Name: Una tecnica Microfluidic per sondare deformabilità cellulare (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-09-03T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 47 s
Description: Scopri come misurare la deformabilità cellulare con un saggio microfluidico ad alto throughput. Questa tecnica utilizza dispositivi PDMS e flusso guidato da pressione per analizzare i tempi di transito attraverso strozzature di micron.

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Gli autori vorrebbero riconoscere Lloyd Ung per l&#39;input costruttivo nelle prime versioni di questa tecnica, il dottor Jeremy Agresti per le punte di design tappo a pressione, e il dottor Dongping Qi per il suo aiuto nella fabbricazione il tappo di pressione. Siamo grati ai laboratori di M. Teitell e P. Gunaratne per fornire una varietà di campioni di cellule per il test. Siamo grati per la National Science Foundation (CARRIERA Premio DBI-1254185), la UCLA Jonsson Comprehensive Cancer Center, e la UCLA clinica e traslazionale Science Institute per sostenere questo lavoro.

1 Microfluidic Device Design NOTA: Il disegno dispositivo ha quattro regioni funzionali di base: porta di entrata, filtro cellule, matrice costrizione, e la porta di uscita (Figura 1). Il disegno complessivo può essere applicato a una vasta gamma di tipi di cellule, con piccoli aggiustamenti alle dimensioni. Purché ecco alcuni consigli di progettazione di base insieme con i parametri del dispositivo che sono efficaci per una selezione di entrambe le cellule primarie e fotografati. <ol><li> Selezionare la larghezza dei canali di matrice costrizione (Figura 1B) a circa il 30-50% del diametro medio delle cellule; Questa costrizione-cellula dimensioni quoziente desse un risultato deformazione delle cellule significativo ma intasamento minimo. Dato un tipo di cellula che non è stato testato in precedenza, è prudente progettare una gamma di larghezze di costrizione da ~ 30-50% il diametro delle cellule per trovare la larghezza ottimale. Come con molti tipi di dispositivi microfluidici, oltre 120 maestri stampi dispositivo possono essere modellati su un peccatogle wafer di silicio da 4 pollici, che consente una serie di disegni di dispositivi diversi per essere fabbricato in un unico processo di fabbricazione. </li><li> Selezionare l&#39;altezza del canale di almeno il 50% del diametro della cellula; ciò assicura la cella è confinata in 2 dimensioni. Per evitare il collasso canale durante l&#39;incollaggio, accertarsi che le proporzioni canale non meno di 1:10 è (altezza: larghezza) in tutto il dispositivo. Per i canali che devono superare il rapporto di aspetto, aggiungere posti di sostegno per prevenire il collasso. Pali di sostegno spazio ad una distanza che è almeno il doppio del diametro delle cellule, per non ostacolare il flusso delle cellule. </li><li> Include un filtro nei porti di entrata per rimuovere i detriti e disaggregare ammassi cellulari (Figura 1B). Regolare la dimensione e la spaziatura dei posti di filtro in modo che la distanza che separa i messaggi è approssimativamente pari ad un diametro di cella. NOTA: Il limite inferiore di dimensioni funzione è impostata dalla risoluzione alla quale la maschera litografica viene stampato. Assicurarsi che tutte le funzioni sono all&#39;interno delle resoluzione limite specificato dal fornitore di maschera. </li></ol> 2. Le forniture e Preparazione NOTA: Prima di iniziare qualsiasi esperimento, i seguenti elementi devono essere preparati. Una schematica dell&#39;intero configurazione è dato in Figura 1. <ol><li> Realizzare il maestro dispositivo utilizzando tecniche standard per microlavorazioni litografica 14,15. Verificare l&#39;altezza delle caratteristiche modellata utilizzando un profilometro. NOTA: Mentre master possono essere facilmente fabbricati in un impianto di camera bianca, alcuni laboratori hanno sviluppato metodi di litografia a basso costo per l&#39;uso in un ambiente semi-pulito 16,17. </li><li> Preparare la fonte d&#39;aria per il flusso guidato-pressione, utilizzando un serbatoio di aria compressa e la sequenza dei regolatori aria e raccordi (Figura 1A). <ol><li> Impostare un serbatoio di alimentazione dell&#39;aria e il regolatore manuale. NOTA: Una composizione di 5% di CO 2 in aria mantiene un ambiente simile a un tipico incubato coltura cellularer, ma altre miscele di gas possono anche essere utilizzati. </li><li> Impostare un regolatore di pressione a controllo elettronico in linea con il regolatore manuale. Utilizzare un convertitore elettro-pneumatico per regolare e mantenere una caduta di pressione stabile su tutti i canali, con le variazioni di pressione di meno di 2 kPa. Utilizzare il semplice codice scritto in LabVIEW (Informazioni supplementari) per inserire la pressione desiderata. NOTA: Il convertitore elettro-pneumatico utilizza un circuito di feedback interno per regolare la pressione di uscita della valvola in modo che corrisponda alla pressione specificata attraverso il dispositivo di microfluidica. </li><li> Impostare una camera pressurizzata per guidare il flusso della sospensione cellulare. Assemblare una camera di sospensione cellulare su un citometro a flusso standard tubo e un cappuccio lavorata che crea una guarnizione a tenuta di pressione sul tubo. NOTA: Il tappo camera di pressione contiene due orifizi: un ingresso che si collega al serbatoio dell&#39;aria compressa e una presa attraverso il quale le cellule derivano dalla camera in pressione nel dispositivo (Figure 2). </li></ol></li><li> Impostare un microscopio invertito dotato di una fotocamera che ha un tasso di acquisizione di almeno 100 fotogrammi al secondo per catturare le immagini delle cellule che attraversano la matrice costrizione. Interfaccia la fotocamera con una scheda di acquisizione video e un computer. </li><li> Preparare una soluzione madre tensioattivo del 10% w / w Pluronic F-127 in tampone fosfato (PBS), come l&#39;aggiunta di una piccola quantità di F127 alla soluzione multimediale cellule aiuterà a ridurre al minimo l&#39;adesione delle cellule alle pareti PDMS. Per preparare la soluzione F127, vortice e riscaldare lentamente a 37 ° C per sciogliere la F127. Prima dell&#39;uso, passare la soluzione attraverso un filtro a siringa da 0,2 micron e conservare a temperatura ambiente. Preparare la soluzione di tensioattivo in anticipo come vortex e filtraggio genera bolle che persistono per più di 24 ore. </li></ol> 3 Microfluidic Fabrication dispositivo <ol><li> Realizzare blocco PDMS con canali microfluidici. <ol><li> Mescolare accuratamente PDMS unrapporto ta di 1:10 (w / w) agente indurente alla base. </li><li> Versare il composto sopra il master del dispositivo (punto 2.1). Degas in una campana di vetro con il vuoto applicato fino a quando le bolle intrappolate scompaiono, o per circa 10-20 min. NOTA: Dopo questo tempo, ci possono essere ancora bolle all&#39;interfaccia aria-PDMS, che è normale; queste saranno tipicamente dissipare durante la cottura. È più critico per garantire che non vi siano bolle rimanenti adiacenti ai canali. </li><li> Cuocere il dispositivo degasato a 65 ° C per 4 ore. Per evitare che i canali di collassare, cuocere il dispositivo durante la notte per reticolare ulteriormente le PDMS per un dispositivo con un alto modulo elastico che è più resistente al collasso canale. Tuttavia, nota che si estendeva cottura embrittles anche i PDMS e può portare alla fessurazione quando punzonatura fori (punto 3.3). </li></ol></li><li> Rimuovere i dispositivi microfluidici dallo stampo master. Tagliare dispositivi microfluidici individuali fuori del blocco PDMS con una lametta e rimuovere il dispositivo dal paloer. Iniziate sollevando delicatamente un angolo del dispositivo; peeling lento e dolce, in contrasto con il sollevamento del blocco di PDMS verso l&#39;alto, riduce lo stress su entrambi i PDMS e il master. </li><li> Punch buchi nel dispositivo PDMS per creare porte di connessione per l&#39;accesso tra tubi e microcanali. Creare fori con una biopsia, e punch dal lato canale attraverso il lato esterno del dispositivo. NOTA: Un pugno biopsia con un diametro 0,75 millimetri crea buchi che si interfacciano perfettamente con polietereterchetone (PEEK) tubo (diametro esterno = 1/32 &quot;o 0,79 millimetri) o tubo di polietilene (PE-20, diametro esterno = 0,043&quot; o 1,09 millimetri ). Utilizzare un anello di luce per aiutare a visualizzare i fori nei dispositivi con canali poco profondi 18. Assicurarsi che la biopsia è tagliente; dopo un uso ripetuto all&#39;avanguardia offusca e la biopsia deve essere eliminata e sostituita. </li><li> Sciacquare il dispositivo PDMS con isopropanolo (HPLC) per rimuovere polvere e depositati pezzi di PDMS. Assicurarsi che ilfori sono chiari di detriti da dirigere un flusso costante di isopropanolo puro da una bottiglia squeeze attraverso i fori. Asciugare con aria filtrata. Dopo la pulizia, posizionare i blocchi PDMS con canali a faccia in su in un piatto pulito Petri per mantenere la pulizia del dispositivo. Se necessario, dispositivi di archiviazione in questa forma fino legame. </li><li> Pulire il substrato di vetro risciacquando con metanolo (grado HPLC), asciugare con aria filtrata, e mettere su una piastra riscaldante a 200 ° C per 5-10 minuti al fine di garantire il vetro è completamente pulita e asciutta prima del trattamento al plasma. NOTA: Il substrato di vetro forma il fondo di ciascun canale. Tipicamente un vetrino sufficiente, dal momento che un obiettivo 10X o 20X è l&#39;ideale per l&#39;imaging più canali in parallelo. Per una maggiore risoluzione delle immagini, legare il dispositivo a un coprioggetto (# 1.5 di spessore). </li><li> Incollare il dispositivo PDMS al substrato di vetro. <ol><li> Il plasma ad ossigeno trattare il lato canale del blocco PDMS e 1 parte di un vetrino. NOTA: Won una unità di scarico manuale, utilizzare un tempo di trattamento di 1 min, ma ottimizzare il tempo di trattamento per ciascun apparecchio plasma di ossigeno. </li><li> Posizionare il lato canale delle PDMS sulla parte superiore del lato trattato del vetro immediatamente dopo il trattamento. </li><li> Tenere insieme con una leggera pressione per ~ 10 secondi per promuovere l&#39;incollaggio. Cuocere l&#39;intero dispositivo a temperatura elevata (60-80 ° C) per almeno 15 minuti per migliorare la forza di legame. </li></ol></li></ol> 4 Deformazione cellule attraverso i canali ristretto <ol><li> Controllare il dispositivo di microfluidica sotto un microscopio. Assicurarsi che i canali non sono crollate o rotti e che entrambi i fori di entrata e uscita si collegano direttamente nei canali del dispositivo utilizzando un obiettivo a basso ingrandimento (10X). Designare dispositivi difettosi segnando la superficie delle PDMS con una lametta e non usarli per esperimenti. </li><li> Preparare i campioni di coltura cellulare per essere processati. Cellule Cultura usano condizioni standard. <ol><li> Fo esempio, la cultura HL-60 cellule in terreno RPMI-1640 integrati con la soluzione di penicillina-streptomicina 1% e siero fetale bovino al 10% in 5% CO 2 incubatore a 37 ° C. </li><li> Per le cellule aderenti, li raccogliere da tripsinizzazione e risospendere in terreno di coltura fresco. Utilizzare un protocollo standard di tripsinizzazione; per esempio, aggiungere ~ 0,5 ml di tripsina ad un pallone con il 25 cm 2 area culturale, e risospendere in ~ 30 ml di terreno fresco. Differenziare cellule HL-60 in cellule neutrofili di tipo da parte di tutti-trans retinoico (ATRA) ad una concentrazione finale di 5 mM per 1 x 10 5 cellule / ml come descritto in precedenza 19,20. </li><li> Centrifugare le cellule a 300 xg per 3 minuti, aspirare con cura le cellule surnatante e risospendere alla densità finale appropriato terreno di coltura fresco con 0,1% v / v F-127. </li></ol></li><li> Contare le cellule utilizzando un contatore Coulter, emocitometro, o citofluorimetro. Regolare la sospensione cellulare ad una densità di 1 x 10 6 a 5 x 10 <sup&gt; 6 cellule / ml. Una volta che la densità della sospensione è impostato, supplemento con circa 0,1% v / v F-127. NOTA: La densità cellulare e la concentrazione di tensioattivi possono avere bisogno di essere modificato a seconda dei sistemi cellulari particolari; La tabella 1 fornisce una registrazione delle concentrazioni utilizzate in precedenza di cellule e di F-127 per i diversi tipi di cellule. </li><li> Mettere sospensione cellulare in un citofluorimetro tubo e collegarlo al tappo a pressione. Prima di collegare il tubo al dispositivo microfluidica, regolare la pressione a circa 14-21 kPa e filo fino alla sospensione cellulare emerge dalla punta del tubo. Questo aiuterà a ridurre al minimo le bolle d&#39;aria nel tubo e il dispositivo. </li><li> Inserire la punta del tubo contenente la sospensione cellulare nella presa del dispositivo. Se il dispositivo è legato ad un coprioggetto, posizionare il dispositivo su una superficie piana e solida come la fase di microscopio prima di collegare il tubo; il vetrino è fragile e può rompersi in caso contrario. </li><li> Inserire un pezzo di tubo into l&#39;apertura di uscita e farlo passare in un tubo vuoto per la raccolta dei rifiuti, ad esempio un tubo Falcon vuota attaccata al lato del palco microscopio. Per coerenza nella resistenza fluidica complessiva del dispositivo tra esperimenti, verificare che il tubo di ingresso e uscita è dello stesso diametro e circa la stessa lunghezza per ogni esperimento. </li><li> Rampa delicatamente la pressione di circa 28 kPa o fino a quando le cellule passano attraverso i canali. Posizionare il dispositivo in modo che i diversi canali sono nel campo visivo e sono perpendicolari al fondo della schermata. Se la fotocamera è limitata dalla dimensione dei dati, acquisire più video per generare un numero sufficiente di punti di dati indipendenti. Regolare il tasso necessario per l&#39;uscita dei dati desiderata telaio. Per catturare cambiamenti nella forma cellulare, utilizzare l&#39;imaging ad alta velocità a 300 fotogrammi al secondo (fps); per misurare i tempi di transito di celle, utilizzare frame rate di circa 100 fps. </li></ol> Analisi dei dati 5. <ol><li> Aprire il file Master_script.m (scaricabile File supplementare) ed eseguire il programma. </li><li> Selezionare il primo video da analizzare dalla finestra di Windows Explorer che viene visualizzata. Specificare la frequenza dei fotogrammi per il video selezionato e premere invio. NOTA: Una figura apparirà che richiede all&#39;utente di selezionare una finestra di ritaglio rettangolare per il primo video. </li><li> Selezionare una finestra che comprende tutti i canali da sinistra a destra e interseca i canali appena sopra la prima lampadina della matrice di canali in alto e in basso (Figura 3). </li><li> Selezionare le regioni costrizione da l&#39;immagine ritagliata. Prestare particolare attenzione a mantenere una distanza fissa di pixel tra la finestra limite superiore e inferiore per ogni video selezionato. NOTA: Il bordo superiore della finestra specifica la costrizione più in alto e il bordo inferiore della finestra specifica la costrizione in basso (figura 4); costrizioni intermedie sono approssimate da questo input dell&#39;utente. Successivamente, l&#39;algoritmo mostra le segmentation delle cellule per i primi 50 frame di ogni video (Figura 5). </li><li> Monitorare l&#39;immagine in alto a sinistra (Figura 5A) strettamente per determinare se l&#39;algoritmo è localizzare con precisione le cellule; un&#39;immagine binarizzata viene sovrapposta al video sorgente per dimostrare la posizione delle cellule identificate. NOTA: Le finestre diverse, (Figure 5B-5D) sono per la diagnosi di codice e dimostrano i fotogrammi video dopo le operazioni di elaborazione delle immagini specifiche. </li><li> Selezionare il video successivo da elaborare dalla finestra di Windows Explorer. NOTA: L&#39;algoritmo si Ripetere i passaggi 5,2-5,5 per ogni video selezionato. </li><li> Selezionare Annulla una volta tutti i video desiderati sono stati aggiunti tramite la finestra di Esplora risorse per istruire la funzione che l&#39;elenco dei video è completa. NOTA: L&#39;algoritmo eseguirà le operazioni rimanenti senza l&#39;intervento dell&#39;utente. Questo richiederà circa 1-2 ore a seconda del numero di video trasformati e pe informaticirformance. Al termine, l&#39;algoritmo produrrà un istogramma dei dati di tempo di transito e di salvare i dati nella directory come un file .mat MATLAB e un file xls di Microsoft Excel. </li></ol>

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<li>Unger, M. A., Chou, H. P., Thorsen, T., Scherer, A., Quake, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monolithic+Microfabricated+Valves+and+Pumps+by+Multilayer+Soft+Lithography%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Monolithic Microfabricated Valves and Pumps by Multilayer Soft Lithography.</a> Science. 288 (5463), 113-116 (2000).</li>
</ol>

Gli autori non hanno conflitti di interesse da dichiarare.

Qui forniamo una procedura sperimentale completo per l&#39;analisi della deformazione delle cellule che transitano attraverso i canali microfluidici ristretto con flusso pressione-driven. Uno script MATLAB consente l&#39;elaborazione automatica dei dati (Supplemental materiale); di una versione aggiornata del codice è mantenuta ( <a href="www.ibp.ucla.edu/research/rowat" target="_blank">www.ibp.ucla.edu/research/rowat</a> ). Più in generale, le tecniche qui presentate possono essere adattati in molti saggi microfluidica...

Le variazioni di forma delle cellule sono fondamentali in numerosi contesti biologici. Ad esempio, eritrociti e leucociti deformano attraverso capillari che sono più piccoli di loro diametro 1. In metastasi, le cellule tumorali devono deformare attraverso spazi interstiziali stretti così come vascolare tortuoso e le reti linfatiche per seminare nei siti secondari 2. Per sondare il comportamento fisico delle singole cellule, dispositivi microfluidici presentano una piattaforma ideale che può essere personalizzato per studiare una serie di comportamenti cellulari tra cui la loro capacità di migrare attraverso strette fessure 3 e deformare passivamente attraverso costrizioni micron scala 3- 9. Polidimetilsilossano (PDMS) dispositivi microfluidici sono otticamente trasparente, consentendo deformazioni cellulari per essere osservata con un microscopio ottico e analizzati utilizzando strumenti di elaborazione delle immagini di base. Inoltre, le matrici di costrizioni possono essere definite con precisione, consentendo l&#39;analisi di più celle contemporaneamente conrendimento che supera molte tecniche esistenti 10,11. Qui vi presentiamo un piano sperimentale dettagliato per sondare deformabilità cellulare utilizzando il dispositivo di microfluidica &#39;cellulare Deformatore&#39; PDMS. Il dispositivo è progettato in modo che le cellule passaggio attraverso costrizioni sequenziali; questa geometria è comune in contesti fisiologici, come il capillare polmonare letto 12. Per misurare la deformabilità delle cellule, il tempo di transito fornisce una metrica conveniente che è facilmente misurato come il tempo richiesto per una singola cella di transito attraverso un&#39;unica 4,6 costrizione. Per mantenere una caduta di pressione costante su tutti i canali ristretti durante il trasporto delle cellule, usiamo il flusso di pressione-driven. Il nostro protocollo include istruzioni dettagliate sulla progettazione e fabbricazione del dispositivo, il funzionamento del dispositivo di pressione-driven flusso, la preparazione e l&#39;imaging di cellule, così come l&#39;elaborazione delle immagini per misurare il tempo per le celle a deformare attraverso una serie di costrizioni. Includiamoentrambi i modelli del dispositivo e codice di elaborazione dati di visione come file supplementari. Come un campione rappresentativo di dati, mostriamo tempo di transito cella attraverso una serie di costrizioni in funzione del numero di costrizioni diversi passaggi. Analisi dei tempi per celle di transitare se costrizioni strette di un dispositivo microfluidico può rivelare differenze di deformabilità di una varietà di tipi cellulari 4,5,13. Il dispositivo dimostrato qui sorveglia unicamente transito cella attraverso una serie di costrizioni micron scala; questo disegno emula il percorso tortuoso che le cellule vivono in circolazione e permette anche sondare le caratteristiche fisiche supplementari di cellule, come tempo di rilassamento.

<table><tbody><tr><td>Tensioattivo copolimero a blocchi Pluronic F-127&nbsp;</td><td>Fisher Scientific&nbsp;</td><td>8409400</td><td>Prodotto da BASF, disponibile anche tramite base Sigma</td></tr><tr><td>PDMS e reticolante</td><td>Essex Brownell</td><td>DC-184-1.1</td><td>Prodotto comunemente denominato Sylgard 184 Elastomero</td></tr><tr><td>Unità di scarica al plasma di ossigeno</td><td>Enercon</td><td>Dyne-A-Mite 3D Treater</td><td></td></tr><tr><td>Biopsy Punch, Harris Uni-Core (0,75 mm)</td><td>Ted Pella, Inc.</td><td>15072</td><td></td></tr><tr><td>Ghiera a tenuta di dita, 1/32"</td><td>Upchurch Scientific</td><td>UP-F-113</td><td></td></tr><tr><td>Raccordo a tenuta di dita III, 10-32</td><td>Upchurch Scientific</td><td>UP-F-300X</td><td></td></tr><tr><td>Tubo in polietereterchetone (PEEK), diametro esterno = 1/32" o 0,79 mm</td><td>Valco</td><td>TPK.515-25M</td><td></td></tr><tr><td>Tubo in polietilene (PE-20), 0,043" o 1,09 mm</td><td>Becton Dickinson</td><td>427406</td><td></td></tr><tr><td>Regolatore di pressione</td><td>Airgas o Praxair</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tubo in poliuretano, 5/32" OD</td><td>McMaster Carr</td><td>5648K284</td><td></td></tr><tr><td>Raccordi push-to-connect</td><td>McMaster Carr</td><td>5111K91</td><td></td></tr><tr><td>Convertitore elettropneumatico da tensione a pressione (E/P)</td><td>Omega</td><td>IP413-020</td><td></td></tr><tr><td>16-bit, 250 kS/S, 80 ingressi analogici DAQ multifunzione</td><td>National Instruments</td><td>NI PCI 6225-779295-01</td><td></td></tr><tr><td>Connettore analogico Terminale a vite</td><td>National Instruments</td><td>SCB-68-776844-01</td><td></td></tr><tr><td>Software di progettazione del sistema LabView</td><td>National Instruments</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Software MATLAB</td><td>The MathWorks, Inc.</td><td>Il codice MATLAB R2012a</td><td>richiede il</td></tr><tr><td>cavo schermato</td> Image Processing Toolbox <td>National Instruments</td><td>SHC68-68</td><td></td></tr></tbody></table>

una tecnica microfluidic per sondare deformabilità cellulare

A Microfluidic Technique to Probe Cell Deformability

Qui noi dettaglio la progettazione, la fabbricazione e l&#39;uso di un dispositivo di microfluidica per valutare la deformabilità di un gran numero di singole cellule in modo efficiente. In genere, i dati per ~ 10 2 cellule possono essere acquisite all&#39;interno di un esperimento di 1 ora. Un programma di analisi delle immagini automatizzata consente efficiente analisi post-esperimento dei dati di immagine, consentendo l&#39;elaborazione di essere completo entro poche ore. La geometria del dispositivo è unico in quanto le cellule devono deformare attraverso una serie di costrizioni micron scala, consentendo in tal modo la deformazione iniziale e rilassamento dipendente dal tempo di singole cellule da dosare. L&#39;applicabilità di questo metodo per leucemia promielocitica umana (HL-60), le cellule è dimostrata. Cellule Guidando a deformarsi attraverso costrizioni micron scala usando flow-driven pressione, osserviamo che promielocitica umana (HL-60) le cellule momentaneamente occludono la prima costrizione per un tempo mediano di 9,3 msec prima passaging più rapidamente attraverso la successiva costrizioneioni con un tempo di transito medio di 4,0 msec per costrizione. Al contrario, tutto-trans retinoico trattati con acido (neutrofili-tipo) cellule HL-60 occludono la prima costrizione per soli 4.3 msec prima passaging attraverso le strettoie successivi con un tempo di transito medio di 3,3 msec. Questo metodo può fornire indicazioni sulla natura viscoelastica di cellule, e in ultima analisi rivelano le origini molecolari di questo comportamento.

Per studiare la deformabilità dei diversi tipi di cellule, cellule di leucemia mieloide umana (HL-60), le cellule differenziate neutrofili, cellule linfocitarie topo, e linee cellulari di carcinoma ovarico umano (OVCAR8, HEYA8) vengono valutati utilizzando la tecnica microfluidica il &#39;cellulare Deformer&#39;. Risultati rappresentativi per il tempo di transito di HL-60 cellule HL-60 e neutrofili tipo mostrano i tempi per una singola cella di transito attraverso una serie di costrizioni, come mostrato nella Fi...

Dimostriamo un saggio basato microfluidica-per misurare i tempi di cellule di transitare attraverso una sequenza di costrizioni micron scala.

Una tecnica Microfluidic per sondare deformabilità cellulare

Here we detail the design, fabrication, and use of a microfluidic device to evaluate the deformability of a large number of individual cells in an ...

L'obiettivo generale del seguente esperimento è studiare la deformabilità di diversi tipi cellulari mediante un semplice saggio basato sulla microfluidica. Questo viene ottenuto realizzando un dispositivo microfluidico in poli(dimetilsilossano), o PDMS, per analizzare la scala temporale del transito cellulare attraverso una serie di restrizioni su scala micrometrica. Successivamente, un flusso a pressione controllata viene utilizzato per spingere le cellule attraverso i canali microfluidici, consentendo così di valutare la deformazione e il rilassamento dipendente dal tempo di singole cellule. In seguito, viene eseguito un programma di analisi automatica delle immagini per elaborare i video e ottenere un istogramma dei dati relativi ai tempi di transito.I risultati mostrano che diversi tipi cellulari presentano differenze nella deformabilità cellulare in base al tempo di transito attraverso una serie di restringimenti. Il principale vantaggio di questa tecnica rispetto alle tecniche esistenti, come la microscopia a forza atomica o l'aspirazione con micropipetta, è che i dispositivi microfluidici possono operare con successo ad alte capacità di throughput. Sebbene altri dispositivi microfluidici possano essere utilizzati anche per saggiare la deformabilità cellulare.Progettiamo il nostro dispositivo in modo che le cellule attraversino restringimenti sequenziali, una geometria comune in contesti fisiologici come il letto capillare polmonare. Per iniziare, progettare il dispositivo microfluidico selezionando una larghezza dei canali dell'array di restringimenti pari a circa il 30-50% del diametro medio delle cellule e un'altezza del canale pari ad almeno il 50% del diametro cellulare. Includere un filtro nei porti di ingresso per rimuovere detriti e disaggregare i cluster cellulari.Prima di iniziare l'esperimento, realizzare il master del dispositivo utilizzando tecniche standard di micro-litografia. Verificare l'altezza delle caratteristiche del pattern mediante un profilometro. Successivamente, collegare la sorgente d'aria per il flusso a pressione utilizzando una bombola di aria compressa e una serie di regolatori e raccordi per aria.Prima configurare un serbatoio di alimentazione d'aria e un regolatore manuale. Quindi, configurare un regolatore di pressione controllato elettronicamente in serie con il regolatore manuale. Utilizzare il semplice codice scritto in LabVIEW per impostare la pressione desiderata.Il convertitore elettropneumatico utilizza un anello di retroazione interno per regolare la pressione all'uscita della valvola in modo da corrispondere alla pressione specificata attraverso il dispositivo microfluidico. Configurare una camera pressurizzata per generare il flusso della sospensione cellulare assemblando una camera per la sospensione cellulare utilizzando un tubo standard per citometria a flusso e un tappo lavorato meccanicamente che crea una tenuta ermetica sul tubo. Il tappo della camera pressurizzata contiene due aperture: un ingresso collegato alla bombola d'aria compressa e un'uscita attraverso la quale le cellule fluiscono dalla camera pressurizzata al dispositivo.Successivamente, impostare un microscopio invertito dotato di una telecamera con una frequenza di acquisizione di almeno 100 fotogrammi al secondo. Per catturare immagini delle cellule in flusso attraverso l'array di strozzature, preparare quindi una soluzione stock di tensioattivo in soluzione salina tamponata al fosfato o PBS, poiché l'aggiunta di una piccola quantità di tensioattivo alla soluzione di mezzo cellulare aiuterà a ridurre al minimo l'adesione delle cellule alle pareti in PDMS. Per fabbricare il blocco in PDMS con canali microfluidici, aggiungere un grammo di agente indurente a 10 grammi di base in PDMS e mescolare accuratamente.Versare la miscela sul dispositivo. Degasificare il master in una campana a vuoto con vuoto applicato fino alla scomparsa delle bolle intrappolate, oppure per circa da 10 a 20 minuti. Trascorso questo tempo, potrebbero essere ancora presenti bolle all'interfaccia ARIA-PDMS, il che è normale.Questi di solito si dissiperanno durante la cottura. Successivamente, cuocere il dispositivo Degas a 65 gradi Celsius per quattro ore dopo che il dispositivo si è raffreddato. Rimuovere i dispositivi microfluidici dallo stampo master.Iniziare sollevando delicatamente un angolo del dispositivo. Staccare lentamente e con delicatezza, invece di sollevare il blocco in PDMS direttamente verso l'alto, riduce lo stress sia sul PDMS che sul master. Tagliare singoli dispositivi microfluidici dal blocco in PDMS con una lametta e rimuovere il dispositivo dal master. Praticare fori nel dispositivo in PDMS per creare porte di collegamento per l'accesso tra tubi e microcanali. Creare i fori dal lato dei canali fino al lato esterno del dispositivo utilizzando un punch per biopsia.Sciacquare il dispositivo in PDMS con isopropanolo per rimuovere polvere e frammenti di PDMS. Assicurarsi che i fori perforati siano liberi da detriti indirizzando un flusso costante di isopropanolo puro da una bottiglia con beccuccio attraverso i fori. Asciugare con aria filtrata. Pulire il substrato di vetro risciacquandolo con metanolo. Quindi asciugarlo con aria filtrata e posizionarlo su una piastra riscaldata a 200 gradi Celsius per cinque-dieci minuti per assicurarsi che il vetro sia completamente pulito e asciutto prima del trattamento al plasma. Come descritto nel protocollo testuale, ispezionare il dispositivo microfluidico al microscopio.Assicurarsi che i canali non siano collassati o danneggiati e che entrambi i fori di ingresso e di uscita siano collegati direttamente ai canali del dispositivo utilizzando un obiettivo a basso ingrandimento. Posizionare la sospensione cellulare in un tubo per citometria a flusso e collegarlo al tappo a pressione prima di connettere il tubicino al dispositivo microfluidico; regolare la pressione a circa 14-21 kilopascal e lavare fino a quando la sospensione cellulare non fuoriesce dalla punta del tubicino. Successivamente, posizionare il dispositivo su una superficie piana per inserire il tubicino nell'ingresso del dispositivo.Poiché il vetrino di vetro legato alla parte inferiore del dispositivo in PDMS è fragile, inserire la punta del tubo contenente la sospensione cellulare nell'ingresso del dispositivo. Quindi inserire un pezzo di tubo nel porto di uscita e indirizzarlo verso un tubo vuoto per la raccolta degli scarti, ad esempio un tubo Falcon vuoto fissato con nastro al lato del piatto del microscopio.Aumentare delicatamente la pressione fino a circa 28 chilopascal o fino a quando le cellule non scorrono attraverso i canali. Posizionare il dispositivo in modo che più canali siano nel campo visivo e siano perpendicolari al bordo inferiore dello schermo. Per iniziare l'analisi dei dati, aprire il file script principale m ed eseguire il programma.Selezionare il primo video da analizzare dalla finestra di Windows Explorer che appare. Specificare la frequenza dei fotogrammi per il video selezionato e premere invio. Apparirà una figura che chiede all'utente di selezionare una finestra rettangolare per il ritaglio.Per il primo video, selezionare una finestra che comprenda tutti i canali da sinistra a destra e intersechi i canali appena sopra la prima ampolla dell'array di canali. In alto e in basso, selezionare le regioni di strozzamento dall'immagine ritagliata. L'algoritmo mostra la segmentazione delle cellule per i primi 50 fotogrammi di ciascun video.Monitorare attentamente l'immagine in alto a sinistra per determinare se l'algoritmo sta localizzando correttamente le cellule. Un'immagine elaborata viene sovrapposta al video originale. Per dimostrare la posizione delle cellule identificate, selezionare il video successivo da elaborare nella finestra di Windows Explorer.L'algoritmo verrà ripetuto. Per ogni video selezionato, selezionare annulla. Una volta che tutti i video desiderati sono stati aggiunti tramite la finestra di Esplora file per indicare che l'elenco dei video è completo, i risultati rappresentativi per il tempo di transito delle cellule HL 60 e delle cellule di tipo neutrofilo HL 60 mostrano la scala temporale necessaria a una singola cellula per transitare attraverso una serie di strozzature.Il tempo viene misurato per una popolazione di singole cellule a ogni strozzatura di sette micrometri in una serie di sette strozzature. A una pressione di spinta di 28 chilopascal, le cellule HL 60 occludono temporaneamente la prima strozzatura per un tempo mediano di 9,3 millisecondi prima di passare attraverso le strozzature successive. Al contrario, le cellule HL 60 di tipo neutrofilo occludono la prima strozzatura soltanto per 4,3 millisecondi prima di passare.Dopo aver superato il primo restringimento, le cellule transitano più rapidamente attraverso i restringimenti successivi, dal secondo al settimo, con un tempo mediano di transito di 4,0 millisecondi per le cellule HL 60 e di 3,3 millisecondi per le cellule di tipo neutrofilo. Confrontando i tempi di transito tra diverse popolazioni cellulari, è possibile rivelare differenze nella deformabilità cellulare. Dopo aver visto questo video, si dovrebbe avere una buona comprensione di come misurare la deformabilità di diversi tipi cellulari utilizzando un semplice saggio microfluidico.Qui, un flusso generato da pressione viene utilizzato per far passare le cellule attraverso canali microfluidici, consentendo la deformazione e il rilassamento delle singole cellule da sottoporre a saggio.

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