Analisi di Nefrone Composizione e funzione del rene Zebrafish adulti

L'obiettivo generale del seguente esperimento è valutare la composizione e la funzionalità del segmento nefrone nel rene adulto del pesce zebra. Ciò si ottiene iniettando prima la destrina marcata in modo fluorescente in un nido che lega il pesce zebra. Il secondo passo consiste nel rimuovere e fissare il rene per preparare il tessuto per i successivi metodi di etichettatura.

Successivamente, il rene viene sbiancato per rimuovere la pigmentazione e quindi colorato per etichettare in modo fluorescente i segmenti di nefrone desiderati. I risultati sono ottenuti utilizzando l'immunofluorescenza, la microscopia e/o l'imaging in campo chiaro che consentono la visualizzazione dell'anatomia renale in base alla colorazione o alle macchie selezionate. I seguenti metodi di marcatura possono aiutare a rispondere a domande chiave nel campo dei reni per quanto riguarda l'anatomia degli organi e possono essere utilizzati per studiare la composizione del nefrone e valutare la funzionalità renale sia prima che dopo un evento di lesione.

Le implicazioni di queste tecniche si estendono allo studio delle anomalie genetiche nella formazione del rene adulto e potrebbero anche essere applicate per valutare lo stato renale durante la modellazione della malattia cronica. Per iniziare, decantare la soluzione da un pesce anestetizzato e posizionare con cura l'animale su un lato ventrale dello stampo di spugna bagnato. Successivamente, riempi una siringa da insulina con 20 microlitri di soluzione madre di destrina scongelata.

Posizionare l'ago in modo che l'inserimento avvenga con un angolo poco profondo sulla linea mediana ventrale dell'addome. Per evitare di iniettare leggermente gli organi, sollevare l'ago subito dopo l'iniezione per sollevare la parete del corpo e creare uno spazio in cui iniettare la soluzione. Dopo l'iniezione, rimettere delicatamente il pesce nella vasca per riprendersi dall'anestesia.

Per iniziare, decantare la soluzione in eccesso da un pesce anestetizzato e posizionarla su un fazzoletto o un tovagliolo di carta. Dopo aver rimosso la testa e gli organi interni, utilizzare aghi da dissezione super sottili per aprire le pareti del corpo. Localizzare l'organo renale che è aderente alla parete dorsale dell'animale.

Usa una pinza sottile per staccare il rene dalla parete dorsale. Posizionare delicatamente il rene in una fiala di vetro da cinque millilitri contenente un XPBS e lavare tre volte per cinque minuti ciascuna. Rimuovere il rene con una pipetta di trasferimento e posizionarlo su un bicchiere pulito Far scorrere con una o due gocce di un XPBS.

Utilizzare una pinza sottile per appiattire il rene sul vetrino, assicurandosi che nessun tessuto si sia arricciato o ribaltato su se stesso. Uno strumento a filo di tungsteno può essere utilizzato per praticare piccole incisioni nel tessuto connettivo per facilitare il posizionamento piatto del rene. Successivamente, posiziona piccoli pezzi di argilla da modellare su ogni angolo di un vetrino di vetro da 18 x 18 millimetri.

Posizionare lentamente il vetrino coprioggetti sul rene, mantenendo una leggera angolazione. Per ridurre al minimo l'intrappolamento di bolle d'aria, aggiungere un'ulteriore goccia di un XPBS per riempire lo spazio tra il vetrino coprioggetto e il vetrino, se necessario. Un gruppo separato di pesci zebra viene soppresso e immerso nel fissativo durante la notte.

Quando è pronto, utilizzare una pinza fine per staccare con cura il rene dalla parete dorsale del corpo e posizionare l'organo in una fiala di vetro. Lavare il rene sezionato tre volte con tre o cinque millilitri di XPBS allo 0,05% per cinque minuti ciascuno. Successivamente, rimuovere la soluzione di PBS e sciacquare il rene con tre millilitri di una soluzione di saccarosio al 5% per 30 minuti.

Trascorso questo tempo, sostituire la soluzione con tre millilitri di saccarosio al 30% e conservare per una notte a quattro gradi Celsius del giorno successivo. Rimuovere la soluzione e lavare il rene due volte prima di aggiungere da tre a cinque millilitri di soluzione sbiancante. Per rimuovere la pigmentazione dei melanociti presente sull'organo renale, posizionare la fiala di vetro su un rotatore e osservare attentamente come la pigmentazione scompare.

La depigmentazione richiede in genere circa 20 minuti, ma occasionalmente può richiedere fino a 60 minuti. Se la soluzione sbiancante viene lasciata in posa troppo a lungo, può verificarsi la disintegrazione e si consiglia quindi di monitorare il campione ogni 10-15 minuti per verificarne l'integrità quando la pigmentazione è stata rimossa dal lavaggio dei reni due volte e di incubare con una soluzione di PFA al 4% per un'ora a temperatura ambiente. Quindi, rimuovere la soluzione di PFA al 4% e lavare il rene tre volte dopo l'ultimo lavaggio da tre a cinque millilitri di soluzione bloccante e incubare il rene a temperatura ambiente per due ore.

Al termine del blocco, procedere direttamente al protocollo di colorazione selezionato. Rimuovere la soluzione bloccante e lavare il rene tre volte prima di lasciarlo in ammollo in un XPBS per almeno 10 minuti. Durante questo periodo, trasferire il rene in una piastra di coltura a 12 o 24 pozzetti.

Sostituire l'unico XPBS con una soluzione di substrato di fosfatasi alcalina di lavoro sufficiente a coprire il campione e posizionare il campione su un rotatore per 30 minuti a temperatura ambiente. Trascorso questo tempo, arrestare la reazione lavando il rene in una soluzione tampone di lavaggio con fosfatasi alcalina. Sciacquare il rene con tre cambi di soluzione tampone di lavaggio nell'arco di 10-15 minuti.

Quindi, rimuovere la soluzione tampone di lavaggio e montare il rene su un bicchiere pulito. Far scorrere il mezzo di montaggio della fosfatasi incluso nel kit di etichettatura. Visualizza il rene colorato con fosfatasi alcalina utilizzando uno stereomicroscopio o un microscopio composto con un set di filtri Debbie agganciato.

Innanzitutto, preparare una soluzione DBA funzionante da 200 microlitri diluendo DBA in un XPBS. Sostituire la soluzione di PBS con 200 microlitri di soluzione di DBA e posizionare il campione su un rotatore per un'ora a temperatura ambiente. Trascorso questo tempo, rimuovere la soluzione DBA e lavare il rene tre volte con tre o cinque millilitri di XPBS per cinque minuti ciascuno.

Rimuovere l'unico XPBS e montare il rene su un vetrino pulito. Come dimostrato in precedenza, visualizzare i segmenti distali del rene colorati con DBA utilizzando un filtro rosso Trixie o Texas standard impostato su uno stereomicroscopio fluorescente o un microscopio composto. In questa immagine in campo chiaro di un rene non sbiancato, la pigmentazione nera corrisponde alla popolazione sparsa di melanociti.

Qui i segmenti di PCT del nefrone vengono visualizzati tre giorni dopo l'iniezione di destrina. Il riquadro contiene l'immagine di un singolo nefrone con melanociti. Questa immagine mostra un rene adulto dopo la rimozione della pigmentazione dei melanociti.

Queste immagini rappresentative mostrano lievi variazioni morfologiche tra i segmenti di PCT, mentre molti PCT di nefrone sono strettamente arrotolati. Altri nefroni contengono regioni PCT che hanno una destrina minima a spirale della cascata di destrine blu, giallo di Lucifero e fluoro rubino di destrina etichettano preferenzialmente i segmenti PCT nei nefrini renali, sia la destrina Cascade Blue che il Lucifer Yellow mostrano una certa etichettatura non specifica con un background molto più elevato osservato nei reni trattati con il giallo di Lucifero. Al contrario, la destrina fluoro Ruby ha mostrato un background drasticamente ridotto con un'intensa marcatura PCT.

Un rene adulto colorato dal desiderio di rilevare un marcatore specifico del tipo di cellula trasportatrice della PCT mostra un pattern di espressione caratteristico dell'assorbimento della destrina con una distribuzione di vari domini PCT strettamente arrotolati, nonché tratti di PCT più allungati che mostrano un diametro ampio e costante. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come etichettare con successo i segmenti del nefrone all'interno del rene adulto del pesce zebra, come il tubulo prossimale con fosfatasi alcalina e il tubulo distale medico con DBA. Non dimenticare che lavorare con il 4% di paraldeide può essere estremamente pericoloso e che durante l'esecuzione di questa procedura è necessario prendere sempre precauzioni come indossare un cappotto, guanti e occhiali.