Name: Spremere cellulare come un robusto, Microfluidic intracellulare Delivery Platform (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-11-07T19:45:00.000+00:00
Duration: 8 min 2 s
Description: Scopri un metodo di consegna intracellulare senza vettori utilizzando un dispositivo microfluidico per deformazione meccanica. Questa tecnica permette di introdurre macromolecole in tipi cellulari difficili da trasfettare, con applicazioni in terapia antitumorale e manipolazione delle cellule immunitarie.

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Ringraziamo T. Shatova per l&#39;utile discussione sul design sperimentale e analisi dei dati. L&#39;assistenza e la competenza di G. Paradis, il personale della citometria a flusso principale presso l&#39;Istituto Koch, e il personale della Microsystems Technology Laboratory presso il Massachusetts Institute of Technology sono riconosciuti con gratitudine. Questo lavoro è stato sostenuto dal National Institutes of Health Grants RC1 EB011187-02, DE013023, DE016516, EB000351, e in parte dal National Cancer Institute Cancer Center Support (Core) concede P30-CA14051 e MPP-09Call-Langer-60.

1. Conservazione <ol><li> Conservare i serbatoi, i titolari, O-ring e dispositivi microfluidici in etanolo al 70%. Utilizzare un contenitore (ad esempio vaso o bicchiere) che ha un coperchio per evitare l&#39;evaporazione e la contaminazione da particelle di polvere o all&#39;esterno. Posizionare i dispositivi in ​​un contenitore (1), serbatoi e O-ring in un secondo contenitore (2), e titolari nel terzo (3). </li></ol> Nota: L&#39;uso di etanolo al 70% per il rimessaggio è di mantenere la sterilità. Se gli unici componenti della soluzione sono etanolo e acqua (cioè senza denaturanti), tutti i componenti di sistema dovrebbe essere pienamente compatibile e non si degrada nel tempo. <ol start="2"><li> Cambiare soluzione etanolica in contenitori (2) e (3) prima di ogni uso per evitare la contaminazione incrociata di tutti gli esperimenti e minimizzare la presenza di particelle indesiderate che possono causare l&#39;intasamento. </li></ol> 2. Esperimento Preparazione <ol><li> Contenitori Consiglio (2) e (3) in un bagno ad ultrasuoni for 5-10 minuti prima di ogni utilizzo. Questo aiuta a rimuovere eventuali particelle contaminanti da esperimenti precedenti. </li><li> Pulire lavoro in armadio biosicurezza con una soluzione di etanolo al 70%. </li><li> Spruzzare tutti i materiali (3 contenitori e pinzette) con una soluzione di etanolo al 70% prima di collocarli all&#39;interno dell&#39;armadio biosicurezza. </li></ol> 3. Montaggio <ol><li> Deporre 2-3 salviette low-lint nell&#39;area di lavoro. </li><li> Rimuovere i serbatoi di plastica dal loro contenitore con le pinzette e metterli sulle salviettine per favorire l&#39;evaporazione della soluzione di etanolo da superfici interne. Battere delicatamente i serbatoi in superficie o soffiare aria attraverso di loro per facilitare la rimozione della soluzione di etanolo. </li><li> Inserire gli O-ring nel loro alloggiamento del serbatoi. </li><li> Rimuovere il supporto e patatine da rispettivi contenitori e lasciare evaporare l&#39;etanolo (~ 1-2 min). </li><li> Utilizzare le pinzette per posizionare il chip faccia-up desiderato (ad esempio fori di accesso su) nel supporto. Sollevare il titolarecon il chip di visione orizzontale per assicurarsi che il chip sia posizionato orizzontalmente nel supporto e regolare, se necessario, con le pinzette. IMPORTANTE: Se il dispositivo non si inserisce correttamente nel suo supporto, c&#39;è il rischio che si romperà durante le fasi successive. </li><li> Quindi, posizionare delicatamente i serbatoi sul supporto e allinearle con le clip. Fare attenzione che O-ring non cadono fuori dai loro alloggiamenti durante questo processo. </li><li> Premere delicatamente verso il basso i serbatoi finché non scattano in posizione. Assicurarsi che entrambi i lati dei serbatoi siano sicure e che il chip sembra essere nella posizione corretta. </li></ol> 4. Preparazione cellulare <ol><li> Per cellule aderenti (linee primarie o creare): cellule piastra 1-2 giorni prima dell&#39;esperimento tale che essi non sono confluenti più del 80% il giorno dell&#39;esperimento. </li><li> Posizionare cellule in sospensione (in PBS o supporto rilevante) e puntare ad una concentrazione operativa di 1,0 x 10 6 cellule / ml a 1,0 x 10 7 cells / ml. NOTA: Non abbiamo osservato cambiamenti significativi nelle prestazioni di consegna a causa di concentrazione cellulare. </li><li> Mescolare cellule e la consegna materiale desiderato in un tubo separato per ottenere la concentrazione desiderata materiale per l&#39;esperimento. IMPORTANTE: Poiché il metodo di consegna descritto si basa sulla diffusione per facilitare la consegna, una concentrazione di materiale superiore produrrà consegna superiore. Se possibile, si raccomanda di utilizzare una soluzione 1 mM del materiale desiderato per prove iniziali. Questa concentrazione può essere titolato al esperimenti futuri come necessario. La concentrazione più bassa segnalato utilizzato con questo dispositivo è 10 nM 21. </li></ol> 5. Funzionamento <ol><li> Pipettare miscela di cellule e la consegna materiale in un serbatoio (disegno corrente ha un max 150 microlitri). NOTA: La maggior parte dei disegni di periferica sono completamente reversibili, pertanto la direzione del flusso attraverso i canali non importa. I campioni possono essere caricati in uno dei due serbatoi. </li&gt; <li> Collegare il tubo di pressione al serbatoio riempito e serrare il dado per garantire la corretta tenuta (dito stretto è spesso sufficiente). </li><li> Regolare la pressione al livello desiderato sul regolatore. Questo controlla la velocità con cui le cellule attraverso il dispositivo. Si noti che il flusso delle cellule non inizia fino a quando si preme il pulsante. </li></ol> NOTA: Nel lavoro precedente, azoto o aria compressa hanno lavorato altrettanto bene come gas di trasporto. <ol start="4"><li> Sollevare dispositivo all&#39;altezza degli occhi e orientarlo in modo che il liquido nel serbatoio è facilmente visibile. NOTA: Traccia colonna di liquido per spegnere il sistema prima che il serbatoio si svuota. </li><li> Premere il pulsante per pressurizzare il serbatoio e iniziare il flusso delle cellule. </li><li> Quando il livello del liquido è circa 2 mm dal fondo del serbatoio, girare rapidamente il regolatore a 0 psi per arrestare il flusso. IMPORTANTE: Se uno non riesce a fermare il flusso prima che il serbatoio si svuota, si rischia l&#39;espulsione del campione dal collection serbatoio. Si noti inoltre che se la colonna di fluido non si muove ad un ritmo apprezzabile, o ha rallentato notevolmente rispetto alla sua portata iniziale (ad esempio 3x lento), il dispositivo montato è probabilmente sporco e deve essere sostituito. La gestione di un dispositivo intasato può portare alla morte delle cellule superiore. </li><li> Raccogliere le cellule trattate dal serbatoio appropriato e metterli nel tubo di raccolta / piastra desideri. IMPORTANTE: Non diluire le cellule raccolte in tutti i buffer in questa fase, le cellule porati continueranno ad assorbimento di materiale per un massimo di 10 min 20. Dopo questa finestra è passato, diluire le cellule nel desiderato media / buffer. </li><li> Per raccogliere le cellule trattate più o provare condizioni sperimentali alternativi, ripetere i passaggi 5,1-5,7 come necessario. Ricordiamo che i chip sono reversibili, quindi i campioni possono essere montati in uno dei serbatoi. Assicurati di scambiare i chip come necessario se si intasano. Eliminare i dispositivi ostruiti. </li></ol> 6. Smontaggio <ol><li&gt; Staccare delicatamente i serbatoi del titolare principale, mettendo da parte le armi della clip. </li><li> Collocare ogni parte nel contenitore di archiviazione appropriato (descritto nel paragrafo 1). </li><li> Posizionare chip utilizzati in un contenitore separato per lo smaltimento. </li></ol>

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</ol>

Gli autori Armon Azionei, Robert Langer, e Klavs F. Jensen sono azionisti di SQZ Biotecnologie Società che produce i dispositivi microfluidici utilizzati in questo articolo.

Taluni aspetti della procedura sperimentale descritta (cioè fattori diversi progettazione di chip e velocità operativa) possono avere bisogno di essere ottimizzato a seconda del tipo di cellula e materiale consegna il sistema viene applicato. La discussione che segue indirizzi alcuni dei fattori più comuni da considerare quando si progetta esperimenti. Per migliorare il segnale di consegna per i composti fluorescente, si ha la necessità di affrontare le fonti di fluorescenza di fond...

Consegna delle macromolecole nel citoplasma delle cellule è un passo fondamentale in applicazioni terapeutiche e di ricerca. Nanoparticelle mediata consegna, per esempio, ha dimostrato una potenziale nella terapia genica 1,2, mentre la consegna proteina è un mezzo promettente di influenzare la funzione cellulare sia clinico 3 e 4 impostazioni di laboratorio. Altri materiali, come ad esempio farmaci a piccole molecole, i punti quantici, o nanoparticelle d&#39;oro, sono di interesse in applicazioni che vanno dal cancro terapeutica 5,6 all&#39;etichettatura intracellulare 7,8 e singola molecola di monitoraggio 9. La membrana cellulare è sostanzialmente impermeabile alle macromolecole. Molte tecniche esistenti utilizzano nanoparticelle polimeriche 10,11, liposomi 12 o modificazioni chimiche 13 per facilitare rottura della membrana o la consegna intracellulare. In questi metodi, la vitalità efficienza consegna e cellulari sono spesso dipendente dalla struttura del secoloe molecola target e il tipo di cella. Questi metodi possono essere efficaci nella fornitura di materiali di struttura uniforme, come acidi nucleici, ma spesso sono poco adatti per la consegna dei materiali più strutturalmente diverse, come le proteine ​​14,15 e nanomateriali 7. Inoltre, il meccanismo di interruzione endosome che la maggior parte di questi metodi si basano su è spesso inefficiente, lasciando quindi molto materiale intrappolato in strutture vescicole 16. Infine, i metodi che sono spesso sviluppati per essere utilizzati con linee cellulari stabilizzate non si traducono bene alle cellule primarie. Metodi di membrana all&#39;incorporazione, come elettroporazione 17,18 e sonoporazione 19, sono una valida alternativa in alcune applicazioni, tuttavia, sono noti per causare la vitalità cellulare bassi e possono essere limitate dal responsabile del materiale consegna bersaglio. Rapida deformazione meccanica delle cellule, un approccio microfluidica alla consegna, ha recentemente demonstrated suoi vantaggi rispetto alle tecniche attuali nel contesto di riprogrammazione cellulare 20 e consegna nanomaterial 21. Questo metodo si basa sulla distruzione meccanica o la membrana cellulare per facilitare la consegna citosolico dei materiali presenti nel buffer circostante. Il sistema ha dimostrato che consenta potenziale in precedenza sfidare tipi di cellule (ad esempio cellule immunitarie primarie e cellule staminali) e materiali (ad esempio anticorpi e nanotubi di carbonio). Qui, la procedura generale di utilizzare questi dispositivi per la consegna intracellulare di macromolecole bersaglio è descritto. La procedura è generalizzabile a maggior parte dei tipi di cellule e materiali di consegna, tuttavia, è consigliabile una condurre una breve ottimizzazione delle condizioni, come descritto nelle nostre linee guida progettuali precedentemente segnalati 20, per tutte le applicazioni precedentemente non. Ad oggi, il sistema è stato usato con successo per la consegna di RNA, DNA, nanoparticelle di oro, punti quantici, i nanotubi di carbonio, proteines, e polimeri destrano 20,21.

<table><tbody><tr><td>Supporto del dispositivo & Serbatoio in plastica</td><td>SQZ Biotechnologies</td><td>Holder</td><td></td></tr><tr><td>LSRFortessa Analyzer</td><td>Becton Dickinson</td><td>N/A Macchina</td> per <td>citometria a flusso utilizzata presso il Koch Institute Core Facilities</td></tr><tr><td>Dispositivo microfluidico</td><td>SQZ Biotechnologies</td><td>Cell Squeeze</td><td></td></tr><tr><td>O-Ring</td><td>McMaster</td><td>9452K311</td><td></td></tr><tr><td>Sistema di pressione per azionare il dispositivo</td><td>SQZ Biotechnologies</td><td>Pinzetta a pressione</td><td></td></tr><tr><td>Bagno</td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td></td><td></td><td></td><td>ad ultrasuoni</td></tr></tbody></table>

spremere cellulare come un robusto, microfluidic intracellulare delivery platform

Cell Squeezing as a Robust, Microfluidic Intracellular Delivery Platform

Rapida deformazione meccanica delle cellule è emerso come un metodo promettente, libero da vettori per la consegna intracellulare di macromolecole e dei nanomateriali. Questa tecnologia ha dimostrato il potenziale per affrontare applicazioni precedentemente impegnative, tra cui, la consegna alle cellule immunitarie primarie, riprogrammazione cellulare, nanotubi di carbonio, e la consegna quantum dot. Questa piattaforma microfluidica libero da vettori deduce rottura meccanica della membrana cellulare per facilitare la consegna citosolico del materiale bersaglio. Qui, si descrive il metodo dettagliato di uso per questi dispositivi microfluidici compresi, montaggio del dispositivo, preparazione cellulare, e il funzionamento del sistema. Questo approccio consegna richiede una breve ottimizzazione di tipo di dispositivo e le condizioni operative per le applicazioni precedentemente rimanere sconosciuti. Le istruzioni fornite sono generalizzabili alla maggior parte dei tipi di cellule e materiali di consegna in quanto questo sistema non richiede buffer specializzati o passi modificazione chimica / coniugazione. Questo lavoro fornisce anches raccomandazioni su come migliorare le prestazioni del dispositivo e problemi-shoot potenziali problematiche relative a intasamento, l&#39;efficienza di consegna bassi, e la vitalità cellulare.

Figura 1 contiene uno schema descrittivo del sistema di erogazione microfluidica. Figure 2a-b illustrano i risultati tipici della trattando le cellule HeLa con disegni diversi dispositivi in presenza di coniugato fluorescente 3 kDa destrano 20. Se la procedura viene seguita correttamente, le prestazioni del sistema sarà sensibile al tipo di dispositivo e velocità operativa. Pertanto, si dovrebbe ottimizzare queste condizioni per una data applicazione prima di procedere a espe...

Rapida deformazione meccanica delle cellule è emerso come un metodo promettente, libero da vettori per la consegna intracellulare di macromolecole e dei nanomateriali. Questo protocollo fornisce la procedura dettagliata su come utilizzare il sistema per una vasta gamma di applicazioni.

Spremere cellulare come un robusto, Microfluidic intracellulare Delivery Platform

Rapid mechanical deformation of cells has emerged as a promising, vector-free method for intracellular delivery of macromolecules and nanomaterials. This ...

L'obiettivo generale dell'esperimento di caduta è quello di consegnare macromolecole senza vettore alle cellule bersaglio sfruttando una perturbazione meccanica. Questo risultato si ottiene innanzitutto mettendo in sospensione il tipo di cellula bersaglio insieme al materiale da consegnare e caricando la sospensione nel serbatoio di un dispositivo microfluidico appositamente progettato. Successivamente, il dispositivo microfluidico viene pressurizzato e le cellule vengono spinte attraverso un reticolo di canali microfluidici che comprimono le cellule, inducendo una temporanea alterazione della membrana.Successivamente, le cellule vengono lasciate incubare in presenza del materiale da consegnare al fine di facilitare il trasporto diffusivo del materiale nel citoplasma cellulare. Mentre la membrana cellulare si ripara, si ottengono risultati che dimostrano un efficace trasporto di macromolecole mediante l'uso della citometria a flusso.Il vantaggio principale di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti come l'azione e la lipo perfettione è che è in grado di indirizzare tipi cellulari e materiali difficili che non possono essere efficacemente trasferiti con altri metodi. Questo meto

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Bioingegneria

Cattura cellula Utilizzando un dispositivo a microfluidi

Un nuovo sistema di microfluidica è stato sviluppato utilizzando il fenomeno del pompaggio passiva e di un controllo utente del sistema di consegna del fluido. Questo sistema di microfluidica ha il potenziale per essere utilizzato in una vasta gamma di applicazioni biologiche dato il suo basso costo, facilità d'uso, precisione volumetrica, alta velocità, ripetibilità e automazione.

Alta velocità Droplet basato Delivery System per pompaggio passiva in dispositivi microfluidici

Combinando goccia generazione monodisperse con ordinamento inerziale di cellule e particelle, si descrive un metodo per incapsulare un numero desiderato di celle o particelle in una singola goccia a tassi kHz. Abbiamo dimostrato efficienze due volte superiori a quelli di incapsulamento non ordinate per raccogliere le gocce singola e doppia-particelle.

High Throughput singola cellula e cellula Multiple-Micro-incapsulamento

Getto microfluidica contro un doppio strato lipidico interfaccia gocciolina fornisce un modo affidabile per generare vescicole con controllo sulla asimmetria membrana, incorporazione di proteine ​​transmembrana, e incapsulamento del materiale. Questa tecnica può essere applicata a studiare una varietà di sistemi biologici in cui sono determinanti biomolecole compartimenti.

Doppio strato lipidico delle vescicole Generation Uso Microfluidic getto

Un vortice microfluidica piattaforma elettroporazione assistito è stato sviluppato per la consegna sequenziale di più molecole in popolazioni di cellule identiche, con un controllo preciso e indipendente il dosaggio. Formato basato fase di purificazione delle cellule bersaglio precedente elettroporazione del sistema aiutato a migliorare l'efficienza di consegna molecolare e la vitalità cellulare trasformati.

Microscala Vortex-assistita Elettroporatore per sequenziale molecolare di consegna

Qui, presentiamo un protocollo per l'isolamento e la coltura di singole cellule con una piattaforma microfluidica, che utilizza un nuovo concetto di progettazione di micropozzetti per consentire l'isolamento di singole cellule ad alta efficienza e la coltura clonale a lungo termine.

Una piattaforma Microfluidic per l&#39;isolamento Single-cell high-throughput e cultura

Un chip microfluidico è stato fabbricato per produrre coppie di punti d'oro per la generazione di bolle tandem e isole rivestite di fibronectina per il patterning di singole cellule nelle vicinanze. Il campo di flusso risultante è stato caratterizzato dalla velocimetria dell'immagine delle particelle ed è stato impiegato per studiare vari bioeffetti, tra cui la porzione della membrana cellulare, la deformazione della membrana e la risposta intracellulare del calcio.

Un sistema Microfluidic con Patterning superficie per indagare cavitazione Bubble (s) Interazione -cell e gli effetti biologici risultante nel livello di singola cellula

Questo protocollo descrive l'assemblaggio e il funzionamento di un dispositivo accostofluidico a basso costo per la consegna molecolare rapida alle cellule tramite sonoporazione indotta da agenti di contrasto ad ultrasuoni.

Assemblaggio e funzionamento di un dispositivo acoustofluidico per una maggiore consegna di composti molecolari alle cellule

Il presente protocollo descrive la progettazione, la fabbricazione e la caratterizzazione di un sistema microfluidico in grado di allineare, immobilizzare e comprimere con precisione centinaia di embrioni di Drosophila melanogaster con un intervento minimo da parte dell'utente. Questo sistema consente l'imaging ad alta risoluzione e il recupero di campioni per l'analisi post-stimolazione e può essere scalato per adattarsi ad altri sistemi biologici multicellulari.

Meccanostimolazione di organismi pluricellulari attraverso un sistema di compressione microfluidica ad alta produttività

Questo protocollo descrive la miniaturizzazione del genoma CRISPR–Cas9 del recettore TCRα/β nelle cellule T umane primarie utilizzando 'DMF-ection', una piattaforma di elettroporazione microfluidica digitale (DMF). Il metodo consente l'editing genico parallelo e a basso input con alta vitalità ed è ulteriormente adattabile per la somministrazione di mRNA in sferoidi 3D multicellulari.

Una piattaforma digitale di elettroporazione microfluidica per l'editing del genoma CRISPR a basso input e la trasfezione di mRNA in cellule T in sospensione e modelli di celle 3D

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