Name: Analisi di Nefrone Composizione e funzione del rene Zebrafish adulti (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-08-09T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 53 s
Description: Scopri metodi di marcatura fluorescente per analizzare la composizione dei nefroni nel rene di zebrafish adulti. Queste tecniche di immunofluorescenza e microscopia permettono di valutare la funzionalità renale e studiare la rigenerazione.

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Questo lavoro è stato sostenuto da un finanziamento a RAW dal seguente: National Institutes of Health concede K01 DK083512, DP2 OD008470, e R01 DK100237; March of Dimes Basil O&#39;Connor Starter Scholar concessione di una sovvenzione # 5-FY12-75; avviare i fondi presso l&#39;Università di Notre Dame College of Science e del Dipartimento di Scienze Biologiche; e un generoso dono per l&#39;Università di Notre Dame da Elizabeth e Michael Gallagher, a nome della famiglia Gallagher per promuovere la ricerca sulle cellule staminali. I finanziatori hanno avuto alcun ruolo nel disegno dello studio, la raccolta di dati e l&#39;analisi, decisione di pubblicare, o preparazione del manoscritto. Ringraziamo il personale del Dipartimento di Scienze Biologiche per il loro sostegno, e il Centro per la Ricerca Zebrafish a Notre Dame per la loro straordinaria dedizione nella cura e il benessere della nostra colonia zebrafish. Infine, ringraziamo i membri del nostro laboratorio di ricerca per i loro commenti, discussioni e approfondimenti su questo lavoro.

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Qui, abbiamo descritto i metodi che consentono la visualizzazione dei componenti segmento nefrone in zebrafish adulto. L&#39;iniezione di destrano coniugati fluorescenti consente etichettatura PCT preferenziale a causa delle proprietà endocitiche di queste cellule del tubulo prossimale 30,38. Questo metodo può essere eseguito con grande flessibilità dovuta all&#39;esistenza di destrani che può essere ottenuta con uno stuolo di diversi coniugati fluorescenti. Inoltre, l&#39;uso di destrani lisina-fissabile è un modo particolarmente conveniente per etichettare PCT segmenti, in quanto non sono necessarie procedure di etichettatura secondari. Ciò consente il rilevamento del segnale relativamente semplice ed è compatibile con molte altre etichette fluorescenti, immunomarcatura, e l&#39;uso di linee transgeniche giornalista. Etichettatura fosfatasi alcalina segna anche il tubulo prossimale, con una forte reattività in PCT e leggermente più debole reattività nel PST. Infine, la colorazione DBA consente l&#39;etichettatura dei segmenti tubulari distali, che mostrano una characteristic ramificata morfologia. Diverse molecole lectine, che sono proteine ​​di zucchero vincolanti di origine non immune, sono stati ampiamente utilizzati per distinguere i segmenti del nefrone mammiferi 47. E &#39;interessante che DBA in zebrafish correla con segmenti dei tubuli distali, in quanto è utilizzato per contrassegnare dotti collettori dei reni in mammiferi 47. Presi insieme, questi metodi possono essere utilizzati in varie combinazioni per documentare la composizione e la funzione renale. Poiché tutti questi metodi possono essere utilizzati in preparazioni renali interi, forniscono strumenti per valutare la struttura e la funzione del nefrone tutto l&#39;organo, senza dipendere interamente da l&#39;uso di più in termini di tempo, i metodi noiosi, ad esempio, il lavoro cryosection e immunomarcatura. Tuttavia, le macchie descritti in questo articolo metodi sono vitali in cryosection. Analisi Cryosection genera campioni (rispetto a tutto mount) che sono più adatti per immunoistochimica per rilevare Pepti specificides, anche se naturalmente questo tipo di analisi richiede la disponibilità di anticorpi primari appropriati. Purtroppo una limitazione importante nel lavoro con il modello animale di zebrafish rimane la scarsa disponibilità di anticorpi. Così WISH rimane il più largamente usato, cioè, &#39;go-to,&#39; procedura per l&#39;analisi di espressione genica. WISH utilizzando reazioni substrato BCIP, NBT, e / o INT per produrre precipitati viola o rosse non è compatibile con colorazione fluorescente su criosezioni. Una possibilità sarebbe quella di invocare l&#39;uso della rilevazione WISH fluorescente, una procedura che è stata ottimizzata per i campioni embrionali di zebrafish e potrebbe essere adattato per l&#39;uso con il rene adulto. La descrizione dei metodi in questo articolo il video dovrebbe consentire un&#39;ulteriore sperimentazione di tecniche come WISH fluorescente in combinazione con linee di zebrafish transgenici in cui i singoli segmenti vengono etichettati con un giornalista, come eGFP o mCherry. In alternativa, i metodi descritti qui could essere testato in combinazione con altri coloranti vitali, ad esempio, altre lectine. Così, ulteriore adattamento ed espansione dei metodi qui descritti potrebbero essere invocate per soddisfare le esigenze del ricercatore per interi preparati renali montaggio e analisi. Come tali, questi metodi hanno un potenziale ampio per l&#39;attuazione con il modello di zebrafish per gli studi di rigenerazione in corso e anche in modelli di malattia genetica. Vi è un urgente bisogno di ricerca innovativa e trattamenti per afflizioni renali. Milioni di persone soffrono di qualche forma di malattia renale ogni anno che deriva da cause congenite, acute e / o croniche. Inoltre, la prevalenza della malattia renale continua a crescere in tutto il mondo, rendendo queste malattie un problema di salute pubblica globale 14,15. Trattamenti come l&#39;emodialisi sono disponibili in base al quale una macchina di dialisi esterno serve per liberare il sangue di scorie metaboliche del paziente se i loro reni non sono in grado di svolgere questo ruolo. Sfortunatamente, Questo intervento ha dei limiti, come trattamento in corso è necessario per la sopravvivenza. Inoltre, i pazienti richiederebbero un trapianto di rene, che può richiedere anni per ricevere una volta che un paziente è posto su una lista d&#39;attesa. Anche dopo l&#39;ottenimento di un trapianto di rene, molti pazienti soffrono gli effetti negativi a seguito della procedura e devono combattere questi effetti per il resto della loro vita. Queste difficoltà dimostrano la grave necessità per lo sviluppo di nuovi trattamenti per aiutare a prevenire o malattie renali o forse per aumentare la rigenerazione dei tessuti 8,16,52,53. Date le ovvie limitazioni etiche dell&#39;uso di cavie umane nei laboratori biomedici, modelli animali sono essenziali per lo studio della patogenesi delle malattie umane e per la sperimentazione di nuovi trattamenti. Come risultato della sua somiglianza anatomica e la vicinanza evolutiva, il topo è diventato il modello più diffuso delle malattie umane 45. Tuttavia, ci sono alcune limitazioni con questo animale, inclusa,ing incapacità di visualizzare lo sviluppo degli organi in vivo e la praticità di completare schermi genetici su larga scala. Zebrafish sono una rilevante e utile organismo modello per lo studio dello sviluppo degli organi e modellazione delle malattie umane 45,46. Per quanto riguarda la malattia umana, esistono omologhi funzionali in zebrafish per quasi il 70% di tutti i geni umani 54,55. Studi recenti hanno messo in evidenza l&#39;utilità di zebrafish per molti settori della ricerca 31,37,56 rene. Studi di rigenerazione e riparazione in zebrafish dopo AKI suggeriscono che la rigenerazione tubulo epiteliale e neonephrogenesis sono due processi che si verificano e si sovrappongono durante la rigenerazione timecourse 30,37. L&#39;uso di un aminoglicoside antibiotico chiamato gentamicina è stata utilizzata come un paradigma lesione attraverso cui studiare i risultati di AKI in zebrafish adulto 29,30,37. Su una di circa due settimane periodo successivo lesioni da gentamicina, la Tubul prossimalees rigenerano, e nel frattempo nuovi nefroni formano tutto l&#39;organo 29,30,37. In generale, i meccanismi che regolano la rigenerazione epiteliale rimangono molto controversa. In quello proposto meccanismo del processo di riparazione, vi è l&#39;evento lesione acuta iniziale seguita da una desquamazione delle cellule morte nel lume. Avanti, c&#39;è una serie di de-differenziazione, proliferazione, e gli eventi di migrazione, dopo che le nuove cellule si differenziano, ripopolare la membrana basale feriti e funzione di ripristino al sito danneggiato. In alternativa, altri studi hanno suggerito che le cellule di ricambio derivano da cellule staminali / progenitrici che risiedono all&#39;interno tubuli del nefrone. Per quanto riguarda il processo di neonephrogenesis in zebrafish, aggregati cellulari sono stati osservati seguente AKI per iniezione gentamicina 29,30. Questi aggregati successivamente maturano in nuovi nefroni che Plumb in tubuli già esistenti 29,30. Il filo comune che unisce la rigenerazione epiteliale nefrone e neonephrogenesis è il loro fattore mistero puro e semplice: al momento non vi sono esponenzialmente più domande su come queste gesta di rigenerazione in quanto ci sono approfondimenti disponibili. Ad oggi, tuttavia, diverse linee emozionanti prove supportano l&#39;idea che la ricerca di rigenerazione renale utilizzando zebrafish può infatti fornire importanti spunti comparativi in AKI umana che può anche avere diretto traslazionale potenziale 56-58. Lo screening chimico per identificare piccole molecole che aumentano la proliferazione delle cellule progenitrici renali nell&#39;embrione zebrafish recentemente portato all&#39;identificazione della -butanoate inibitore delle istone deacetilasi metil-4-(feniltio) (m4PTB) 56,57. La somministrazione di questo composto di larve di zebrafish con gentamicina indotta AKI ha rivelato che la sopravvivenza larvale aumentato e che la proliferazione renale tubulare è stata rafforzata 56,58. Quando i topi con moderata AKI ischemia-indotta sono stati trattati con m4PTB, il loro recupero è stato accelerato in association con una riduzione sia in tubolare di atrofia e arresto del ciclo cellulare delle cellule proliferanti tubulari renali 58. Questi risultati suggeriscono che le vie responsabili per il normale sviluppo zebrafish renale e / o la risposta rigenerativa di AKI saranno conservati con i mammiferi 56. Così, mentre sono necessari ulteriori studi per prendere in giro a parte i meccanismi di rigenerazione, cioè quello di individuare le vie di segnalazione che sono coinvolti e comprendere la loro interazione, il pesce zebra fornisce una strada promettente per perseguire questo importante obiettivo nel campo nefrologia. Strumenti come le etichette cellulari nefrone descritte in questo protocollo rappresenta un gruppo di saggi che possono essere utilizzati per valutare la composizione e la funzionalità renale in modelli di AKI. Inoltre, possono essere applicati per caratterizzare modelli transgenici di malattia renale e possono fornire modi per identificare terapie chimiche in grado di promuovere il ripristino della struttura del nefrone dopo la diga renaleetà.

Il rene è un organo complesso che svolge una moltitudine di funzioni fisiologiche del corpo. La funzione più importante del rene è metabolica escrezione dei rifiuti, e questo compito è strettamente intrecciata con il mantenimento dell&#39;omeostasi fluido. Il rene svolge questi posti di lavoro filtrando il sangue e la formazione di urine, mentre in concomitanza regolazione della pressione sanguigna, livelli di elettroliti e dell&#39;equilibrio acido-base. Tubuli altamente specializzati epiteliali chiamate nefroni servono come unità funzionale di base del rene 1,2. Nei vertebrati adulti, nefroni sono in genere organizzati in una disposizione strettamente avvolto intorno un sistema di drenaggio centralizzato, permettendo così per molti tubuli per il confezionamento in abbastanza piccolo organo. Ad esempio, ogni rene umano può contenere oltre 1 milione di nefroni 3. Altri mammiferi come il mouse possiedono su ordine di 8-10.000 nefroni al rene 4. Il grado di complessità renale differisce tra questi mammiferi e altri vertebrates dovute a variazioni nel numero totale nefrone e la loro disposizione architettonica all&#39;interno del rene. Specie di vertebrati formano ben tre strutture renali successivi durante lo sviluppo, ed ogni forma display crescente complessità per quanto riguarda nefrone dotazione e disposizione: le pronephros, mesonefro, e metanefro. L&#39;ultima struttura renale da conservare serve come il rene adulto organo-tipicamente un mesonefro o un metanefro 2. Ogni forma di rene, tuttavia, ha una composizione basata nefrone-2. Il nefrone è il cavallo di battaglia del rene ed è responsabile per la filtrazione del sangue insieme con la secrezione metabolita e riassorbimento. Nefroni sono semplici strutture tubolari composti da cellule epiteliali e hanno una organizzazione segmentale, in cui discreti, domini altamente specializzati di epiteli differenziati eseguire compiti specifici. In ordine di flusso filtrato attraverso il nefrone, ci sono in genere tre parti principali che comprise ogni unità: (1) il corpuscolo renale, (2) un tubulo prossimale con, intermedio, e segmenti distali, e (3) un condotto di raccolta 1. Il tubulo prossimale è responsabile del riassorbimento di soluti organici, più in particolare glucosio e aminoacidi 1. Il tubulo intermedio (o di Henle) è un importante sito di sale e acqua regolazione 1. Infine, la messa a punto di sale e di altri ioni avviene nel tubulo distale e dotto collettore ed è altamente regolato dal sistema endocrino 1. Da lì, il filtrato viaggia attraverso l&#39;uretere e vescica, in definitiva uscita dal corpo come prodotto di scarto 1. La perdita di funzione renale può derivare da una moltitudine di cause che impediscono la normale attività nefrone. Queste cause possono verificarsi durante lo sviluppo del rene, ad esempio, i difetti congeniti che portano alla malformazione di nefroni 5, o cause di diversi tipi di danni (derivanti sia da genetica e environmeorigini ntale). Lesioni acquisite sono ampiamente classificati come lesione acuta del rene (AKI) o danno renale cronica (CKD). AKI comporta una perdita improvvisa della funzione renale, spesso derivanti da ischemia o tossina esposizione 6,7. Nei mammiferi, la riparazione epiteliale nefrone è possibile dopo tali lesioni 8, e molte persone presentano pieno ripristino della funzione renale dopo AKI. Tuttavia, AKI è anche associata ad alta morbilità e mortalità che sono stati riportati in un ampio 30 - 70% Intervallo di incidenza 6,7. CKD, al contrario, è associata con perdita progressiva della funzione renale che deriva da anni di danni prolungato, tipicamente associata a fibrosi 8,9. Inoltre, esiste un&#39;interazione tra AKI e CKD, sia come si può predisporre un individuo all&#39;altro 10-12. Per esempio, coloro che hanno sofferto di AKI sono più suscettibili di CKD e anche la morte 13. L&#39;incidenza della malattia renale, sia negli Stati Uniti e nel mondo, ha raggiunto epideproporzioni microfono e si prevede un aumento come la popolazione di età compresa tra espande, quindi non vi è una crescente necessità di individuare interventi di medicina rigenerativa per il rene 14,15. Nonostante la consapevolezza che i pazienti AKI possono recuperare, è stato a lungo pensato che il rene è un organo senza innati poteri rigenerativi. Questo punto di vista tradizionale è stato notevolmente modificato negli ultimi anni 16. Gli studi che indagano danno renale nei topi e nei ratti dopo AKI hanno dimostrato che le cellule epiteliali del tubulo del nefrone possono proliferare e ricostruire nefroni funzionali 17-20. Anche se i mammiferi possiedono questa capacità di adattamento di rigenerare nefroni, ci sono notevoli limitazioni e le risposte disadattivi possono essere innescate che portano alla fibrosi renale e CKD 21. Ad esempio, un recente studio ha dimostrato che la ripetuta ablazione delle cellule epiteliali in nefroni murini è stato associato con rigenerazione diminuita e nefroni fibrosi renale suggerendo-HAVEA limitata soglia di rigenerazione 22. Non ci sono prove che l&#39;adulto rene mammiferi forma nuovi nefroni per sostituire quelli persi o danneggiati, così la loro distruzione porta ad un deficit permanente nefrone 8,9. È interessante notare che alcuni vertebrati rispondono a AKI rigenerando nefrone epiteli e producendo anche nuovi nefroni, un processo denominato neonephrogenesis o nefrone neogenesi 23. Neonephrogenesis avviene nei pesci dopo l&#39;esposizione ad una tossina o resezione parziale, e modelli di pregiudizio hanno storicamente incluso il pesce rosso 24,25, tilapia 26, pattino 27, Medaka 28, e, più recentemente, il pesce zebra 29,30. Di questi, zebrafish fornire un modello di ricerca genetica praticabile per scoprire le vie cellulari e molecolari responsabili della rigenerazione renale. In questo articolo il video, dimostriamo come etichettare i segmenti del nefrone in zebrafish adulto. Conoscenze di anatomia nefrone, caratteristiche molecolari,e caratteristiche funzionali sono essenziali per gli studi renali futuro di successo utilizzando zebrafish. Il rene zebrafish adulto è una struttura mesonefro ed è intrinsecamente meno complessa in termini di numero nefrone e di organizzazione che la struttura metanefro trovati in mammiferi adulti, avians, e rettili 31. Tuttavia, zebrafish organizzazione segmento nefrone è analogo ai mammiferi, ed è stata la prima volta nel rene embrionale sulla base di studi di espressione genica 31-35. Nefroni zebrafish contengono segmenti lineari tubulari che includono il tubulo contorto prossimale (PCT), tubulo prossimale dritto (PST), distale precoce (DE), e distale tardi (DL) 31-35 (Figura 1). Nefroni Zebrafish adulti in possesso di segmenti tubolari simili 30,31,36,37 (Figura 1). La PCT può essere identificato anche da un fenotipo funzionale: le cellule epiteliali del PCT incorporeranno composti destrano fluorescente (10-70 kDa dimensioni) presenti nelcircolazione, che è stato utilizzato sia nella zebrafish rene embrionale ed adulto per valutare l&#39;assorbimento endocitica da queste cellule del tubulo prossimale 38-41 (Figura 1). Una differenza nel nefrone tra zebrafish e mammiferi è che zebrafish mancano di un tubulo intermedio, o di Henle 30-37; dal momento che questo funzioni segmento nei mammiferi per conservare l&#39;acqua, e zebrafish sono una specie di acqua dolce, senza l&#39;urgenza di concentrare l&#39;urina, non è sorprendente che zebrafish manca questo segmento 32,33. Pertanto, la composizione complessiva nefrone è in gran parte conservata tra il pesce zebra e reni mammiferi 32,33. Queste somiglianze hanno permesso zebrafish ad essere uno strumento di ricerca efficace per studiare le funzioni dei geni-renale espressa nel corso nefrogenesi sviluppo 32-35,42 e modellare numerose malattie renali 43,44, aggiungendo così alla lista sostanziale di condizioni umane che possono essere indagato utilizzandozebrafish 45,46. Oggi, il rene zebrafish adulto è un modello attraente per gli studi comparativi di rigenerazione renale a causa della sua trattabilità genetica e il palato espansione delle risorse tecnologiche disponibili per interrogare la funzione del gene e vie di segnalazione in questa specie. Diversi studi hanno utilizzato i mesonefro zebrafish per studiare i meccanismi di rigenerazione dopo AKI 29,30,37. Per la continua ricerca AKI utilizzando il rene zebrafish adulto, è essenziale disporre di metodi squisiti per etichettare diverse regioni e metodi nefrone per esaminare la funzionalità nefrone. Diversi metodi di analisi rene adulto sono stati adattati dai protocolli renali embrionali. Iniezione intraperitoneale di destrano fluorescente etichettati in zebrafish adulto etichette l&#39;epitelio PCT in mesonefro nefroni via endocitosi 30, come in embrioni di zebrafish 38-41 (Figura 1). Questo metodo è stato utilizzato per visualize quando tubuli prossimali riacquistano le loro proprietà riassorbire seguente AKI, che consente una valutazione della funzione fisiologica restaurato 30 (Figura 1). Un&#39;altra caratteristica del nefrone tubulo prossimale è che le cellule epiteliali in questo segmento in possesso di un bordo spazzola 37 che mostra alti livelli di fosfatasi alcalina endogena. Così, l&#39;epitelio prossimale può essere localizzato visivamente nel rene adulto zebrafish utilizzando una tecnica a fluorescenza conosciuta come Elf (marcato con enzima Fluorescence) -97 47. Qui, descriviamo come eseguire fluorescenti test di assorbimento di destrano 30,48 nell&#39;adulto rene zebrafish, in modo da ottenere una valutazione funzionale del tubulo prossimale e mappare le dimensioni e contorni di questo segmento tubulo. Avanti, descriviamo le tecniche di etichettare le regioni del tubulo prossimale del nefrone adulto con la fosfatasi alcalina etichetta fluorescente. In terzo luogo, si mostra per la prima volta che la rhodammina tag lectina Dolichos biflorus agglutinina (DBA), che è stato utilizzato come marcatore generale dei collettori nel rene dei mammiferi 49, segna i tubuli distali del rene adulto zebrafish. Come DBA è mutuamente esclusivo di fosfatasi alcalina colorazione, queste etichette forniscono un modo per distinguere ampiamente pan-prossimale rispetto tratti pan-distali del nefrone zebrafish adulto. Durante l&#39;attuazione di tali macchie fluorescenti sia in tutto il monte e sezioni istologiche al criostato, mettiamo in relazione queste etichette con i domini di espressione di geni soluto trasportatore che identificano in modo univoco ciascun segmento nefrone. Quindi questo protocollo contiene anche una guida per le procedure di trattamento dei tessuti modificati per tessuti adulti montare tutto ibridazione in situ (WISH) analisi sulla base della nostra embrione protocollo WISH 50. Tali procedure possono essere utilizzate in varie combinazioni (Figura 2) per documentare caratteristiche morfologiche e funzionali of adulti nefroni renali zebrafish. Così, questi protocolli possono essere applicati a studi di rigenerazione, la caratterizzazione fenotipica di altri modelli di malattia renale, e anche usati per studiare la formazione del rene adulto.

<table><tbody><tr><td>1X PBS</td><td></td><td></td><td>Prodotto diluendo 10 X PBS in acqua distillata.</td></tr><tr><td>1X PBST</td><td></td><td></td><td>0,1% Detersivo Tween-20 in 1 X PBS.</td></tr><tr><td>1X PBS con 0,05% Tween</td><td></td><td></td><td>0,05% Tween-20 detersivo in 1 X PBS.</td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>American Bioanalytical</td><td>AB02038</td><td></td></tr><tr><td>4% PFA/1X PBS</td><td></td><td></td><td>Sciogliere il 4% di PFA (w/v) (Electron Microscopy Sciences, Cat # 19210) in 1 X PBS, portare a ebollizione su una piastra calda in una cappa aspirante. Raffreddare e congelare le aliquote per la conservazione in congelatore a -20°C. Scongelare appena prima dell'uso e non ricongelare le scorte.</td></tr><tr><td>Pinzetta Fine Ropeps</td><td>Roboz</td><td>RS-1050</td><td>Dumont Modello #55&nbsp;</td></tr><tr><td>Scivolo in vetro</td><td>Thermo-Fisher</td><td>4445</td><td>Bianco Frost</td></tr><tr><td>Vetrino coprioggetti</td><td>in vetro Thermo-Fisher</td><td>12-540A</td><td>18 x 18 mm</td></tr><tr><td>Argilla da modellare</td><td>Hasbro</td><td>Playdoh</td><td>Altre argille da modellare possono essere sostituite e funzionano in modo simile</td></tr><tr><td>Supporto per vetrini</td><td>Thermo-Fisher</td><td>12-587</td><td>Opzionale: vassoio di cartone per riporre i vetrini in piano</td></tr><tr><td>Soluzione sbiancante</td><td></td><td></td><td>Formula della miscela di candeggina (per una soluzione da 20 ml): 1,6 ml di soluzione di idrossido di potassio al 10% 0,6 ml di soluzione di perossido di idrogeno al 30% 100 &mu; l di 20% di Tween Riempire fino a 20 ml con acqua distillata</td></tr><tr><td>Idrossido di potassio</td><td>Sigma</td><td>221473</td><td></td></tr><tr><td>Perossido di idrogeno</td><td>Sigma</td><td>H1009</td><td></td></tr><tr><td>Soluzione bloccante</td><td></td><td></td><td>Soluzione bloccante (per una soluzione da 10 ml): 8 ml di 1X PBS con 0,05% di Tween 2 ml di siero fetale di vitello 150 &mu; l di DMSO</td></tr><tr><td>Rilevamento dell'attività della fosfatasi alcalina</td><td>Invitrogen</td><td>E6601</td><td>Utilizziamo il kit di rilevamento della fosfatasi endogena ELF 97. Per preparare la soluzione del substrato di lavoro, diluire il substrato 20 volte nel tampone di rilevamento, secondo le istruzioni del produttore.</td></tr><tr><td>Soluzione di lavaggio</td><td></td><td></td> con fosfatasi alcalina <td>Ricetta per la soluzione tampone di lavaggio (per una soluzione da 100 ml): 5 ml di EDTA 0,5 M 120 mg di Levamisolo 95 ml di 1X PBS</td></tr><tr><td>Dextran, fluoresceina, 40.000 MW</td><td>Invitrogen</td><td>D1844</td><td>Diluire con acqua distillata per ottenere una soluzione madre da 50 mg/ml, e conservare le aliquote in congelatore a -20°C.</td></tr><tr><td>Destrano, blu a cascata, 10.000 MW</td><td>Invitrogen</td><td>D1976</td><td>Diluire con acqua distillata fino a ottenere una soluzione madre da 50 mg/ml e conservare le aliquote nel congelatore a -20 °C.</td></tr><tr><td>Destrano, giallo lucifero, 10.000 MW</td><td>Invitrogen</td><td>D1825</td><td>Diluire con acqua distillata fino a ottenere una soluzione madre da 50 mg/ml e conservare le aliquote nel congelatore a -20 °C.</td></tr><tr><td>Destrano, tetrametilrodamina (fluoro-rubino), 10.000 MW</td><td>di Invitrogen</td><td>D1817</td><td>Diluire con acqua distillata fino a ottenere una soluzione madre da 50 mg/ml e conservare le aliquote nel congelatore a -20 °C.</td></tr><tr><td>Dolichos biflorus agglutinina (DBA)-rodamina</td><td>Vector laboratories</td><td>RL-10-32</td><td>DBA Soluzione colorante (per un 100 &mu; l soluzione): 1 &mu; l di DBA 99 &mu; l di 1X PBS</td></tr><tr><td>Ioduro di propidio</td><td>Invitrogen</td><td>E6601</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Invitrogen</td><td>P1304MP</td><td></td></tr><tr><td>Vectashield duro set mezzo di montaggio</td><td>Vector laboratories</td><td>H-1400</td><td></td></tr><tr><td>Micro vetro di copertura</td><td>VWR</td><td>48393081</td><td></td></tr><tr><td>Dimetil solfossido, DMSO</td><td>American Bioanalytical</td><td>67-68-5</td><td></td></tr><tr><td>Saccarosio</td><td>Sigma</td><td>S0289</td><td></td></tr><tr><td>EDTA, soluzione 0,5 M, pH 8,0</td><td>American Bioanalytical</td><td>AB00502</td><td></td></tr><tr><td>Levamisole</td><td>Sigma</td><td>L-9756</td><td></td></tr><tr><td>Mezzo di congelamento dei tessuti</td><td>Triangle Biomedical Sciences, Inc.</td>Biopsia del criomold <td>TFM-C</td><td></td></tr><tr><td>Tissue-Tek, 10 x 10x 5 mm</td><td>Sakura Finetek</td><td>4565</td><td></td></tr><tr><td>TruBond 380 vetrini adesivi per microscopio</td><td>Tru Scientific</td><td>0380W</td><td></td></tr><tr><td>Bloccante dei liquidi &ndash; penna super PAP</td><td>Microscopia elettronica Sciences</td><td>71312</td><td></td></tr><tr><td>Camera di umidità per macchie immunologiche</td><td>Evergreen Scientific</td><td>240-9020-Z10</td><td></td></tr><tr><td>Cryostat</td><td>Therm</td><td>Microm&commercio; HM 525 Stereomicroscopio a criostato</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Nikon</td><td>SMZ645; SMZ1000; 83455 P-Blu GFP/DAPI; 83457 P-Endow GFP/FITC; Il set di filtri 83457 P-TRITC</td><td>utilizzato è stato il seguente: il filtro Hoechst/DAPI è stato utilizzato per il rilevamento di DAPI, ioduro di propidio, blu a cascata di destrano e fosfatasi alcalina. Il filtro GFP/FITC è stato utilizzato per il destron-FITC, il lucifero di destrano giallo e il rilevamento anti-GFP. Il filtro TRITC è stato utilizzato per il rilevamento di destrano-fluoro-rubino, PI e DBA.</td></tr><tr><td>Microscopio composto</td><td>Nikon</td><td>96310 C-FL UV-2E/C DAPI; 96311 C-FL B-2E/C FITC; 96313 C-FL Y-2E/C Texas Red</td><td>Filter set utilizzato è stato il seguente: il filtro Hoechst/DAPI è stato utilizzato per il rilevamento di DAPI, ioduro di propidio, blu destrano a cascata e fosfatasi alcalina. Il filtro GFP/FITC è stato utilizzato per il destron-FITC, il lucifero di destrano giallo e il rilevamento anti-GFP. Il filtro Texas Red è stato utilizzato per il rilevamento di destrano-fluoro-rubino, PI e DBA. &nbsp;</td></tr></tbody></table>

analisi di nefrone composizione e funzione del rene zebrafish adulti

Analysis of Nephron Composition and Function in the Adult Zebrafish Kidney

Il modello di zebrafish è emerso come un sistema rilevante per studiare lo sviluppo del rene, la rigenerazione e la malattia. Entrambi i reni zebrafish embrionali e adulte sono composti da unità funzionali noti come nefroni, che sono altamente conservati con altri vertebrati, compresi i mammiferi. La ricerca in zebrafish ha recentemente dimostrato che due fenomeni distinti trasparire dopo nefroni adulti subiscono danni: in primo luogo, vi è la rigenerazione robusto all&#39;interno di nefroni esistenti che sostituisce le cellule epiteliali del tubulo distrutte; secondo, completamente nuovi nefroni sono prodotte da progenitori renali in un processo noto come neonephrogenesis. Al contrario, gli esseri umani e altri mammiferi sembrano avere solo una limitata capacità di rigenerazione epiteliale nefrone. Ad oggi, i meccanismi responsabili di questi fenomeni di rigenerazione del rene rimangono poco conosciute. Dal momento che i reni zebrafish adulti subiscono sia la rigenerazione epiteliale nefrone e neonephrogenesis, forniscono un eccezionale para sperimentaleparadigma per studiare questi eventi. Inoltre, vi è una vasta gamma di strumenti genetici e farmacologici disponibili nel modello zebrafish che possono essere utilizzati per delineare i meccanismi cellulari e molecolari che regolano la rigenerazione renale. Un aspetto essenziale di tale ricerca è la valutazione della struttura e funzione del nefrone. Questo protocollo descrive un insieme di tecniche di etichettatura che possono essere utilizzati per misurare la composizione e la funzionalità renale prova nefrone nel rene zebrafish adulto. Così, questi metodi sono ampiamente applicabili per il futuro caratterizzazione fenotipica di Zebrafish adulti paradigmi danno renale, che comprendono, ma non sono limitati a, i regimi di esposizione nephrotoxicant o metodi genetici di morte delle cellule bersaglio, quali il nitroreduttasi mediata tecnica di ablazione delle cellule. Inoltre, questi metodi potrebbero essere utilizzati per studiare perturbazioni genetiche in formazione rene adulto e potrebbero essere applicate anche per valutare lo stato renale durante la modellazione delle malattie croniche.

Il rene adulto zebrafish è un sistema eccellente per gli studi di rigenerazione e malattie renali. Un aspetto essenziale di tale ricerca è la valutazione della struttura e funzione del nefrone. Questo protocollo descrive le diverse metodologie che possono essere implementate per valutare la composizione nefrone tubulo e per valutare il riassorbimento renale.

Analisi di Nefrone Composizione e funzione del rene Zebrafish adulti

The zebrafish model has emerged as a relevant system to study kidney development, regeneration and disease. Both the embryonic and adult zebrafish kidneys ...

L'obiettivo generale del seguente esperimento è valutare la composizione e la funzionalità del segmento nefrone nel rene adulto del pesce zebra. Ciò si ottiene iniettando prima la destrina marcata in modo fluorescente in un nido che lega il pesce zebra. Il secondo passo consiste nel rimuovere e fissare il rene per preparare il tessuto per i successivi metodi di etichettatura.Successivamente, il rene viene sbiancato per rimuovere la pigmentazione e quindi colorato per etichettare in modo fluorescente i segmenti di nefrone desiderati. I risultati sono ottenuti utilizzando l'immunofluorescenza, la microscopia e/o l'imaging in campo chiaro che consentono la visualizzazione dell'anatomia renale in base alla colorazione o alle macchie selezionate. I seguenti metodi di marcatura possono aiutare a rispondere a domande chiave nel campo dei reni per quanto riguarda l'anatomia degli organi e possono essere utilizzati per studiare la composizione del nefrone e valutare la funzionalità renale sia prima che dopo un evento di lesione.Le implicazioni di queste tecniche si estendono allo studio delle anomalie genetiche nella formazione del rene adulto e potrebbero anche essere applicate per valutare lo stato renale durante la modellazione della malattia cronica. Per iniziare, decantare la soluzione da un pesce anestetizzato e posizionare con cura l'animale su un lato ventrale dello stampo di spugna bagnato. Successivamente, riempi una siringa da insulina con 20 microlitri di soluzione madre di destrina scongelata.Posizionare l'ago in modo che l'inserimento avvenga con un angolo poco profondo sulla linea mediana ventrale dell'addome. Per evitare di iniettare leggermente gli organi, sollevare l'ago subito dopo l'iniezione per sollevare la parete del corpo e creare uno spazio in cui iniettare la soluzione. Dopo l'iniezione, rimettere delicatamente il pesce nella vasca per riprendersi dall'anestesia.Per iniziare, decantare la soluzione in eccesso da un pesce anestetizzato e posizionarla su un fazzoletto o un tovagliolo di carta. Dopo aver rimosso la testa e gli organi interni, utilizzare aghi da dissezione super sottili per aprire le pareti del corpo. Localizzare l'organo renale che è aderente alla parete dorsale dell'animale.Usa una pinza sottile per staccare il rene dalla parete dorsale. Posizionare delicatamente il rene in una fiala di vetro da cinque millilitri contenente un XPBS e lavare tre volte per cinque minuti ciascuna. Rimuovere il rene con una pipetta di trasferimento e posizionarlo su un bicchiere pulito Far scorrere con una o due gocce di un XPBS.Utilizzare una pinza sottile per appiattire il rene sul vetrino, assicurandosi che nessun tessuto si sia arricciato o ribaltato su se stesso. Uno strumento a filo di tungsteno può essere utilizzato per praticare piccole incisioni nel tessuto connettivo per facilitare il posizionamento piatto del rene. Successivamente, posiziona piccoli pezzi di argilla da modellare su ogni angolo di un vetrino di vetro da 18 x 18 millimetri.Posizionare lentamente il vetrino coprioggetti sul rene, mantenendo una leggera angolazione. Per ridurre al minimo l'intrappolamento di bolle d'aria, aggiungere un'ulteriore goccia di un XPBS per riempire lo spazio tra il vetrino coprioggetto e il vetrino, se necessario. Un gruppo separato di pesci zebra viene soppresso e immerso nel fissativo durante la notte.Quando è pronto, utilizzare una pinza fine per staccare con cura il rene dalla parete dorsale del corpo e posizionare l'organo in una fiala di vetro. Lavare il rene sezionato tre volte con tre o cinque millilitri di XPBS allo 0,05% per cinque minuti ciascuno. Successivamente, rimuovere la soluzione di PBS e sciacquare il rene con tre millilitri di una soluzione di saccarosio al 5% per 30 minuti.Trascorso questo tempo, sostituire la soluzione con tre millilitri di saccarosio al 30% e conservare per una notte a quattro gradi Celsius del giorno successivo. Rimuovere la soluzione e lavare il rene due volte prima di aggiungere da tre a cinque millilitri di soluzione sbiancante. Per rimuovere la pigmentazione dei melanociti presente sull'organo renale, posizionare la fiala di vetro su un rotatore e osservare attentamente come la pigmentazione scompare.La depigmentazione richiede in genere circa 20 minuti, ma occasionalmente può richiedere fino a 60 minuti. Se la soluzione sbiancante viene lasciata in posa troppo a lungo, può verificarsi la disintegrazione e si consiglia quindi di monitorare il campione ogni 10-15 minuti per verificarne l'integrità quando la pigmentazione è stata rimossa dal lavaggio dei reni due volte e di incubare con una soluzione di PFA al 4% per un'ora a temperatura ambiente. Quindi, rimuovere la soluzione di PFA al 4% e lavare il rene tre volte dopo l'ultimo lavaggio da tre a cinque millilitri di soluzione bloccante e incubare il rene a temperatura ambiente per due ore.Al termine del blocco, procedere direttamente al protocollo di colorazione selezionato. Rimuovere la soluzione bloccante e lavare il rene tre volte prima di lasciarlo in ammollo in un XPBS per almeno 10 minuti. Durante questo periodo, trasferire il rene in una piastra di coltura a 12 o 24 pozzetti.Sostituire l'unico XPBS con una soluzione di substrato di fosfatasi alcalina di lavoro sufficiente a coprire il campione e posizionare il campione su un rotatore per 30 minuti a temperatura ambiente. Trascorso questo tempo, arrestare la reazione lavando il rene in una soluzione tampone di lavaggio con fosfatasi alcalina. Sciacquare il rene con tre cambi di soluzione tampone di lavaggio nell'arco di 10-15 minuti.Quindi, rimuovere la soluzione tampone di lavaggio e montare il rene su un bicchiere pulito. Far scorrere il mezzo di montaggio della fosfatasi incluso nel kit di etichettatura. Visualizza il rene colorato con fosfatasi alcalina utilizzando uno stereomicroscopio o un microscopio composto con un set di filtri Debbie agganciato.Innanzitutto, preparare una soluzione DBA funzionante da 200 microlitri diluendo DBA in un XPBS. Sostituire la soluzione di PBS con 200 microlitri di soluzione di DBA e posizionare il campione su un rotatore per un'ora a temperatura ambiente. Trascorso questo tempo, rimuovere la soluzione DBA e lavare il rene tre volte con tre o cinque millilitri di XPBS per cinque minuti ciascuno.Rimuovere l'unico XPBS e montare il rene su un vetrino pulito. Come dimostrato in precedenza, visualizzare i segmenti distali del rene colorati con DBA utilizzando un filtro rosso Trixie o Texas standard impostato su uno stereomicroscopio fluorescente o un microscopio composto. In questa immagine in campo chiaro di un rene non sbiancato, la pigmentazione nera corrisponde alla popolazione sparsa di melanociti.Qui i segmenti di PCT del nefrone vengono visualizzati tre giorni dopo l'iniezione di destrina. Il riquadro contiene l'immagine di un singolo nefrone con melanociti. Questa immagine mostra un rene adulto dopo la rimozione della pigmentazione dei melanociti.Queste immagini rappresentative mostrano lievi variazioni morfologiche tra i segmenti di PCT, mentre molti PCT di nefrone sono strettamente arrotolati. Altri nefroni contengono regioni PCT che hanno una destrina minima a spirale della cascata di destrine blu, giallo di Lucifero e fluoro rubino di destrina etichettano preferenzialmente i segmenti PCT nei nefrini renali, sia la destrina Cascade Blue che il Lucifer Yellow mostrano una certa etichettatura non specifica con un background molto più elevato osservato nei reni trattati con il giallo di Lucifero. Al contrario, la destrina fluoro Ruby ha mostrato un background drasticamente ridotto con un'intensa marcatura PCT.Un rene adulto colorato dal desiderio di rilevare un marcatore specifico del tipo di cellula trasportatrice della PCT mostra un pattern di espressione caratteristico dell'assorbimento della destrina con una distribuzione di vari domini PCT strettamente arrotolati, nonché tratti di PCT più allungati che mostrano un diametro ampio e costante. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come etichettare con successo i segmenti del nefrone all'interno del rene adulto del pesce zebra, come il tubulo prossimale con fosfatasi alcalina e il tubulo distale medico con DBA. Non dimenticare che lavorare con il 4% di paraldeide può essere estremamente pericoloso e che durante l'esecuzione di questa procedura è necessario prendere sempre precauzioni come indossare un cappotto, guanti e occhiali.

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Ablazione laser del Pronephros Zebrafish allo Studio renale rigenerazione epiteliale

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Depigmentazione e prestazione del rene di zebrafish: una tecnica per preparare il rene di zebrafish adulto per la colorazione

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Rene Rigenerazione in Zebrafish adulti da Gentamicina Induced Injury

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Analisi dello sviluppo del rene Zebrafish con time-lapse imaging Utilizzando una dissezione microscopio dotato di sezionamento ottico

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