. La corsa viene interrotta premendo il tasto finish. Premendo pausa, l'acquisizione dei dati si fermerà, ma l'orologio sperimentale continuerà a funzionare.

Ora rimuovi l'array e sotto una cappa a flusso laminare, manipola i pozzetti. Dopo aver restituito l'array al supporto, fare clic su Controlla connessione per verificare i collegamenti elettrici, quindi riprendere l'esperimento per continuare a raccogliere i dati. Se le cellule non devono essere sterili dopo la manipolazione, uno stimolo come la trombina può essere aggiunto direttamente a un pozzetto durante l'acquisizione dei dati.

Tali variazioni introdotte possono essere contrassegnate sull'orologio sperimentale premendo il segno e aggiungendo un commento. Un'altra opzione è quella di avvolgere elettricamente le cellule. Le impostazioni per questo richiedono alcune modifiche per ottenere un tempo di ferita breve e non è efficace troppo a lungo e puoi danneggiare gli elettrodi.

Basta iniziare con le impostazioni predefinite fornite dal software e partire da lì. Vai alla sezione di configurazione della parata elettrica avvolta e abilita l'avvolto. Ora seleziona i pozzetti da avvolgere nella configurazione del pozzo.

Solo i pozzi controllati saranno feriti. Facendo clic su Attiva viene visualizzata una finestra pop-up che richiede la ferita. Dopo l'avvolgimento, verificare che il segnale scenda a un valore di un elettrodo quasi privo di celle.

Se non ha ripetuto la ferita in genere per lavorare con i dati, utilizzare l'opzione di esportazione dei dati e selezionare per Excel. La modellazione RB e alfa, tuttavia, può essere eseguita dall'interno del software. Dai dati MFT, ricorda che la modellazione è valida solo negli strati di celle di confluenza.

E non dimenticare di aggiungere il riferimento senza celle. Inizia selezionando automaticamente un riferimento privo di celle utilizzando la funzione di ricerca nella sezione di modellazione e analisi della scansione di frequenza. Accettate il valore con set.

Quindi, premi modello per avviare i calcoli. Non allarmarti se ci vogliono diversi minuti. Durante un tipico esperimento, le cellule passano da una fase di crescita a una fase di plateau.

Quando raggiungono la confluenza, le immagini vengono acquisite direttamente dall'elettrodo durante questo processo. La fase successiva è la formazione e la maturazione della barriera EC. L'avvolgimento elettrico viene quindi utilizzato per studiare la migrazione cellulare.

Una caratteristica caduta del segnale rispetto alla linea di base è seguita dal ristabilimento dello stato di confluenza. Infine, la risposta agli stimoli viene seguita in tempo reale. Qui è stato applicato l'agente vasoattivo trombina.

Ciò ha causato la contrazione cellulare e quindi un'apertura transitoria di piccoli spazi vuoti nella barriera, che ha causato un calo della resistenza all'impedenza e le misurazioni della capacità forniscono informazioni complementari sull'adesione cellulare e sulla resistenza alla crescita alla misurazione più sensibile. La frequenza rappresenta la qualità e la funzione della barriera cellulare e prende in considerazione la resistenza al flusso di corrente paracellulare e transcellulare. Quando le celle si attaccano agli elettrodi, limitano il flusso di corrente e la capacità scende proporzionalmente.

Questa fase fornisce una misura complessiva della copertura dell'elettrodo ed è meglio quantificarla quando si registra la capacità a una frequenza superiore a 40 kilohertz. La resistenza dà un'idea chiara di come le celle buone possano bloccare il flusso di corrente e quindi la qualità della barriera cellulare. Pertanto, cellule di passaggi diversi e tipi diversi hanno resistenze diverse.

Il nostro RB e alfa aiuta a distinguere tra le aderenze delle cellule cellulari e della matrice cellulare. RB è la resistività dei contatti delle cellule cellulari con il flusso di corrente, o una misura inversa della permeabilità. Alpha è una misura dei contributi di impedenza dalle giunzioni degli elettrodi della cella.

Sia il valore RB che quello alfa possono essere calcolati all'interno del software ISIS. Piccole fluttuazioni nel segnale di resistenza possono essere dovute a movimenti sottili nello strato di celle di confluenza o a micro movimenti. Possono essere misurati con un array E alla frequenza più sensibile e analizzati mediante una rapida trasformazione di Fourier all'interno del software EIS, le manipolazioni che forniscono informazioni sul comportamento cellulare possono essere effettuate con precisione.

Ad esempio, è possibile realizzare una ferita elettrica di 250 micron che si chiuderà entro poche ore per studiare la migrazione cellulare. La spettroscopia di impedenza è anche adatta per analizzare l'effetto delle sostanze aggiunte. Come notato in precedenza, la trombina rende la barriera cellulare iperpermeabile abbassando la tensione delle cellule basali con l'inibitore della ARO chinasi, l'effetto della trombina potrebbe essere diminuito Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordare che l'ESIS è estremamente sensibile ai cambiamenti nell'ambiente cellulare come temperatura, pH, deplezione del mezzo e così via.

Dopo il suo sviluppo. Questa tecnica ha aperto la strada ai ricercatori nel campo della ologia per studiare in tempo reale le tendenze e gli effetti degli agenti vasoattivi sulle colture cellulari di confluenza.