Spremere cellulare come un robusto, Microfluidic intracellulare Delivery Platform

L'obiettivo generale dell'esperimento di caduta è quello di fornire macromolecole prive di vettori alle cellule bersaglio utilizzando la disgregazione meccanica. Ciò si ottiene posizionando prima il tipo di cella target in sospensione con il materiale di consegna desiderato e caricandolo nel serbatoio di un dispositivo microfluidico appositamente progettato. In una seconda fase, il dispositivo microfluidico viene pressurizzato e le cellule vengono guidate attraverso una serie di canali microfluidici che comprimono le cellule per facilitare la rottura transitoria della membrana.

Successivamente, le cellule vengono lasciate incubare in presenza del materiale di consegna target per facilitare il trasporto diffusivo del materiale nel citoplasma cellulare. Mentre la membrana cellulare viene riparata. Si ottengono risultati che dimostrano un'efficace veicolazione di macromolecole attraverso l'uso della citometria a flusso.

Il vantaggio principale di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti come l'ation e la lipo perfection, è che è in grado di affrontare tipi di cellule e materiali difficili che non possono essere erogati efficacemente con altri metodi. Questo metodo può rispondere a domande chiave in campo biologico, come ad esempio come migliorare la riprogrammazione cellulare. Le implicazioni di questa tecnica si estendono alla terapia e alla diagnosi del cancro perché il sistema consente la manipolazione delle cellule immunitarie per migliorare la loro efficacia antitumorale.

Per iniziare, fabbricare o acquistare il dispositivo microfluidico, il supporto del dispositivo, i serbatoi di fluido in plastica e gli O-ring mostrati qui ed elencati con i dettagli nel protocollo di testo allegato, quindi riempire parzialmente tre contenitori sigillabili con etanolo al 70%. Posizionare i dispositivi nel primo contenitore, i serbatoi e gli O-ring nel secondo contenitore e i supporti nel terzo. Quindi riempi i contenitori fino in fondo con etanolo al 70%.

Successivamente, posizionare il contenitore contenente i serbatoi e gli O-ring, nonché quello contenente i supporti, in un bagno a ultrasuoni per cinque-10 minuti prima dell'uso. Ciò contribuirà a rimuovere eventuali particelle contaminanti da esperimenti precedenti mentre il componente sonico pulisce l'area di lavoro in una cabina di biosicurezza con il 70% di etanolo. Quindi sterilizzare tutti i materiali necessari, compresi i tre contenitori e un paio di pinzette, strofinandoli con etanolo al 70% e posizionarli all'interno dell'armadio di biosicurezza per iniziare l'assemblaggio.

Per prima cosa, stendere due o tre salviette a basso contenuto di lanugine nell'area di lavoro. Quindi rimuovere i serbatoi di plastica dal contenitore dell'etanolo con una pinzetta e posizionarli sulle salviette per facilitare l'assorbimento e l'evaporazione dell'etanolo dalla superficie interna. Picchiettare delicatamente i serbatoi per facilitare la rimozione della soluzione di etanolo.

Se necessario, utilizzare gas pressurizzato per spurgare completamente il serbatoio. Una volta asciugati i serbatoi, inserire gli O-ring nelle apposite fessure presenti sui serbatoi. Quindi usa le pinzette per posizionare il chip a faccia in su nel supporto del dispositivo.

Assicurati che il chip sia posizionato nel supporto e, se necessario, regolalo con le pinzette. Se il dispositivo non si inserisce correttamente nel suo supporto, c'è il rischio che si rompa durante i passaggi successivi. Quindi, posizionare delicatamente i serbatoi sul supporto e allinearli con le clip.

Assicurati che gli O-ring non cadano dalle loro fessure. Durante questo processo, premere delicatamente sui serbatoi finché non scattano in posizione. Assicurarsi che entrambi i lati dei serbatoi siano ben saldi e che il chip appaia nella posizione corretta.

Non premere sui serbatoi con forza eccessiva. Poiché la pressione potrebbe rompere i trucioli per la primaria o l'aderenza. Linee cellulari, posizionare le cellule uno o due giorni prima dell'esperimento in modo che non siano confluenti per più dell'80%.

Il giorno dell'esperimento. Immediatamente prima dell'esperimento, raccogliere le cellule e risussarle, sospenderle in un terreno o in un altro tampone desiderato a una temperatura compresa tra uno e 10 milioni di cellule per millilitro. Quindi passare con cautela la sospensione cellulare attraverso una rete di filtro cellulare da 40 micron per evitare che grumi di cellule e matrice ostruiscano il dispositivo.

Una volta filtrato, miscelare 300 microlitri di sospensione cellulare con la concentrazione desiderata di materiale di erogazione in un tubo separato. Per questa dimostrazione, due microlitri di destrina a cinque milligrammi per millilitro e due microlitri di Alexa. Vengono aggiunti 4 88 anticorpi di controllo isotopico per 50 microlitri di sospensione cellulare.

Successivamente, miscelare delicatamente 100 microlitri di cellule mediante pipettaggio. Quindi, utilizzando i puntali di caricamento del gel, pipettare le cellule e il materiale di erogazione in uno dei serbatoi, collegare il tubo di pressione al serbatoio pieno e serrare a mano il nodo per garantire un soffitto adeguato. Quindi regolare la pressione dell'aria a 70 PSI sul regolatore per controllare la velocità con cui le celle viaggiano attraverso il dispositivo.

La pressione deve essere ottimizzata per la specifica combinazione di celle e chip microfluidici utilizzata in ciascun esperimento. Con tutto pronto, sollevare il dispositivo all'altezza degli occhi e orientarlo in modo che il liquido nel serbatoio sia facilmente visibile. Quindi premere la valvola a pulsante per pressurizzare il serbatoio e iniziare il flusso di cellule.

Osservare la velocità con cui il fluido scorre dal serbatoio. Se il fluido rallenta notevolmente rispetto alla sua portata iniziale, è probabile che il dispositivo montato sia intasato e debba essere sostituito. L'aumento del taglio causato dal blocco causerà una morte cellulare maggiore del normale.

Quando il livello del liquido è a circa due millimetri dal fondo del serbatoio, ruotare rapidamente il regolatore su zero PSI per interrompere il flusso. È importante interrompere il flusso d'aria prima che il serbatoio venga svuotato, altrimenti il campione potrebbe essere espulso dal serbatoio di raccolta. Quindi raccogliere le cellule trattate dal serbatoio di deflusso e posizionarle in una provetta per microcentrifuga.

A temperatura ambiente, le celle nominali continueranno ad assorbire materiale per un massimo di 10 minuti. Dopo 10 minuti, placcare le cellule con ulteriore terreno o continuare ad utilizzare le cellule in base alle esigenze sperimentali. Ripetere questi passaggi per raccogliere il numero di cellule trattate necessarie e sostituire i chip secondo necessità se si intasano e scartano i dispositivi ostruiti C per ogni campione successivo.

Modificare la direzione del flusso per ridurre al minimo gli effetti di intasamento. Al termine della raccolta delle celle, scollegare delicatamente i serbatoi dal supporto principale spingendo da parte i bracci della clip. Quindi riporre ogni parte da riutilizzare nell'apposito contenitore di stoccaggio e riempirli con etanolo fresco al 70%.

Infine, metti tutte le patatine usate in un contenitore separato per un corretto smaltimento. Sono state misurate l'efficienza di consegna e la vitalità cellulare delle cellule hela. A seguito di una serie di esperimenti, tre diversi chip microfluidici sono stati testati in una gamma di velocità fino a 600 millimetri al secondo.

Questi test hanno dimostrato che l'aumento della velocità del flusso ha migliorato l'erogazione di destrina coniugata fluorescente, da tre kilodalton, nelle cellule per ciascuno dei chip testati. Inoltre, l'aumento della velocità ha anche causato un calo della vitalità cellulare di circa il 20% nei dispositivi testati. Questa quantità di morte cellulare è relativamente bassa ed è spesso molto più alta in dispositivi progettati in modo inappropriato.

L'assorbimento della destrina coniugata con blu del Pacifico nella popolazione cellulare di controllo mostrata a sinistra è il risultato di un limitato legame superficiale ed effetti endocitici. Poiché le cellule sono esposte al materiale di consegna per lo stesso periodo di tempo delle cellule trattate. A destra c'è la popolazione di cellule vive che passano attraverso il dispositivo microfluidico mentre sono esposte alla stessa concentrazione di destrina delle cellule di controllo.

Le celle nella regione ombreggiata sono considerate non consegnate e le celle a destra della linea sono definite come consegnate. Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere completata in meno di un'ora se eseguita correttamente. Seguendo questa procedura, è possibile eseguire altri metodi, la post-optometria a vita per rispondere a ulteriori domande come l'efficienza di consegna e la funzionalità del materiale dopo il suo sviluppo.

Questa tecnica ha aperto la strada ai ricercatori nel campo della medicina rigenerativa per esplorare la programmazione cellulare nelle cellule primarie adulte utilizzando la somministrazione diretta di proteine. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come configurare e utilizzare il sistema di autospremitura per l'applicazione desiderata.