Analisi dello sviluppo del rene Zebrafish con time-lapse imaging Utilizzando una dissezione microscopio dotato di sezionamento ottico
April 7th, 2016
Il metodo descritto qui permette l'analisi time-lapse di sviluppo degli organi in embrioni di zebrafish utilizzando un microscopio a fluorescenza dissezione in grado di eseguire sezionamento ottico e semplici strategie di riadattamento per correggere la deriva focale e planare.
L'obiettivo generale di questa procedura è quello di consentire l'analisi time-lapse di diversi processi di sviluppo utilizzando un microscopio da dissezione fluorescente con semplici strategie per il riallineamento dopo la deriva in qualsiasi direzione. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo della biologia dello sviluppo perché consente l'osservazione diretta dello sviluppo dei tessuti e degli organi negli embrioni viventi per diverse ore. Il vantaggio principale di questo metodo è che è un'alternativa economica e facile da usare alle tecniche più complesse normalmente utilizzate per la registrazione time-lapse di tessuti e organi in via di sviluppo, come la scansione laser o la microscopia illuminata.
Sebbene questo metodo possa fornire informazioni sulle alterazioni spaziali e temporali che si verificano durante lo sviluppo di embrioni e larve di pesci spazzini, può anche essere applicato per studiare i processi di sviluppo precoci e altri organismi modello. Inoltre, è adatto per osservare i processi dinamici negli organismi adulti, come la guarigione e la rigenerazione delle radici. In preparazione, identificare i pesci adulti altamente riproduttivi dalla linea transgenica che esprime GFP.
Il pomeriggio prima della microiniezione della pianta, ha preparato cinque coppie maschio-femmina di pesci riproduttivi in cinque contenitori per la riproduzione. Nei contenitori, tenere il maschio e la femmina separati da un setaccio rimovibile per una notte. La mattina seguente, subito dopo l'accensione delle luci, mettete insieme un maschio e una femmina sopra il setaccio, in modo da evitare che mangino le uova.
Ora, osserva i pesci mentre si riproducono. Una volta che la coppia produce circa 50 uova, separatele. Quindi, trasferisci gli ovuli usando una pipetta Pasteur in una capsula di Petrie riempita con acqua per embrioni per un primo ciclo di iniezione.
Ripetere questo processo per ogni coppia accoppiata. Se sono necessarie altre uova, le stesse coppie di accoppiamento possono essere riunite e separate più volte. Per la micro-iniezione, la preparazione avanzata di piatti e aghi per iniezione viene eseguita in modo abbastanza standard.
I dettagli possono essere trovati nel protocollo di testo. Inizi con il caricamento di un ago per iniezione preparato. Utilizzando una punta per microcaricatore, riempire l'ago con due microlitri di soluzione di lavoro MO, quindi collegare l'ago in un micromanipolatore.
Quindi, la punta dell'ago può essere aperta. Durante l'osservazione con il microscopio da dissezione, utilizzare una pinzetta per aprire l'estremità o spingere la punta contro una superficie rigida. Quindi, calibrare il volume di iniezione iniettando la soluzione di MO in una goccia di olio minerale su un reticolo.
Regolare l'iniezione per ottenere gocce da 75 micron che corrisponderanno a circa 200 picolitri di soluzione. Successivamente, prepara gli embrioni da iniettare. Disporre i circa 21 embrioni allo stadio cellulare lungo la scanalatura della capsula per microiniezione con il polo vegetale orientato verso l'approccio dell'ago per microiniezione, che si trova a un angolo di 45 gradi rispetto alla scanalatura.
Ora, inietta gli embrioni. Con l'ago, perforare il corion e il tuorlo, quindi iniettare la soluzione caricata di Morpholino nel tuorlo. Questo funziona per gli embrioni allo stadio di una o due cellule.
Dopo aver iniettato tutti gli embrioni, usa un Pasteur a foro largo per raccoglierli. Trasferisci gli embrioni iniettati in piastre di Petri riempite con acqua per embrioni e incubali a 28,5 gradi Celsius. Più tardi nel pomeriggio, aspirare gli embrioni morti e sostituire l'acqua degli embrioni.
La mattina successiva, dopo che gli embrioni sono stati sottoposti a gastrulazione, inibire la loro melanizzazione sostituendo la loro acqua con acqua embrionale contenente una traccia di PTU. Attenzione, il PTU interromperà il corretto sviluppo prima della gastrulazione. Successivamente, allo stadio di sviluppo desiderato, decoionare gli embrioni con una pinzetta affilata.
Usando il microscopio, afferra il corion con un paio di pinzette e cerca di afferrare l'altro lato del corion con un secondo paio di pinzette. Quindi, separa con cura le pinzette senza distruggere l'embrione. Quindi, anestetizzare gli embrioni con Tricaina e procedere con l'inclusione degli embrioni e dell'agarosio su una griglia di riposizionamento da 15 micron posta in un micro-piatto con fondo di vetro.
Quindi, caricare un millilitro di aliquote di agarosio fuso in provette di reazione da 1,5 millilitri. Metti i tubi in blocchi di calore impostati a 36 gradi Celsius e attendi che si raffreddino. Quindi, utilizzando una pipetta a foro largo, trasferire un embrione nella micropiastra.
Aspirare l'acqua in eccesso dell'embrione e ricoprire l'embrione con agarosio. Mentre l'agarosio è ancora liquido, utilizzare due piccole punte di pipetta per orientare gli embrioni. Posizionare la struttura di interesse, in questo caso il pronefro, il più vicino possibile al fondo del vetro, e nelle immediate vicinanze della griglia.
La griglia non deve sovrapporsi alla struttura di interesse. È vantaggioso incorporare fino a quattro embrioni in diverse micro-piastre e pianificare l'immagine del migliore. Un corretto incorporamento richiede un po' di pratica.
Mentre l'agarosio è ancora liquido, l'embrione deve essere orientato nella posizione desiderata. Se si tratta di un pronefro vicino al fondo del vetro e a una distanza adeguata dalla griglia di riposizionamento. Controllare regolarmente l'agarosio.
Una volta che è abbastanza duro da trattenere gli embrioni, lascialo riposare per altri due o tre minuti. Quindi, sovrapporre l'embrione incorporato con acqua embrionale contenente tracce di PTU e tricaina. Decantare o aspirare l'acqua in eccesso dell'embrione e bloccare il coperchio per evitare l'evaporazione.
Il risultato non dovrebbe avere bolle d'aria. L'embrione può ora essere ripreso con il fondo di vetro rivolto verso la lente dell'obiettivo. Utilizzando la preparazione per creare immagini lapse, ad esempio, scattando periodicamente immagini Z-stack per diverse ore, è necessario correggere la deriva focale.
Se possibile, applica una strategia di messa a fuoco automatica. Attiva o disattiva l'opzione di messa a fuoco automatica nel controllo software. Per il canale di riferimento, scegliere il canale del campo luminoso a luce trasmessa per ridurre al minimo la fototossicità.
È inoltre essenziale scegliere un intervallo di ricerca sufficientemente ampio in base al campione affinché l'autofocus funzioni correttamente. Prima di raccogliere le immagini, posizionare un punto particolare della griglia impressa vicino alla struttura di interesse nel mirino del software, quindi salvare questa posizione utilizzando uno screenshot. Quindi, appena prima della fine di ogni intervallo di tempo di imaging, fare riferimento allo screenshot e regolare nuovamente la posizione del tavolino e la messa a fuoco se la messa a fuoco automatica non è in uso.
Il metodo presentato è stato utilizzato per analizzare lo sviluppo renale in embrioni morfesi WT1A di una linea di pesci zebra transgenici. Durante il nefrogeno precoce, questa linea ha scelto la fluorescenza verde nel mesoderma intermedio dove sorgono i progenitori renali, e successivamente durante lo sviluppo nei tubuli in formazione e nei primordi del nefrone. L'imaging time-lapse ha rivelato una nefrogenesi normale negli embrioni iniettati con Morpholino di controllo.
A 20 ore dalla fecondazione, i tubuli pronefrici in via di sviluppo erano visibili. Alle loro estremità anteriori, è stato possibile rilevare un accumulo sferico di cellule che rappresentano i primordi nefroni in formazione. Nelle ore successive, i tubuli e i primordi del nefrone crebbero, e i primodii iniziarono a fondersi sulla linea mediana.
Al contrario, la nefrogenesi è stata gravemente interrotta nei mutanti. Sebbene le strutture tubulari positive alla GFP fossero visibili a 20 ore dopo la fecondazione, erano diffuse e sottosviluppate. L'imaging time-lapse ha mostrato che la primorgia del nefrone non si è mai formata e un numero impressionante di cellule fluorescenti situate al di fuori dei pronefroni in via di sviluppo sono migrate ventralmente, lasciando il campo pronefrico.
Durante la sperimentazione di questo protocollo, è importante ricordare che l'assenza di apparecchiature aggiuntive, come il controllo della temperatura o le tabelle anti-evaporazione, richiede controlli regolari per derive e regolazioni. Seguendo questa procedura, gli embrioni immagine possono essere elaborati per eseguire altri metodi, come l'immunoistochimica, l'incetroipertizzazione o la PCR in tempo reale al fine di identificare componenti specifici di cellule, tessuti o per valutare l'espressione genica.
Panoramica
Questo metodo permette l'analisi time-lapse dello sviluppo degli organi negli embrioni di zebrafish utilizzando un microscopio di dissezione a fluorescenza. Permette l'osservazione diretta dei tessuti e dello sviluppo degli organi per diverse ore, fornendo informazioni sulla biologia dello sviluppo.
Componenti chiave dello studio
Area della scienza
- Biologia dello sviluppo
- Embriologia dello zebrafish
- Tecniche di microscopia
Sfondo
- L'imaging time-lapse è cruciale per studiare i processi di sviluppo.
- I metodi tradizionali possono essere complessi e costosi.
- Questo metodo offre un'alternativa più semplice ed economica.
- Può essere applicato a vari organismi modello.
Scopo dello studio
- Facilitare l'osservazione dello sviluppo degli organi in embrioni viventi.
- Fornire un metodo facile da usare e conveniente.
- Permettere ai ricercatori di investigare processi di sviluppo dinamici.
Metodi utilizzati
- Preparazione di zebrafish adulti per l'allevamento.
- Micro-iniezione di soluzioni Morpholino negli embrioni.
- Incorporazione degli embrioni in agarose per l'imaging.
- Imaging time-lapse con un microscopio di dissezione a fluorescenza.
Risultati principali
- Osservazione di successo dello sviluppo degli organi negli embrioni di zebrafish.
- Dimostrazione dell'efficacia del metodo per l'imaging time-lapse.
- Fornitura di informazioni sui cambiamenti spaziali e temporali durante lo sviluppo.
- Mostrato l'applicabilità ad altri processi di sviluppo e organismi.
Conclusioni
- Questo metodo è uno strumento prezioso per la ricerca in biologia dello sviluppo.
- Semplifica il processo di osservazione degli embrioni vivi nel tempo.
- Apri nuove strade per studiare vari fenomeni di sviluppo.
Domande frequenti
Executive Industry Relevance
This method provides an accessible approach for time-lapse imaging of organogenesis in zebrafish embryos, enabling direct observation of developmental processes without requiring complex or expensive microscopy infrastructure. By supporting longitudinal imaging of tissue dynamics in a vertebrate model, it facilitates early-stage target validation and mechanistic de-risking in discovery pipelines. The technique offers a cost-effective alternative for generating quantitative, reproducible data on morphogenetic events relevant to disease modeling and phenotypic screening.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of gene function in kidney development by visualizing spatial and temporal alterations in nephrogenesis upon wt1a knockdown.
- Operational Value: Supports hypothesis testing through direct visualization of pronephric tubule formation and nephron primordia fusion in live embryos.
- Predictive Value: Facilitates assessment of phenotypic severity in morphant models, aiding in target confidence evaluation for renal disease pathways.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates quantitative z-stack and time-lapse readouts of fluorescently labeled kidney structures for comparative analysis between control and perturbed conditions.
- Operational Value: Utilizes a fluorescence dissecting microscope with autofocus and relocation grids to minimize drift, enhancing reproducibility across imaging sessions.
- Assay Readiness: Produces standardized imaging outputs that can be used to establish baseline phenotypes for compound screening or genetic modifier studies.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Enables observation of conserved developmental processes in zebrafish, a disease-relevant system for modeling human kidney disorders.
- Mechanistic De-risking: Allows tracking of cellular migration and tubule morphogenesis defects, providing insight into off-target or pathway-specific effects of genetic perturbations.
- Preclinical Alignment: Supports progression from discovery to preclinical validation by establishing dose- or time-dependent phenotypic readouts.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from target hypothesis testing through lead identification, particularly for renal pathways where dynamic tissue imaging informs mechanism of action and phenotypic outcome.
- Discovery Biology: Supports functional validation of targets like wt1a by enabling real-time observation of downstream developmental consequences in a living system.
- Screening: Generates reproducible fluorescence-based readouts suitable for assessing compound effects on kidney morphogenesis in a vertebrate context.
- Analytics: Provides quantitative measurements of tubule length, primordia formation, and cellular localization over time, enabling objective comparison across experimental groups.
- Translational Research: Connects early developmental phenotypes to later-stage organ dysfunction, supporting biomarker-aligned assessment of renal toxicity or repair.
- Enterprise Reuse: Represents a scalable imaging capability that can be applied across multiple developmental models and organ systems with minimal reconfiguration.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Reduces mechanistic ambiguity in target validation by linking genetic perturbation to observable developmental defects in a physiological context.
- Operational Value: Enhances reproducibility through hardware-based drift correction (autofocus, relocation grids) and standardized embryo preparation.
- Strategic Value: Improves go/no-go decision efficiency by providing early, visual confirmation of pathway modulation in a whole-organism assay.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of targets based on severity and specificity of developmental phenotypes observed in vivo.
Implementation Considerations
- Requires expertise in zebrafish husbandry, microinjection, and embryo staging for successful application.
- Dependent on fluorescence dissecting microscope with z-stack capability and software supporting autofocus and stage repositioning.
- Necessitates standardization of agarose embedding and embryo orientation to ensure consistent imaging quality across users and sessions.
- Adaptation to other organs or models may require changes in transgenic reporters, injection timing, or developmental staging.
- Practical limitations include lower throughput compared to automated systems and manual effort required for drift monitoring when autofocus is not used.
