Valutazione del rene Zebrafish Funzione Con un test Clearance fluorescente

L'obiettivo generale di questa procedura è generare un test quantitativo della funzionalità renale nel pesce zebra. Ciò si ottiene anestetizzando prima gli embrioni di pesce zebra a 72 HPF. Successivamente, gli embrioni vengono trasferiti in uno stampo a iniezione e orientati in modo che i loro cuori siano a sinistra del campo visivo.

Quindi la cavità pericardica viene iniettata con un colorante fluorescente extra alla rumina e sono necessarie immagini fluorescenti della regione cardiaca utilizzando un microscopio da dissezione a epifluorescenza. In definitiva, la clearance renale di un colorante fluorescente viene valutata utilizzando la microscopia a epifluorescenza. Il vantaggio principale di questa tecnica è che produce una lettura quantitativa della funzione renale del pesce zebra senza richiedere esami del sangue o urinari, che non sono possibili nel pesce zebra.

Questo metodo fornisce un potente strumento per valutare la funzione renale nei modelli di malattia del pesce zebra. Dopo aver estratto gli aghi e preparato uno stampo secondo il protocollo di testo, colare lo stampo versando prima una soluzione di aro al 2% prodotta in acqua di pesce in una capsula di Petri da 90 millimetri. Posizionare lo stampo sulla capsula di Petri, lasciando che i bordi della diapositiva impilati si immergano ad angolo sotto la superficie agricola.

Lasciar riposare per 30 minuti. Rimuovere il calco del vetrino e utilizzare acqua di pesce fresca contenente anestetico trica in un rapporto di uno a 25. Per coprire il vetrino impresso aros per eseguire iniezioni di pesce zebra di colorante fluorescente.

Utilizzare una configurazione standard di microiniezione costituita da un compressore d'aria collegato a un sistema di regolazione della pressione che alimenta un portapipette diritto per l'uso con capillari di diametro esterno 1,0. Il supporto della pipetta deve essere alloggiato all'interno di un compatto MN 33. Micro manipolatore di controllo a tre assi fissato a una piastra di base in acciaio da un microscopio da dissezione per l'utente con supporto magnetico per visualizzare, manipolare e iniettare embrioni mantenendo il pesce zebra utilizzando le condizioni standard descritte nel protocollo di testo.

Utilizzare lenze di pesce zebra wild type o transgenico a seconda dell'esperimento. Mantenere una densità di allevamento di 15 maschi per 15 femmine per vasca da otto litri per garantire che le uova vengano raccolte al massimo senza disturbare i pesci. Immergere le vasche di riproduzione in vasche di allevamento di tipo selvatico la sera prima della raccolta.

Il giorno della raccolta, attendere dai 30 ai 40 minuti affinché il pesce deponga le uova. Quindi utilizzare un colino a rete e acqua fresca dell'acquario per raccogliere e sciacquare le uova. Depositare le uova pulite in una capsula di Petri da 90 millimetri contenente embrione, terreno e incubare a 28,5 gradi Celsius per inibire la miogenesi.

A otto ore. Post fecondazione o HPF. Trasferire gli embrioni vitali in un liquido minimo in piastre di Petri fresche contenenti da 1 a 100 PTU al mezzo embrionale e incubare ulteriormente a 28,5 gradi Celsius.

Usa una pinza a punta fine per rompere l'estremità dell'ago. Quindi spostare l'RD sulla punta dell'ago massimizzando la durata dell'impulso al minuto. Quando la soluzione raggiunge la punta, torna a millisecondi.

Posizionare un micrometro sul tavolino del microscopio e con il regolatore di pressione e le rifiniture sulla punta dell'ago, regolare la dimensione della gocciolina espulsa a 100 micron di diametro o un volume di 0,5 nanolitri prima dell'iniezione. Prepara 2 piastre di Petri da 35 millimetri. Ciascuno contenente cinque millilitri di embrione, etichettare un trica e l'altro recupero.

Aggiungere 200 microlitri di trča al piatto etichettato con trica. Una volta pronto per l'iniezione, seleziona un singolo embrione a 72 HPF. Trasferire una quantità minima di liquido nella piastra trica e monitorare l'attività dell'embrione.

Una volta che l'embrione è stato anestetizzato, trasferirlo nello stampo a iniezione e orientarlo nella mangiatoia in modo che il lato sinistro sia rivolto verso l'alto. Posizionamento del cuore sul lato sinistro del campo visivo. Per iniettare la RD nel cuore, utilizzare l'ago per perforare il pericardio e iniettare un nanolitro di RD nella cavità pericardica.

Dopo aver ritirato l'ago, trasferire l'embrione iniettato in un liquido minimo nella piastra di recupero e monitorare per un minuto. Quindi trasferire il singolo embrione in una piastra a 24 pozzetti contenente un millilitro di terreno embrionale fresco contenente PTU ed etichettare in modo appropriato. Dopo aver iniettato almeno 10 embrioni per gruppo sperimentale, incubare a 28,5 gradi Celsius per tre ore.

A tre ore dall'iniezione o HPI embrioni anestetizzati come descritto in precedenza. Trasferire in una capsula di Petri da 35 millimetri contenente il 3% di metilcellulosa. Spingere delicatamente gli embrioni nella metilcellulosa e orientarli in modo che il lato laterale possa essere visualizzato.

Utilizzando un filtro di emissione di 570 nanometri per la luce UV, acquisire un'immagine dell'embrione. Lasciare che l'embrione si riprenda prima di riposizionarlo nell'apposito pozzetto, acquisire le immagini per tutti gli embrioni iniettati, quindi continuare a incubare a 28,5 gradi Celsius. Dopo aver acquisito un secondo ciclo di immagini a 24 HP, utilizzo il software Image J per quantificare l'intensità della fluorescenza di ciascun embrione iniettato aprendo un'immagine e specificando una regione di interesse o ROI.

Scegliendo modifica selezione, specificare e impostare il valore a 100 pixel quadrati. Posiziona il cuore al centro del ROI e scegli analizza, imposta le misurazioni e imposta le misurazioni in modo che includano la scala di grigi media e l'area. Quindi eseguire la misurazione, quantificare la fluorescenza per ogni serie di immagini a tre HPI e 24 HPI per embrione e trasferire i valori medi della scala di grigi su un foglio di calcolo per un'ulteriore elaborazione.

Utilizzare un software appropriato per eseguire analisi statistiche e confrontare i gruppi per la significatività statistica utilizzando il test T dello studente come mostrato qui. L'iniezione di RD in bbbs nove pesci iniettati con Morpho ha provocato lo sviluppo di cisti di fric prone da parte del 40% degli embrioni entro cinque giorni dalla fecondazione. Inoltre, il pesce morfina ha mostrato una riduzione della capacità di eliminare il colorante fluorescente dopo 24 HPI rispetto ai controlli.

Una volta mosto, un gruppo di 10 pesci può essere iniettato entro 15 minuti. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come sfruttare la trasparenza ottica del pesce zebra per monitorare quantitativamente la clearance temporale di un colorante fluorescente microiniettato come lettura efficace della funzione renale del pesce zebra.