Una tecnica Microfluidic per sondare deformabilità cellulare

L'obiettivo generale del seguente esperimento è studiare la deformabilità di diversi tipi cellulari mediante un semplice saggio basato sulla microfluidica. Questo viene ottenuto realizzando un dispositivo microfluidico in poli(dimetilsilossano), o PDMS, per analizzare la scala temporale del transito cellulare attraverso una serie di restrizioni su scala micrometrica. Successivamente, un flusso a pressione controllata viene utilizzato per spingere le cellule attraverso i canali microfluidici, consentendo così di valutare la deformazione e il rilassamento dipendente dal tempo di singole cellule. In seguito, viene eseguito un programma di analisi automatica delle immagini per elaborare i video e ottenere un istogramma dei dati relativi ai tempi di transito.

I risultati mostrano che diversi tipi cellulari presentano differenze nella deformabilità cellulare in base al tempo di transito attraverso una serie di restringimenti. Il principale vantaggio di questa tecnica rispetto alle tecniche esistenti, come la microscopia a forza atomica o l'aspirazione con micropipetta, è che i dispositivi microfluidici possono operare con successo ad alte capacità di throughput. Sebbene altri dispositivi microfluidici possano essere utilizzati anche per saggiare la deformabilità cellulare.

Progettiamo il nostro dispositivo in modo che le cellule attraversino restringimenti sequenziali, una geometria comune in contesti fisiologici come il letto capillare polmonare. Per iniziare, progettare il dispositivo microfluidico selezionando una larghezza dei canali dell'array di restringimenti pari a circa il 30-50% del diametro medio delle cellule e un'altezza del canale pari ad almeno il 50% del diametro cellulare. Includere un filtro nei porti di ingresso per rimuovere detriti e disaggregare i cluster cellulari.

Prima di iniziare l'esperimento, realizzare il master del dispositivo utilizzando tecniche standard di micro-litografia. Verificare l'altezza delle caratteristiche del pattern mediante un profilometro. Successivamente, collegare la sorgente d'aria per il flusso a pressione utilizzando una bombola di aria compressa e una serie di regolatori e raccordi per aria.

Prima configurare un serbatoio di alimentazione d'aria e un regolatore manuale. Quindi, configurare un regolatore di pressione controllato elettronicamente in serie con il regolatore manuale. Utilizzare il semplice codice scritto in LabVIEW per impostare la pressione desiderata.

Il convertitore elettropneumatico utilizza un anello di retroazione interno per regolare la pressione all'uscita della valvola in modo da corrispondere alla pressione specificata attraverso il dispositivo microfluidico. Configurare una camera pressurizzata per generare il flusso della sospensione cellulare assemblando una camera per la sospensione cellulare utilizzando un tubo standard per citometria a flusso e un tappo lavorato meccanicamente che crea una tenuta ermetica sul tubo. Il tappo della camera pressurizzata contiene due aperture: un ingresso collegato alla bombola d'aria compressa e un'uscita attraverso la quale le cellule fluiscono dalla camera pressurizzata al dispositivo.

Successivamente, impostare un microscopio invertito dotato di una telecamera con una frequenza di acquisizione di almeno 100 fotogrammi al secondo. Per catturare immagini delle cellule in flusso attraverso l'array di strozzature, preparare quindi una soluzione stock di tensioattivo in soluzione salina tamponata al fosfato o PBS, poiché l'aggiunta di una piccola quantità di tensioattivo alla soluzione di mezzo cellulare aiuterà a ridurre al minimo l'adesione delle cellule alle pareti in PDMS. Per fabbricare il blocco in PDMS con canali microfluidici, aggiungere un grammo di agente indurente a 10 grammi di base in PDMS e mescolare accuratamente.

Versare la miscela sul dispositivo. Degasificare il master in una campana a vuoto con vuoto applicato fino alla scomparsa delle bolle intrappolate, oppure per circa da 10 a 20 minuti. Trascorso questo tempo, potrebbero essere ancora presenti bolle all'interfaccia ARIA-PDMS, il che è normale.

Questi di solito si dissiperanno durante la cottura. Successivamente, cuocere il dispositivo Degas a 65 gradi Celsius per quattro ore dopo che il dispositivo si è raffreddato. Rimuovere i dispositivi microfluidici dallo stampo master.

Iniziare sollevando delicatamente un angolo del dispositivo. Staccare lentamente e con delicatezza, invece di sollevare il blocco in PDMS direttamente verso l'alto, riduce lo stress sia sul PDMS che sul master. Tagliare singoli dispositivi microfluidici dal blocco in PDMS con una lametta e rimuovere il dispositivo dal master. Praticare fori nel dispositivo in PDMS per creare porte di collegamento per l'accesso tra tubi e microcanali. Creare i fori dal lato dei canali fino al lato esterno del dispositivo utilizzando un punch per biopsia.

Sciacquare il dispositivo in PDMS con isopropanolo per rimuovere polvere e frammenti di PDMS. Assicurarsi che i fori perforati siano liberi da detriti indirizzando un flusso costante di isopropanolo puro da una bottiglia con beccuccio attraverso i fori. Asciugare con aria filtrata.

Pulire il substrato di vetro risciacquandolo con metanolo. Quindi asciugarlo con aria filtrata e posizionarlo su una piastra riscaldata a 200 gradi Celsius per cinque-dieci minuti per assicurarsi che il vetro sia completamente pulito e asciutto prima del trattamento al plasma. Come descritto nel protocollo testuale, ispezionare il dispositivo microfluidico al microscopio.

Assicurarsi che i canali non siano collassati o danneggiati e che entrambi i fori di ingresso e di uscita siano collegati direttamente ai canali del dispositivo utilizzando un obiettivo a basso ingrandimento. Posizionare la sospensione cellulare in un tubo per citometria a flusso e collegarlo al tappo a pressione prima di connettere il tubicino al dispositivo microfluidico; regolare la pressione a circa 14-21 kilopascal e lavare fino a quando la sospensione cellulare non fuoriesce dalla punta del tubicino. Successivamente, posizionare il dispositivo su una superficie piana per inserire il tubicino nell'ingresso del dispositivo.

Poiché il vetrino di vetro legato alla parte inferiore del dispositivo in PDMS è fragile, inserire la punta del tubo contenente la sospensione cellulare nell'ingresso del dispositivo. Quindi inserire un pezzo di tubo nel porto di uscita e indirizzarlo verso un tubo vuoto per la raccolta degli scarti, ad esempio un tubo Falcon vuoto fissato con nastro al lato del piatto del microscopio.

Aumentare delicatamente la pressione fino a circa 28 chilopascal o fino a quando le cellule non scorrono attraverso i canali. Posizionare il dispositivo in modo che più canali siano nel campo visivo e siano perpendicolari al bordo inferiore dello schermo. Per iniziare l'analisi dei dati, aprire il file script principale m ed eseguire il programma.

Selezionare il primo video da analizzare dalla finestra di Windows Explorer che appare. Specificare la frequenza dei fotogrammi per il video selezionato e premere invio. Apparirà una figura che chiede all'utente di selezionare una finestra rettangolare per il ritaglio.

Per il primo video, selezionare una finestra che comprenda tutti i canali da sinistra a destra e intersechi i canali appena sopra la prima ampolla dell'array di canali. In alto e in basso, selezionare le regioni di strozzamento dall'immagine ritagliata. L'algoritmo mostra la segmentazione delle cellule per i primi 50 fotogrammi di ciascun video.

Monitorare attentamente l'immagine in alto a sinistra per determinare se l'algoritmo sta localizzando correttamente le cellule. Un'immagine elaborata viene sovrapposta al video originale. Per dimostrare la posizione delle cellule identificate, selezionare il video successivo da elaborare nella finestra di Windows Explorer.

L'algoritmo verrà ripetuto. Per ogni video selezionato, selezionare annulla. Una volta che tutti i video desiderati sono stati aggiunti tramite la finestra di Esplora file per indicare che l'elenco dei video è completo, i risultati rappresentativi per il tempo di transito delle cellule HL 60 e delle cellule di tipo neutrofilo HL 60 mostrano la scala temporale necessaria a una singola cellula per transitare attraverso una serie di strozzature.

Il tempo viene misurato per una popolazione di singole cellule a ogni strozzatura di sette micrometri in una serie di sette strozzature. A una pressione di spinta di 28 chilopascal, le cellule HL 60 occludono temporaneamente la prima strozzatura per un tempo mediano di 9,3 millisecondi prima di passare attraverso le strozzature successive. Al contrario, le cellule HL 60 di tipo neutrofilo occludono la prima strozzatura soltanto per 4,3 millisecondi prima di passare.

Dopo aver superato il primo restringimento, le cellule transitano più rapidamente attraverso i restringimenti successivi, dal secondo al settimo, con un tempo mediano di transito di 4,0 millisecondi per le cellule HL 60 e di 3,3 millisecondi per le cellule di tipo neutrofilo. Confrontando i tempi di transito tra diverse popolazioni cellulari, è possibile rivelare differenze nella deformabilità cellulare. Dopo aver visto questo video, si dovrebbe avere una buona comprensione di come misurare la deformabilità di diversi tipi cellulari utilizzando un semplice saggio microfluidico.

Qui, un flusso generato da pressione viene utilizzato per far passare le cellule attraverso canali microfluidici, consentendo la deformazione e il rilassamento delle singole cellule da sottoporre a saggio.