Una tecnica Microfluidic per sondare deformabilità cellulare

L'obiettivo generale del seguente esperimento è quello di studiare la capacità di deformazione di diversi tipi di cellule utilizzando un semplice saggio basato sulla microfluidica. Ciò si ottiene fabbricando un dispositivo microfluidico in polidimetilsusciano o PDMS per sondare la scala temporale del transito cellulare attraverso una sequenza di scale micron Il flusso guidato dalla pressione delle costrizioni viene quindi utilizzato per guidare le cellule attraverso i loro canali microfluidici, il che consente di analizzare la deformazione e il rilassamento dipendente dal tempo delle singole cellule. Successivamente, viene eseguito il programma di analisi automatizzata delle immagini per elaborare i video e ottenere un istogramma dei dati del tempo di transito.

I risultati mostrano che diversi tipi di cellule mostrano differenze nella capacità di deformare le cellule in base al loro tempo di transito attraverso una serie di costrizioni. Il vantaggio principale di questa tecnica rispetto alle tecniche esistenti come la microscopia a forza atomica o l'aspirazione con micropipetta è che i dispositivi microfluidici possono funzionare con successo con elevate capacità di produzione. Mentre altri dispositivi microfluidici possono essere utilizzati anche per saggiare la deformabilità cellulare.

Progettiamo il nostro dispositivo in modo che le cellule passino attraverso costrizioni sequenziali, una geometria comune in contesti fisiologici come il letto capillare polmonare. Per iniziare, progettare il dispositivo microfluidico selezionando la larghezza dei canali dell'array di costrizione in modo che sia circa il 30-50% del diametro medio della cella e l'altezza del canale sia almeno il 50% del diametro della cella. Includere un filtro alle porte di ingresso per rimuovere i detriti e disaggregare i cluster di celle.

Prima di iniziare l'esperimento, fabbricare il master del dispositivo utilizzando tecniche standard per la microlavorazione litografica. Verificare l'altezza delle funzioni del modello utilizzando un profilometro. Successivamente, riparare la fonte d'aria per il flusso azionato dalla pressione utilizzando un serbatoio di aria compressa e una sequenza di regolatori e raccordi dell'aria.

Per prima cosa predisporre un serbatoio di alimentazione dell'aria e un regolatore manuale. Quindi impostare un regolatore di pressione a controllo elettronico in linea con il regolatore manuale. Utilizza il semplice codice scritto in LabVIEW per inserire la pressione desiderata.

Il convertitore elettropneumatico utilizza un circuito di retroazione interno per regolare la pressione di uscita della valvola in modo che corrisponda alla pressione specificata attraverso il dispositivo microfluidico. Impostare una camera pressurizzata per guidare il flusso della sospensione cellulare assemblando una camera di sospensione cellulare da un tubo standard del citometro a flusso e da un tappo lavorato che crea una tenuta stagna sul tubo. Il tappo della camera a pressione contiene due orifizi, un ingresso che si collega al serbatoio dell'aria compressa e un'uscita attraverso la quale le celle fluiscono dalla camera pressurizzata nel dispositivo.

Successivamente, installa un microscopio invertito dotato di una fotocamera con una velocità di acquisizione di almeno 100 fotogrammi al secondo. Per acquisire immagini delle cellule che fluiscono attraverso l'array di costrizione, preparare una soluzione stock di tensioattivo in soluzione salina tamponata con fosfato o PBS, poiché l'aggiunta di una piccola quantità di tensioattivo alla soluzione del terreno cellulare aiuterà a ridurre al minimo l'adesione cellulare alle pareti del PDMS. Per fabbricare il blocco PDMS con canali microfluidici, aggiungere un grammo di agente indurente a 10 grammi di base PDMS e mescolare accuratamente.

Versare il composto sul dispositivo. Master Degas in una campana di vetro con vuoto applicato fino a quando le bolle intrappolate scompaiono, o per circa 10-20 minuti. Trascorso questo tempo, potrebbero esserci ancora bolle sull'interfaccia AIR PDMS, il che è normale.

Questi in genere si dissipano durante la cottura. Quindi cuocere il dispositivo Degas a 65 gradi Celsius per quattro ore dopo che il dispositivo si è raffreddato. Rimuovere i dispositivi microfluidici dallo stampo master.

Inizia sollevando delicatamente un angolo del dispositivo. Peeling lento e delicato invece del sollevamento Il blocco PD DMS verso l'alto riduce lo stress sia sul PDMS che sul master Tagliare i singoli dispositivi microfluidici dal blocco PDMS con una lama di rasoio e rimuovere il dispositivo dal master Praticare i fori nel dispositivo PDMS per creare porte di collegamento per l'accesso tra tubi e microcanali. Creare dei fori dal lato del canale fino al lato esterno del dispositivo utilizzando un punzone per biopsia.

Sciacquare il dispositivo PDMS con isopropanolo per rimuovere la polvere e depositare pezzi di PDMS. Assicurati che i fori perforati siano privi di detriti dirigendo un flusso costante di isopropanolo puro da un flacone da spremere attraverso i fori. Asciugare con aria filtrata.

Pulire il substrato di vetro risciacquando con metanolo. Quindi asciugare con aria filtrata e posizionare su una piastra riscaldante a 200 gradi Celsius per cinque-10 minuti per assicurarsi che il vetro sia completamente pulito e asciutto prima del trattamento al plasma. Come dettagliato nel protocollo di testo, ispezionare il dispositivo microfluidico al microscopio.

Assicurarsi che i canali non siano collassati o rotti e che sia i fori di ingresso che quelli di uscita si colleghino direttamente ai canali del dispositivo utilizzando un obiettivo a bassa potenza. Posizionare la sospensione cellulare in un tubo del citometro a flusso e collegarla al tappo a pressione prima di collegare il tubo al dispositivo microfluidico, regolare la pressione a circa 14-21 kilopascal e sciacquare fino a quando la sospensione cellulare non fuoriesce dalla punta del tubo. Quindi, posizionare il dispositivo su una superficie piana per inserire il tubo nell'ingresso del dispositivo.

Poiché il vetrino di copertura incollato alla parte inferiore del dispositivo PDMS è fragile. Inserire la punta del tubo contenente la sospensione cellulare nell'ingresso del dispositivo. Quindi inserire un pezzo di tubo nella porta di uscita e instradarlo in un tubo vuoto per la raccolta dei rifiuti, come un tubo Falcon vuoto fissato con nastro adesivo al lato del tavolino del microscopio.

Aumentare delicatamente la pressione a circa 28 kilopascal o fino a quando le cellule fluiscono attraverso i canali. Posizionare il dispositivo in modo che più canali si trovino nel campo visivo e siano perpendicolari alla parte inferiore dello schermo. Per iniziare l'analisi dei dati, aprire il file m dello script principale ed eseguire il programma.

Seleziona il primo video da analizzare dalla finestra di Esplora risorse che appare. Specificare la frequenza dei fotogrammi per il video selezionato e premere invio. Apparirà una figura che richiede all'utente di selezionare una finestra di ritaglio rettangolare.

Per il primo video, selezionate una finestra che includa tutti i canali da sinistra a destra e intersechi i canali appena sopra la prima lampadina della matrice di canali. In alto e in basso, seleziona le regioni di costrizione dall'immagine ritagliata. L'algoritmo visualizza la segmentazione delle celle per i primi 50 fotogrammi di ogni video.

Monitora attentamente l'immagine in alto a sinistra per determinare se l'algoritmo sta localizzando con precisione le celle. Un'immagine izzata viene sovrapposta al video sorgente. Per dimostrare la posizione delle celle identificate, selezionare il video successivo da elaborare dalla finestra di Esplora risorse.

L'algoritmo si ripeterà. Per ogni video selezionato, seleziona Annulla. Una volta che tutti i video desiderati sono stati aggiunti tramite la finestra di Esplora risorse per indicare la funzione che l'elenco dei video è completo, i risultati rappresentativi per il tempo di transito delle cellule HL 60 e dei neutrofili HL 60 mostrano la scala temporale per il transito di una singola cellula attraverso una serie di costrizioni di transito.

Il tempo viene misurato per una popolazione di singole cellule ad ogni costrizione di sette micrometri in una serie di sette costrizioni. A una pressione di guida di 28 Kilopascal, le celle HL 60 occludono temporaneamente la prima costrizione per un tempo mediano di 9,3 millisecondi prima di impacchettare le costrizioni successive. Al contrario, le cellule neutrofile di tipo HL 60 occludono la prima costrizione per soli 4,3 millisecondi prima del confezionamento.

Una volta superate le prime cellule di costrizione, le cellule transitano più rapidamente attraverso le costrizioni rimanenti da due a sette, con un tempo di transito mediano di 4,0 millisecondi per le cellule HL 60 e di 3,3 millisecondi per le cellule di tipo neutrofilo. Confrontando il tempo di transito tra le popolazioni cellulari, è possibile rivelare differenze nell'informabilità cellulare. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come misurare la capacità di deformazione di diversi tipi di cellule utilizzando il semplice saggio microfluidico.

In questo caso, il flusso guidato dalla pressione viene utilizzato per guidare le cellule attraverso canali microfluidici, il che consente di analizzare la deformazione e il rilassamento delle singole cellule.