Analisi dello sviluppo del rene Zebrafish con time-lapse imaging Utilizzando una dissezione microscopio dotato di sezionamento ottico

L'obiettivo generale di questa procedura è consentire l'analisi in time-lapse di diversi processi di sviluppo mediante un microscopio stereoscopico a fluorescenza, utilizzando semplici strategie di riallineamento dopo spostamenti in qualsiasi direzione. Questo metodo può contribuire a rispondere a domande fondamentali nel campo della biologia dello sviluppo, poiché permette l'osservazione diretta dello sviluppo di tessuti e organi in embrioni vivi per diverse ore. Il vantaggio principale di questo metodo è che rappresenta un'alternativa economica e facile da usare rispetto a tecniche più complesse normalmente impiegate per la registrazione in time-lapse di tessuti e organi in via di sviluppo, come la microscopia a scansione laser o la microscopia con illuminazione.

Sebbene questo metodo possa fornire informazioni sulle alterazioni spaziali e temporali che si verificano durante lo sviluppo dell'embrione e delle larve del pesce spazzino, può anche essere applicato per studiare i processi dello sviluppo precoce e altri organismi modello. Inoltre, è adatto per osservare processi dinamici in organismi adulti, come la cicatrizzazione e la rigenerazione delle radici. In preparazione, identificare pesci adulti altamente riproduttivi dalla linea transgenica esprimente GFP.

Nel pomeriggio precedente la microiniezione vegetale, preparare cinque coppie di pesci riproduttivi (maschio-femmina) in cinque contenitori di riproduzione. All'interno dei contenitori, mantenere il maschio e la femmina separati mediante un setaccio rimovibile per tutta la notte. La mattina seguente, subito dopo l'accensione delle luci, posizionare insieme il maschio e la femmina al di sopra del setaccio, in modo da impedire loro di mangiare le uova.

Ora, osservare i pesci mentre si riproducono. Una volta che la coppia ha prodotto circa 50 uova, separarli. Successivamente, trasferire le uova utilizzando una pipetta di Pasteur in una capsula di Petri riempita con acqua per embrioni per un primo ciclo di iniezione.

Ripetere questo processo per ogni coppia accoppiata. Se sono necessarie ulteriori uova, le stesse coppie di accoppiamento possono essere riunite e separate più volte. Per la microiniezione, la preparazione avanzata delle capsule e dei microago è eseguita in modo piuttosto standard.

I dettagli sono disponibili nel protocollo scritto. Iniziare caricando un ago per iniezione preparato. Utilizzando una punta micro-loader, riempire l'ago in senso retrogrado con due microlitri di soluzione working di MO, quindi fissare l'ago a un micromanipolatore.

Quindi, è possibile aprire la punta dell'ago. Osservandola al microscopio stereoscopico, utilizzare pinzette per allargare l'estremità oppure premere la punta contro una superficie rigida. Successivamente, calibrare il volume di iniezione iniettando la soluzione di MO in una goccia di olio minerale posta su un reticolo.

Regolare l'iniezione in modo da ottenere gocce di 75 micron, che corrisponderanno a circa 200 picolitri di soluzione. Successivamente, preparare gli embrioni da iniettare. Disporre gli embrioni allo stadio di circa 21 cellule lungo la scanalatura della piastra per microiniezione, con il polo vegetale orientato verso l'approccio dell'ago per microiniezione, che forma un angolo di 45 gradi rispetto alla scanalatura.

Ora, iniettare gli embrioni. Con l'ago, perforare la coriona e il tuorlo, quindi iniettare la soluzione di Morpholino caricata nel tuorlo. Questo metodo funziona per embrioni allo stadio di una o due cellule.

Dopo aver iniettato tutti gli embrioni, utilizzare una pipetta Pasteur a largo diametro per raccoglierli. Trasferire gli embrioni iniettati in piatti di Petri riempiti con acqua per embrioni e incubarli a 28,5 gradi Celsius. Più tardi nel pomeriggio, aspirare gli embrioni morti e sostituire l'acqua per embrioni.

La mattina successiva, dopo che gli embrioni hanno completato la gastrulazione, inibire la loro melanizzazione sostituendo l'acqua con acqua per embrioni contenente una traccia di PTU. Prestare attenzione: il PTU interferisce con lo sviluppo corretto prima della gastrulazione. Successivamente, allo stadio di sviluppo desiderato, rimuovere la coriona dagli embrioni utilizzando pinzette affilate.

Utilizzando il microscopio, afferrare la coriona con una pinzetta e tentare di afferrare il lato opposto della coriona con una seconda pinzetta. Successivamente, tirare con attenzione le pinzette in direzioni opposte senza danneggiare l'embrione. Dopodiché, anestetizzare gli embrioni con Tricaine ed eseguire l'inclusione degli embrioni e dell'agarosio su una griglia di riallineamento da 15 micron posizionata in una micro-piastra con fondo in vetro copri-oggetti.

Successivamente, caricare aliquote di un millilitro di agarosio fuso in provette da reazione da 1,5 millilitri. Collocare le provette in blocchi riscaldanti impostati a 36 gradi Celsius e attendere che si raffreddino. Poi, utilizzando una pipetta a largo diametro, trasferire un embrione nella micro-piastra.

Sifonare l'acqua in eccesso dagli embrioni e ricoprirli con agarosio. Mentre l'agarosio è ancora liquido, utilizzare due punte di pipetta piccole per orientare gli embrioni. Posizionare la struttura di interesse, in questo caso il pronefro, il più vicino possibile al fondo di vetro e in prossimità della griglia.

La griglia non deve sovrapporsi alla struttura di interesse. È vantaggioso incorporare fino a quattro embrioni in diversi micro-piastre e prevedere l'acquisizione dell'immagine del migliore. Un'adeguata inclusione richiede una certa pratica.

Quando l'agarosio è ancora liquido, l'embrione deve essere orientato nella posizione desiderata. Se si tratta di un pronefroso, deve trovarsi vicino al fondo in vetro e a una distanza adeguata dalla griglia di ricollocazione. Controllare periodicamente l'agarosio.

Una volta che è abbastanza duro da permettere di tenere gli embrioni, lasciarlo stabilizzare per altri due o tre minuti. Quindi, ricoprire l'embrione incorporato con acqua per embrioni contenente tracce di PTU e tricaina. Decantare o aspirare l'eccesso di acqua per embrioni e chiudere il coperchio per prevenire l'evaporazione.

Il risultato non dovrebbe presentare bolle d'aria. L'embrione può ora essere osservato con il fondo in vetro rivolto verso l'obiettivo. Quando si utilizza il preparato per acquisire immagini in successione, ad esempio acquisendo periodicamente immagini a stack Z nell'arco di diverse ore, è necessario correggere la deriva del fuoco.

Se possibile, applicare una strategia di messa a fuoco automatica. Attivare l'opzione di messa a fuoco automatica nel controllo software. Per il canale di riferimento, scegliere il canale a campo chiaro in luce trasmessa per minimizzare la foto tossicità.

È inoltre essenziale scegliere un intervallo di ricerca del campione sufficientemente ampio affinché l'autofocus funzioni correttamente. Prima di acquisire le immagini, posizionare un punto specifico della griglia stampata vicino alla struttura di interesse al centro del mirino del software, quindi salvare questa posizione tramite uno screenshot. Successivamente, poco prima del termine di ciascun intervallo di acquisizione, consultare lo screenshot e riaggiustare la posizione dello stadio e della messa a fuoco, qualora non si stia utilizzando l'autofocus.

Il metodo presentato è stato utilizzato per analizzare lo sviluppo renale negli embrioni di pesce zebra transgenico con WT1A morfogeno. Durante la fase iniziale della nefrogenesi, questa linea esprime fluorescenza verde nel mesoderma intermedio, dove sorgono i progenitori renali, e successivamente durante lo sviluppo nei tubuli in formazione e nei primordi del nefrone. L'analisi con imaging a intervalli di tempo ha rivelato una nefrogenesi normale negli embrioni di controllo iniettati con Morpholino di controllo.

A 20 ore post-fecondazione, i tubuli pronefrici in via di sviluppo erano visibili. Alle loro estremità anteriori, era possibile rilevare un accumulo sferico di cellule che rappresentava i primordi del nefrone in formazione. Nelle ore successive, i tubuli e i primordi del nefrone crebbero e i primordi iniziarono a fondersi lungo la linea mediana.

Al contrario, la nefrogenesi era gravemente alterata nei mutanti. Sebbene strutture tubulari GFP positive fossero visibili a 20 ore post-fertilizzazione, queste erano diffuse e sottosviluppate. L'analisi con imaging a intervalli di tempo ha mostrato che i primordi dei nefroni non si formavano mai e un numero notevole di cellule fluorescenti localizzate all'esterno dei pronefroi in via di sviluppo migrava in direzione ventrale, abbandonando il campo pronefrico.

Nel tentativo di eseguire questo protocollo, è importante ricordare che l'assenza di attrezzature aggiuntive, come il controllo della temperatura o i tavoli anti-evaporazione, richiede controlli regolari per rilevare eventuali deriva e riaggiustamenti. Dopo aver seguito questa procedura, gli embrioni immagine possono essere sottoposti ad altri metodi, come immunohistochemia, incetroipertizzazione o PCR in tempo reale, al fine di identificare componenti specifici di cellule e tessuti o per valutare l'espressione genica.