Name: Valutazione del rene Zebrafish Funzione Con un test Clearance fluorescente (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-02-20T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 13 s
Description: Scopri un metodo quantitativo per valutare la funzione renale in Danio rerio mediante un test di clearance con fluoroforo. Questa tecnica non invasiva supera i limiti dei metodi tradizionali e facilita la ricerca sulle malattie renali croniche.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

L&#39;assistenza tecnica fornita da Jaipreet Bharj. Questo lavoro è stato sostenuto da sovvenzioni dal EU-FP7 (SYSCILIA -241.955) e The Kidney Foundation olandese (CP11.18).

Etica Dichiarazione: animali di manutenzione, allevamento, e le procedure sono definiti e controllati dagli Animali (procedure scientifiche) Act 1986. Tutti sperimentazione animale è stata effettuata sotto licenze concesse dallo Home Secretary (PIL No. 70/7892) in conformità con Biologica Servizi Management Group e il Comitato Etico Servizi biologica, SGUL, Londra, UK. Sono stati fatti tutti gli sforzi per ridurre il numero di animali utilizzati e di affinare sia le procedure e allevamento, al fine di ridurre al minimo le sofferenze e migliorare il benessere. 1. Preparazione degli strumenti, anestetici, e fluorescente Dye <ol><li> Utilizzando un estrattore micropipetta e capillari standard di borosilicato parete (senza fili) tirare aghi di lunghezza appropriata per microiniezione (Figura 1A). </li><li> Fare uno stampo agarosio per l&#39;orientamento di embrioni per l&#39;iniezione facile nel pericardio (Figura 1B). Colla circa dieci vetro microscopio slidi insieme per formare una &#39;scala&#39; di diapositive offset. Per ottenere i migliori risultati, utilizzare una goccia di rapida messa resina epossidica colla nel centro di ciascuna diapositiva. </li><li> Tagliare una sezione di circa 78 mm di lunghezza a metà due pipette 10 ml in plastica con un becco Bunsen bisturi riscaldata, rimuovere pipetta finisce a seconda dei casi. Attaccare e sezioni colla (resina epossidica) pipette ai vetrini impilati per fornire stabilità per consentire lo stampo di immergere in una capsula di Petri 90 mm. Fare ogni sforzo per garantire angoli di scorrimento allineano perpendicolare al pavimento piatto Petri. Lasciare il tempo colla per impostare. </li><li> Cast lo stampo in una soluzione di agarosio 2% made in acqua pesci (ottenuto dall&#39;acquario). Versare agarosio in un piatto 90 millimetri Petri e posizionare lo stampo sulla parte superiore del piatto Petri aperta, permettendo la diapositiva impilati bordi per immergere un angolo sotto la superficie agarosio. Lasciare impostata sul banco di laboratorio per 30 min. </li><li> Rimuovere il cast vetrino e coprire il agarosio slide-impresso con acqua il pesce frescocontenente Tricaine anestetico (vedi punto 1.9) con un rapporto di 01:25. </li><li> Fare soluzioni di rodamina destrano (RD) dye. Risospendere rodamina B 10.000 MW etichettato destrano in acqua ultrapura autoclavato a fare una scorta di concentrazione di 50 mg / ml. Per microiniezione, diluire ulteriormente il titolo ad una concentrazione finale di 5 mg / ml in acqua ultrapura autoclave. NOTA: Pigmento cellule iniziano a differenziarsi in zebrafish da 24 ore dopo la fecondazione (HPF); questi possono oscurare marcatori fluorescenti durante l&#39;acquisizione dell&#39;immagine. </li><li> Inibire la formazione melanocita utilizzando N -Phenylthiourea (PTU), che blocca la melanogenesi attraverso l&#39;inibizione della tirosinasi. Fare una soluzione madre 0,003% di PTU sciogliendo polvere PTU in acquario, soluzione di calore a 60 ° C per solubilizzare completamente. </li><li> Incubare embrioni di zebrafish in soluzione di blu di metilene, un fungicida lieve, per evitare fioriture fungine e aumentare la sopravvivenza. Aggiungere 2 ml di blu di metilene soluzione madre, contenente 0,1% blu di metilene in uacqua ltrapure, a 1 l di acqua e l&#39;uso come mezzo embrione standard. </li><li> Portare a 15 mM concentrazione magazzino di Tricaine sale methanesulfonate / etil-3 amminobenzoato come indicato in &#39;The Zebrafish libro&#39; 23. Anestetizzare gli embrioni e di conseguenza li immobilizzato per eseguire la procedura di microiniezione. </li><li> Dopo anestetizzante gli embrioni, orientarli, per l&#39;imaging utilizzando le proprietà non-tossici e viscosi di metilcellulosa. Per fare un 200 ml preparazione di 3% metilcellulosa, chill 130 ml di acqua a -20 ° C per 30 min e posto su ghiaccio. Riscaldare 70 ml di acqua a 80 ° C in un bicchiere di vetro, aggiungere 6 g di metilcellulosa, ed agitare con una bacchetta di vetro fino a che tutte le particelle sono bagnate ed uniformemente dispersi. Aggiungere l&#39;acqua ghiacciata, mescolare, e consentire la preparazione raffreddare a 4 ° C per 30 minuti prima di aliquotando in 50 ml provette. NOTA: L&#39;abbassamento della temperatura permette la metilcellulosa di diventare solubile. La soluzione diventerà più spessacome gli idrati polvere. 3% di metilcellulosa può essere conservato senza crescita batterica per brevi periodi di una settimana a 4 ° C o più a -20 ° C. Assicurarsi che la metilcellulosa ha raggiunto RT prima dell&#39;uso. </li><li> Per eseguire iniezioni di colorante fluorescente nel zebrafish utilizzare un microiniezione set-up standard (Figura 1C). Questo consiste in un compressore d&#39;aria collegato ad un sistema regolatore di pressione che alimenta un supporto pipetta diritta per l&#39;uso con 1.0 capillari diametro esterno. Il titolare pipetta deve essere ricavato da un compatto micromanipolatore di controllo a 3 assi MM33 fissato ad una piastra di base in acciaio da un supporto magnetico. Gli embrioni possono essere visualizzati, manipolato e iniettato utilizzando un microscopio da dissezione stereo. </li></ol> 2. Zebrafish Husbandry e trattamento pre-iniezione <ol><li> Mantenere zebrafish come descritto in precedenza 23. Utilizzare un acquario set-up che fornisce l&#39;acqua di ricircolo fornita ad una temperatura costante di 28,5 ° C, Condizionati a pH 6,8-7,2 e conducibilità 450-550 mS con bicarbonato di sodio e Instant Ocean Sea Salt, rispettivamente. Utilizzare tipo selvatico o linee di zebrafish transgenici come appropriato per l&#39;esperimento, il mantenimento di una densità di 15 maschi 15 femmine per 8 L serbatoio. Impostare il fotociclo impianto pesce a 14 ore di luce del giorno tra le 09:00-23:00. </li><li> Deposizione Zebrafish comincia all&#39;inizio della fotociclo, quando le luci accendono al mattino. Per garantire il massimo delle uova possono essere raccolti senza disturbare il pesce, immergere (inserti in rete contenenti, disponibili da specialisti zebrafish) vasche di allevamento in magazzino serbatoi di tipo selvatico la sera prima della raccolta. </li><li> Il giorno della raccolta, permette 30 - 40 minuti per i pesci a deporre le uova, dopo di che raccogliere e lavare le uova con un colino da tè e acqua dell&#39;acquario fresca. Depositare le uova pulite in un terreno contenente embrione 90 millimetri piastra di Petri e incubare a 28,5 ° C. </li><li> Trattare gli embrioni con PTU inibisce melanogenesi. Alle 8 HPF, trasferire embrioni vitali in liquido minimo per piatti freschi Petri contenenti 1: 100 PTU medio embrione e l&#39;ulteriore incubare a 28,5 ° C fino 72 HPF. NOTA: PTU può causare difetti di sviluppo, se utilizzato nelle fasi precedenti così dovrebbe essere limitato a postare 8 tappe HPF, ma può essere trattata più tardi 24 HPF. Tardo aggiunta di PTU non blocca completamente la pigmentazione degli occhi, ma è generalmente efficace e inibendo la formazione del tronco melanociti. </li></ol> 3. Microiniezione NOTA: Il pericardio avvolge il cuore, ma è separato per la protezione e la facilità di movimento cardiaco fluido nella cavità pericardico. Lo scopo di questa procedura è di iniettare RD nella cavità pericardio, questo permette un rapido assorbimento del colorante al sistema vascolare. <ol><li> Aghi di carico con 6 ml - diluito RD, con punte microloader e sicuro nel supporto ago della micromanipolatore. Rompere la fine dell&#39;ago utilizzando tipp benepinza Ed (Figura 1A). Spostare la soluzione RD alla punta dell&#39;ago massimizzando durata dell&#39;impulso per l&#39;impostazione dei minuti, tornare alla msec una volta completato. </li><li> Utilizzare un micrometro, il regolatore di pressione, ed i parametri di lunghezza della punta dell&#39;ago (usando pinze) per regolare la dimensione della gocciolina espulsa a 100 micron di diametro, ciò equivale a un volume di 0,5 nl (Figura 2A). NOTA: Quando si spezza l&#39;ago, fare attenzione a non rompere troppo fuori altrimenti farà calibrare il volume di iniezione difficile. Se necessario, rompere ulteriormente la punta dell&#39;ago per aumentare la dimensione della goccia tuttavia mantenere uno spessore ago che permette l&#39;ingresso nel pericardio senza eccessiva flessione o danni al tessuto. </li><li> Prima dell&#39;iniezione anestetizzare gli embrioni in media embrione contenente Tricaine. Impostare 2 x 35 millimetri piastre Petri contenenti 5 ml di mezzo embrione, un&#39;etichetta di &#39;Tricaine&#39; e l&#39;altro &#39;Recovery&#39;. </li><li> Aggiungere 200ml di magazzino Tricaine al piatto adeguatamente etichettati. Una volta pronto per iniettare, selezionare un singolo embrione a 72 HPF e trasferire in un liquido minimo al piatto Tricaine. Monitorare l&#39;attività dell&#39;embrione, testare l&#39;embrione è anestetizzato e immobilizzato da agitazione con una punta microloader troncato. </li><li> Trasferire l&#39;embrione anestetizzato allo stampo di iniezione e orientare l&#39;embrione in un trogolo agarosio modo che il lato sinistro è rivolto verso l&#39;alto, posizionando il cuore a sinistra del campo di vista. </li><li> Per iniettare il RD nel cuore, perforare il pericardio con l&#39;ago e iniettare 1 nl del RD nella cavità pericardico dell&#39;embrione anestetizzato (Figura 2B, pannello di destra). Estrarre l&#39;ago dopo l&#39;iniezione. Trasferire l&#39;embrione iniettato nel liquido minimo per il &#39;piatto Recovery&#39; e monitor per 1 min. Trasferire l&#39;embrione individuo a un 24-pozzetti contenenti 1 ml di mezzo embrione fresco (contenente PTU) e l&#39;etichetta in modo appropriato. NOTA: Il pericardio è dura, tuttavia c&#39;è un notevole punto debole all&#39;incrocio dove il pericardio incontra gli archi faringei ventro-caudale e dorso-rostrale sacco vitellino (Figura 2B freccia). L&#39;ago deve essere diretto a questo solco. Quando l&#39;ago è in posizione, un rubinetto di un dito ferma sulla sommità del micromanipolatore faciliterà ingresso nella cavità pericardico. </li><li> Ripetere i passaggi 3,2-3,6 per almeno 10 embrioni per gruppo sperimentale, mettere ogni pesce in un pozzo separato ed unicamente labelto permesso singoli esperimenti di follow-up. Incubare a 28.5 ° C per 3 ore. </li></ol> 4. Imaging Acquisition <ol><li> A 3 ore dopo l&#39;iniezione (HPI) anestetizzare gli embrioni come precedentemente descritto e versare in un piatto 35 millimetri Petri contenente 3% metilcellulosa. Spingere delicatamente embrioni in metilcellulosa e orientare così la parte laterale può essere ripreso. </li><li> Acquisire un&#39;immagine dell&#39;embrione sotto UV, utilizzando un filtro per la visualizzazione of emessa luce a 570 nm (Figura 2C). Dopo l&#39;acquisizione delle immagini, permettono l&#39;embrione di recuperare prima di sostituire ben designato. Acquisire le immagini per tutti gli embrioni iniettati e in seguito incubare a 28,5 ° C. NOTA: In questo protocollo abbiamo utilizzato uno stereomicroscopio a fluorescenza con un set di filtri TXR, una macchina fotografica DFC300FX e relativo software applicativo. Annotare le impostazioni di acquisizione esatte per la successiva acquisizione delle immagini. </li><li> Al 24 hpi, acquisire una seconda tornata di immagini, come descritto sopra. Una volta che tutte le immagini sono state acquisite, sia a 3 e 24 HPI HPI, umanamente disporre degli embrioni o utilizzare altri mezzi sperimentali per esempio, immunoistochimica. </li></ol> Elaborazione 5. Immagine <ol><li> Quantificare intensità fluorescenza di ogni embrione iniettato, a 3 e 24 HPI HPI, analizzando le immagini utilizzando il software ImageJ del NIH. Per misurare l&#39;intensità fluorescente, aprire un&#39;immagine in ImageJ e specificare una regione di interesse (ROI) a 100 px 2 (Modifica → selezione → specificare). </li><li> Posizionare il cuore nel centro del roi (Figura 2C), impostare misure di includere media scala dei grigi e la zona (Analizza → misure set), eseguire la misurazione (Analyze → misura). Completare per ogni set di immagini, alle 3 e 24 HPI HPI, per embrioni e trasferire valori medi scala di grigi di un foglio di calcolo per ulteriori elaborazioni. NOTA: Abbiamo scelto una dimensione roi fisso pari a 100 px 2 come questo comprende cuori individuali tra embrioni. Il cuore è stato selezionato per effettuare misurazioni a causa delle dimensioni che consente una posizione comoda per misurare il contenuto di fluorescenza del sangue prima di entrare nel rene. </li><li> Eseguire l&#39;analisi statistica utilizzando appropriati software statistico. Confronta i gruppi per la significatività statistica con t-test di uno studente. </li></ol>

<ol><li>Hentschel, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acute+renal+failure+in+zebrafish%3A+a+novel+system+to+study+a+complex+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Renal+Physiol%22%5BJournal%5D)">Acute renal failure in zebrafish: a novel system to study a complex disease.</a> Am J Physiol Renal Physiol. 288 (5), 923-929 (2005).</li>
<li>Drummond, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Making+a+zebrafish+kidney%3A+a+tale+of+two+tubes%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Making a zebrafish kidney: a tale of two tubes.</a> Trends Cell Biol. 13 (7), 357-365 (2003).</li>
<li>Ma, M., Jiang, Y. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Jagged2a-notch+signaling+mediates+cell+fate+choice+in+the+zebrafish+pronephric+duct%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genet%22%5BJournal%5D)">Jagged2a-notch signaling mediates cell fate choice in the zebrafish pronephric duct.</a> PLoS Genet. 3 (1), e18(2007).</li>
<li>Liu, Y., Pathak, N., Kramer-Zucker, A., Drummond, I. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Notch+signaling+controls+the+differentiation+of+transporting+epithelia+and+multiciliated+cells+in+the+zebrafish+pronephros%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Notch signaling controls the differentiation of transporting epithelia and multiciliated cells in the zebrafish pronephros.</a> Development. 134 (6), 1111-1122 (2007).</li>
<li>Drummond, I. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kidney+development+and+disease+in+the+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22J+Am+Soc+Nephrol%22%5BJournal%5D)">Kidney development and disease in the zebrafish.</a> J Am Soc Nephrol. 16 (2), 299-304 (2005).</li>
<li>Cardenas-Rodriguez, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+CCDC28B+reveals+its+role+in+ciliogenesis+and+provides+insight+to+understand+its+modifier+effect+on+Bardet-Biedl+syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Genet%22%5BJournal%5D)">Characterization of CCDC28B reveals its role in ciliogenesis and provides insight to understand its modifier effect on Bardet-Biedl syndrome.</a> Hum Genet. 132 (1), 91-105 (2013).</li>
<li>Osborn, D. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Loss+of+FTO+antagonises+Wnt+signaling+and+leads+to+developmental+defects+associated+with+ciliopathies%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Loss of FTO antagonises Wnt signaling and leads to developmental defects associated with ciliopathies.</a> PLoS One. 9 (2), e87662(2014).</li>
<li>Pearson, C. G., Osborn, D. P., Giddings, T. H., Beales, P. L., Winey, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Basal+body+stability+and+ciliogenesis+requires+the+conserved+component+Poc1%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Basal body stability and ciliogenesis requires the conserved component Poc1.</a> J Cell Biol. 187 (6), 905-920 (2009).</li>
<li>Tobin, J. L., Beales, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Restoration+of+renal+function+in+zebrafish+models+of+ciliopathies%5BTitle%5D)+AND+%22Pediatr+Nephrol%22%5BJournal%5D)">Restoration of renal function in zebrafish models of ciliopathies.</a> Pediatr Nephrol. 23 (11), 2095-2099 (2008).</li>
<li>Torres, V. E., Harris, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autosomal+dominant+polycystic+kidney+disease%3A+the+last+3+years%5BTitle%5D)+AND+%22Kidney+Int%22%5BJournal%5D)">Autosomal dominant polycystic kidney disease: the last 3 years.</a> Kidney Int. 76 (2), 149-168 (2009).</li>
<li>Bogdanova, N., Markoff, A., Horst, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autosomal+dominant+polycystic+kidney+disease+-+clinical+and+genetic+aspects%5BTitle%5D)+AND+%22Kidney+Blood+Press+Res%22%5BJournal%5D)">Autosomal dominant polycystic kidney disease - clinical and genetic aspects.</a> Kidney Blood Press Res. 25 (5), 265-283 (2002).</li>
<li>Harris, P. C., Ward, C. J., Peral, B., Hughes, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polycystic+kidney+disease.+1%3A+Identification+and+analysis+of+the+primary+defect%5BTitle%5D)+AND+%22J+Am+Soc+Nephrol%22%5BJournal%5D)">Polycystic kidney disease. 1: Identification and analysis of the primary defect.</a> J Am Soc Nephrol. 6 (4), 1125-1133 (1995).</li>
<li>Reynolds, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aberrant+splicing+in+the+PKD2+gene+as+a+cause+of+polycystic+kidney+disease%5BTitle%5D)+AND+%22J+Am+Soc+Nephrol%22%5BJournal%5D)">Aberrant splicing in the PKD2 gene as a cause of polycystic kidney disease.</a> J Am Soc Nephrol. 10 (11), 2342-2351 (1999).</li>
<li>Pazour, G. J., San Agustin, ajt, Follit, J. A., Rosenbaum, J. L., Witman, G. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polycystin-2+localizes+to+kidney+cilia+and+the+ciliary+level+is+elevated+in+orpk+mice+with+polycystic+kidney+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">Polycystin-2 localizes to kidney cilia and the ciliary level is elevated in orpk mice with polycystic kidney disease.</a> Curr Biol. 12 (11), R378-R380 (2002).</li>
<li>Yoder, B. K., Hou, X., Guay-Woodford, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+polycystic+kidney+disease+proteins%2C+polycystin-1%2C+polycystin-2%2C+polaris%2C+and+cystin%2C+are+co-localized+in+renal+cilia%5BTitle%5D)+AND+%22J+Am+Soc+Nephrol%22%5BJournal%5D)">The polycystic kidney disease proteins, polycystin-1, polycystin-2, polaris, and cystin, are co-localized in renal cilia.</a> J Am Soc Nephrol. 13 (10), 2508-2516 (2002).</li>
<li>Baker, K., Beales, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Making+sense+of+cilia+in+disease%3A+the+human+ciliopathies%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Med+Genet+C+Semin+Med+Genet%22%5BJournal%5D)">Making sense of cilia in disease: the human ciliopathies.</a> Am J Med Genet C Semin Med Genet. 151C (4), 281-295 (2009).</li>
<li>Veland, I. R., Awan, A., Pedersen, L. B., Yoder, B. K., Christensen, S. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Primary+cilia+and+signaling+pathways+in+mammalian+development%2C+health+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nephron+Physiol%22%5BJournal%5D)">Primary cilia and signaling pathways in mammalian development, health and disease.</a> Nephron Physiol. 111 (3), 39-53 (2009).</li>
<li>Hruscha, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+CRISPR%2FCas9+genome+editing+with+low+off-target+effects+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Efficient CRISPR/Cas9 genome editing with low off-target effects in zebrafish.</a> Development. 140 (24), 4982-4987 (2013).</li>
<li>Bedell, V. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+genome+editing+using+a+high-efficiency+TALEN+system%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">In vivo genome editing using a high-efficiency TALEN system.</a> Nature. 491 (7422), 114-118 (2012).</li>
<li>Eisen, J. S., Smith, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Controlling+morpholino+experiments%3A+don%27t+stop+making+antisense%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Controlling morpholino experiments: don't stop making antisense.</a> Development. 135 (10), 1735-1743 (2008).</li>
<li>Gerlach, G. F., Wingert, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kidney+organogenesis+in+the+zebrafish%3A+insights+into+vertebrate+nephrogenesis+and+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Wiley+Interdiscip+Rev+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Kidney organogenesis in the zebrafish: insights into vertebrate nephrogenesis and regeneration.</a> Wiley Interdiscip Rev Dev Biol. 2 (5), 559-585 (2013).</li>
<li>Wingert, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+cdx+genes+and+retinoic+acid+control+the+positioning+and+segmentation+of+the+zebrafish+pronephros%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genet%22%5BJournal%5D)">The cdx genes and retinoic acid control the positioning and segmentation of the zebrafish pronephros.</a> PLoS Genet. 3 (10), 1922-1938 (2007).</li>
<li>Westerfield, M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aWesterfield%2C+M+%22The+zebrafish+book.+A+guide+for+the+laboratory+use+of+zebrafish+%28Danio+Rerio%29%22">The zebrafish book. A guide for the laboratory use of zebrafish (Danio Rerio)</a>. , 4th, Univ. of Oregon Press. Eugene. (2000).</li>
<li>Forsythe, E., Beales, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bardet-Biedl+syndrome%29%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Hum+Genet%22%5BJournal%5D)">Bardet-Biedl syndrome).</a> Eur J Hum Genet. 21 (1), 8-13 (2013).</li>
<li>Corbetta, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+prevalence+of+simple+kidney+cysts+in+patients+with+primary+hyperparathyroidism%5BTitle%5D)+AND+%22J+Endocrinol+Invest%22%5BJournal%5D)">High prevalence of simple kidney cysts in patients with primary hyperparathyroidism.</a> J Endocrinol Invest. 32 (8), 690-694 (2009).</li>
<li>Veleri, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Knockdown+of+Bardet-Biedl+syndrome+gene+BBS9%2FPTHB1+leads+to+cilia+defects%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Knockdown of Bardet-Biedl syndrome gene BBS9/PTHB1 leads to cilia defects.</a> PLoS One. 7 (3), e34389(2012).</li>
<li>Vize, P., Woolf, A. S., Bard, J. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aVize%2C+P+%22The+Kidney%3A+From+Normal+Development+to+Congenital+Disease%22">The Kidney: From Normal Development to Congenital Disease</a>. , Academic Press. (2003).</li>
<li>Chang, R. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Permselectivity+of+the+glomerular+capillary+wall+to+macromolecules.+II.+Experimental+studies+in+rats+using+neutral+dextran%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">Permselectivity of the glomerular capillary wall to macromolecules. II. Experimental studies in rats using neutral dextran.</a> Biophys J. 15 (9), 887-906 (1975).</li>
</ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Zebrafish offrire un prezioso strumento per modellare malattia genetica umana, il loro impiego come strumento scientifico per la ricerca in vivo hanno consentito studi dettagliati sulla composizione genetica di molti sistemi biologici, tra cui il rene. Ora molto è capito su come si sviluppa il rene zebrafish e funzioni. Le somiglianze sorprendenti per nefrogenesi umana e omologia con i geni che causano malattie 21 ha illustrato come zebrafish sono diventati fondamentali per capire come difetti di fun...

Il rene umano gioca un ruolo cruciale nel filtraggio rifiuti metabolici dal sangue e il recupero soluti necessarie per sostenere l&#39;omeostasi cellulare. Ci sono un certo numero di malattie genetiche umane che causano disfunzioni renali. La malattia renale ereditaria più comune è autosomica dominante malattia del rene policistico (ADPKD) caratterizzato dallo sviluppo di fluidi riempita sacs all&#39;interno tubuli pochechnykh; i danni provocati da cystogenesis è dannoso per la funzione renale 10. ADPKD ha una occorrenza di 1: 800 - 1: 1.000 e rappresenta il 8-10% dei pazienti con insufficienza renale allo stadio terminale (ESRF) 11. Diversi geni sono stati implicati a causare ADPKD compreso policistina-1 (PKD1) e -2 (PKD2), che rappresentano circa l&#39;85% e, rispettivamente, 12,13 15% dei casi. Inoltre, i prodotti genici per PKD1 e -2 localizzano al ciglio e sono fondamentali per ciliogenesis 14,15. Vi è ora una famiglia riconosciuta di malattie genetiche umane, dettile ciliopatie, che influenzano la funzione delle ciglia e si traducono in CKD 16. Il crescente numero di malattie genetiche umane che influenzano lo sviluppo e la funzione ciliare sta disegnando interesse globale in questo organello vestigial tempo considerato. Il cilium, una sporgenza cellulare a ciglia, è arricchito con recettori e canali necessari per la trasduzione di eventi di segnalazione cellulare chiave ioni. Il cilium consiste di un axoneme basata microtubuli, tipicamente strutturato in nove doppietti microtubuli disposte radialmente con o senza una coppia centrale di microtubuli singoletto. La struttura axonemal definisce il tipo e la modalità di azione ciliare. La disposizione 9 + 2 microtubuli conferisce alla motilità cilium dove viene utilizzato nel movimento dei fluidi attraverso superfici epiteliali. La configurazione 9 + 0 non è mobili, ma si crede che soprattutto in funzione di eventi di segnalazione cellulare 17. Oltre CKD, le conseguenze della disfunzione ciliare sono un insieme di caratteristichecaratteristiche ciliopathy che comprendono, l&#39;obesità, la degenerazione della retina, polidattilia, e deterioramento cognitivo 16. Tuttavia, CKD è tra i più dannosi per la qualità della vita del paziente e quindi una forza trainante dietro lo sviluppo di adeguati modelli in vivo per ciliare correlati CKD. Il pesce zebra è un ottimo modello per comprendere l&#39;eziologia della malattia genetica umana. Il loro rapido sviluppo, la produzione di un gran numero di uova, il tessuto trasparente, e la crescita ex utero permette processi di sviluppo di zebrafish per essere visualizzati e gli eventi biologici manipolati con notevole facilità. I geni possono essere geneticamente modificati con il recente successo di strumenti di editing genoma (CRISPR 18 e Talens 19), abbattuto con antisenso tecnologia morfolino 20, o farmacologicamente regolati con l&#39;aggiunta di composti al loro ambiente acquatico. Infatti, zebrafish offrire una piattaforma di intraprendere experiments che non sono permissive in altri modelli animali. Mentre zebrafish sono vertebrati relativamente semplici (rispetto per gli esseri umani) hanno in comune molti organi funzionalmente conservati, geni e processi di segnalazione in comune con gli esseri umani. Ad esempio, il rene zebrafish è notevolmente simile in struttura e funzione rispetto agli esseri umani 21,22. Tuttavia, a differenza del rene mammiferi che si sviluppa attraverso una serie di fasi, ciascuna contrassegnata da un rene più sviluppata (Pronefro, mesonefro e metanefro), il pesce zebra embrionale si sviluppa solo pronephros, la forma più immatura di un rene. Mentre milioni di nefroni si trovano formare i mattoni del rene mammiferi, l&#39;embrione zebrafish solo possiede due. Il glomeruli, che consentono il filtrato del sangue iniziale, si fondono sulla linea mediana appena ventrale all&#39;aorta. I filtri di sangue attraverso il glomeruli nei tubuli pronephric che corrono caudalmente lungo l&#39;asse, fusione prima di uscire attraverso la cloaca. Il pronephric tubules sono fortemente ciliato con cilia motilità che sono permissive al flusso del filtrato verso l&#39;uscita caudale 3,4. Questa struttura semplice pronephric mantiene l&#39;omeostasi zebrafish attraverso diverse settimane di crescita delle larve dove alla fine si sviluppano in una più complessa struttura mesonefro 21. Tuttavia, il pesce zebra non sviluppa una metanefro 21. Nonostante le idiosincrasie zebrafish, nefrone zebrafish è segmentato con profili di espressione genica pari a quello osservato nei mammiferi e offre così un impareggiabile nel modello in vivo per nefrogenesi 3,22. Ordinariamente i pazienti sono testati per la funzione renale, attraverso una serie di esami del sangue e delle vie urinarie. Tipicamente il sangue viene analizzato per disciolto sali, urea e creatinina. Alti livelli di urea, creatinina e concentrazioni saline anomale sono indicativi di problemi con la funzione renale. L&#39;analisi delle urine utilizzando un asta colorimetrico rileva i livelli anormali di proteine, Blood, pus, batteri e zucchero in campioni di urina presente. Tali prove normalmente richiedono circa 30 ml di urina o di 5-10 ml di sangue. È stato difficile tradurre questi tipi di saggi di piccole organismi modello in vivo, come il pesce zebra, dovuta principalmente alla natura impossibile della raccolta di sangue o di urina sufficiente per eseguire il test. Qui, ci rivolgiamo la mancanza di adeguati test di funzionalità renale zebrafish e descriviamo una tecnica innovativa per il suo studio. Iniettando un colorante fluorescente nel flusso sanguigno siamo in grado di monitorare e quantificare singolarmente nel tempo la filtrazione e l&#39;escrezione di attività fluorescente dal sangue attraverso i reni. Questo metodo può essere usato per studiare il danno renale causato da malattia, cui forniamo un esempio di.

<table><tbody><tr><td>P-97 SUTTER Estrattore per micropipette di tipo fiammeggiante/marrone</td><td>Intracel</td><td>P-97</td><td></td></tr><tr><td>capillari a parete standard in borosilicato</td><td>Harvard Apparatus</td><td>30-0017</td><td></td></tr><tr><td>Vetrini per microscopio VWR</td><td>International</td><td>631-0109</td><td></td></tr><tr><td>Colla per resina epossidica</td><td>Evo-Stik</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Rhodamine B 10.000 MW etichettato Dextran</td><td>Life technologies&nbsp;</td><td>D-1824</td><td></td></tr><tr><td>N-feniltiourea&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich&nbsp;</td><td>P7629</td><td></td></tr><tr><td>Blu di metilene&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M9140</td><td></td></tr><tr><td>Etile 3-amminobenzoato metanosolfonato sale</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A5040</td><td></td></tr><tr><td>metilcellulosa</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M0512</td><td></td></tr><tr><td>compressore d'aria&nbsp;</td><td>Jun-Air</td><td>OF302-15</td><td></td></tr><tr><td>Picospritzer III&nbsp;</td><td>Strumenti Parker&nbsp;</td><td>051-0500-900</td><td></td></tr><tr><td>Micromanipolatore compatto di controllo a 3 assi&nbsp;</td><td>Marzhauser</td><td>MM33&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Stereomicroscopio da dissezione</td><td>Nikon</td><td>SMZ1000</td><td></td></tr><tr><td>punte per microloader</td><td>Eppendorf</td><td>5242956003</td><td></td></tr><tr><td>Dumont #5 pinze&nbsp;</td><td>Micrometro da palcoscenico Sigma-Aldrich</td><td>F6521</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Pyser- SGI</td><td>02A00404</td><td></td></tr></tbody></table>

valutazione del rene zebrafish funzione con un test clearance fluorescente

Evaluation of Zebrafish Kidney Function Using a Fluorescent Clearance Assay

L&#39;embrione zebrafish offre un modello per lo studio trattabili organogenesi e modello di malattia genetica umana. Nonostante la sua relativa semplicità, il rene zebrafish sviluppa e funzioni quasi nello stesso modo come gli esseri umani. Una differenza importante nella costruzione del rene umano è la presenza di milioni di nefroni rispetto al zebrafish che ha solo due. Tuttavia, semplificando un sistema così complesso in unità funzionali di base ha aiutato la nostra comprensione di come si sviluppa il rene e gestisce. In zebrafish, la linea mediana trova glomerulo è responsabile per la filtrazione del sangue iniziale in due tubuli pronephric che divergono per eseguire bilateralmente lungo l&#39;asse embrionale prima di fondersi tra loro a cloaca. I tubuli pronephric sono fortemente popolate da cilia motili che facilitano il movimento di filtrato lungo il tubulo segmentato, permettendo lo scambio di vari soluti prima infine di uscire attraverso la cloaca 2-4. Molti geni responsabili di CKD, incLuding quelli relativi alla ciliogenesis, sono stati studiati in zebrafish 5. Tuttavia, un grande inconveniente è stata la difficoltà di valutare la funzione renale zebrafish dopo manipolazione genetica. Saggi tradizionali per misurare disfunzioni renali nell&#39;uomo hanno dimostrato non traslazionale per zebrafish, dovuto principalmente al loro ambiente acquatico e le dimensioni ridotte. Ad esempio, non è materialmente possibile estrarre sangue da embrionale scena pesci per l&#39;analisi del contenuto di urea e creatinina, in quanto sono troppo piccole. Inoltre, zebrafish non produce abbastanza urine per il test su un semplice proteinuria &#39;astina&#39;, che viene spesso eseguita durante gli esami iniziali paziente. Descriviamo un test di fluorescenza che utilizza la trasparenza ottica della zebrafish per monitorare quantitativamente il passaggio di un colorante fluorescente, nel tempo, dal sistema vascolare e fuori attraverso il rene, per dare una lettura fuori della funzione renale 1,6-9.

Sindrome di Bardet-Biedl (BBS) è una ciliopathy eterogeneo rara che colpisce circa 1: 160.000 persone in tutto il mondo 16. I pazienti presentano una serie di problemi connessi compresi reni policistici, successivamente i pazienti spesso richiedono dialisi o il trapianto 24. ESRF è la causa più comune di morte in BBS, con circa il 30% dei pazienti che sviluppano CKD 16. Attualmente, 20 geni non correlati sono stati implicati in BBS senza pubblicato associazione genotipo-fenotipo. Le prot...

Il pesce zebra è uno strumento popolare per modellare la malattia renale cronica (CKD). Tuttavia, la loro piccola dimensione rende impossibile valutare la funzione renale con metodi tradizionali. Descriviamo un colorante fluorescente rene liquidazione test 1 che permette l&#39;analisi quantitativa della funzione renale zebrafish in CKD.

Valutazione del rene Zebrafish Funzione Con un test Clearance fluorescente

The zebrafish embryo offers a tractable model to study organogenesis and model human genetic disease. Despite its relative simplicity, the zebrafish ...

L'obiettivo generale di questa procedura è generare un saggio quantitativo della funzione renale nel pesce zebra. Questo viene ottenuto anestetizzando prima gli embrioni di pesce zebra a 72 HPF. Successivamente, gli embrioni vengono trasferiti in uno stampo per iniezioni e orientati in modo che i loro cuori si trovino a sinistra del campo visivo.Successivamente, la cavità pericardica viene iniettata con un colorante fluorescente rumina dextrale e vengono acquisite immagini fluorescenti della regione cardiaca mediante un microscopio stereoscopico a fluorescenza in episcopio. Infine, la clearance renale di un colorante fluorescente viene valutata utilizzando la microscopia a fluorescenza in episcopio. Il vantaggio principale di questa tecnica è che fornisce un'analisi quantitativa della funzione renale del pesce zebra senza richiedere test ematici o urinari, che non sono praticabili nel pesce zebra.Questo metodo fornisce uno strumento potente per valutare la funzione renale in modelli di malattia di zebrafish. Dopo aver preparato gli aghi e realizzato uno stampo secondo il protocollo descritto nel testo, versare innanzitutto una soluzione di aro al 2% preparata in acqua per pesci in

evaluation-zebrafish-kidney-function-using-fluorescent-clearance

Research

Ricerca

JoVE Journal

Biology

Biologia

Descriviamo una tecnica di microinjecting l'aminoglicoside, gentamicina, in 2 giorni dopo fetilization (DPF) larve di zebrafish per indurre danno renale acuto (AKI). Abbiamo anche descritto un metodo per intero immunoistochimica montaggio, plastica embedding e sezionamento delle larve di zebrafish per visualizzare il danno mediato AKI.

Microiniezioni endovenosa di larve Zebrafish allo Studio danno renale acuto

Trapianto di cellule è una tecnica fondamentale per lo studio e la rigenerazione dei tessuti per lo sviluppo di terapie basate sulle cellule della malattia. Si dimostra qui una tecnica di microchirurgia che permette il trapianto di cellule geneticamente etichettati direttamente nel rene di pesce zebrafish adulti.

Il trapianto di cellule direttamente nel rene di Zebrafish adulti

Il rene zebrafish è la patria di entrambi renale ematopoietiche adulte e cellule staminali / progenitrici, e rappresenta una straordinaria opportunità per studiare questi tipi di cellule e la loro progenie in un organismo modello vertebrato. Qui, dimostriamo una procedura dettagliata dissezione che consente al ricercatore di identificare e rimuovere chirurgicamente il rene adulto pesce zebra, che può essere utilizzata per applicazioni quali l'isolamento delle cellule, il trapianto, e studi di...

Dissezione del rene Zebrafish adulti

In questo video, dimostriamo la depigmentazione del rene adulto di zebrafish e la sua successiva preparazione per le procedure di colorazione. Dopo la colorazione, il rene adulto di pesce zebra può essere utilizzato per studiare la rigenerazione renale, la caratterizzazione fenotipica di modelli di malattia renale e la funzionalità del nefrone.

Depigmentazione e prestazione del rene di zebrafish: una tecnica per preparare il rene di zebrafish adulto per la colorazione

Il rene adulto zebrafish è un sistema eccellente per gli studi di rigenerazione e malattie renali. Un aspetto essenziale di tale ricerca è la valutazione della struttura e funzione del nefrone. Questo protocollo descrive le diverse metodologie che possono essere implementate per valutare la composizione nefrone tubulo e per valutare il riassorbimento renale.

Analisi di Nefrone Composizione e funzione del rene Zebrafish adulti

Qui presentiamo un metodo affidabile per studiare la rigenerazione renale adulta inducendo un danno renale acuto mediante iniezione di gentamicina. Dimostriamo che il danno dipende dal dosaggio di gentamicina e dalla temperatura ambientale utilizzando l'ibridazione in situ per marcare lhx1a+ sviluppando nuovi nefroni.

Rene Rigenerazione in Zebrafish adulti da Gentamicina Induced Injury

Il pesce zebra è un ottimo organismo sperimentale per studiare vertebrati processi di sviluppo e malattie umane modello. Qui, descriviamo un protocollo su come eseguire uno schermo manuale di chimica ad alta velocità in embrioni di zebrafish con tutto il montaggio ibridazione in situ (WISH) Lettura.

Un manuale Schermo piccole molecole si avvicina ad alta velocità Uso embrioni di zebrafish

Il metodo descritto qui permette l'analisi time-lapse di sviluppo degli organi in embrioni di zebrafish utilizzando un microscopio a fluorescenza dissezione in grado di eseguire sezionamento ottico e semplici strategie di riadattamento per correggere la deriva focale e planare.

Analisi dello sviluppo del rene Zebrafish con time-lapse imaging Utilizzando una dissezione microscopio dotato di sezionamento ottico

lesioni renali sostenuti da nefrotossine, che comprendono farmaci che vanno dagli antibiotici ai chemioterapici, può portare a disturbi complessi, la cui patogenesi rimane completamente sconosciuto. Questo protocollo dimostra come zebrafish può essere utilizzato per la malattia modellazione di queste condizioni, che possono essere applicati alla individuazione di misure renoprotettivi.

Nefrotossina microiniezione in Zebrafish per creare un modello danno renale acuto

Questo lavoro presenta un nuovo modello in vivo di lesioni segmentali del rene utilizzando gengive transgenici GFP reni. Il modello permette l'induzione dell'ablazione mirata delle cellule epiteliali del rene per mostrare i meccanismi cellulari di lesioni nefroniche e di riparazione.

Approccio preciso di ablazione cellulare per la modellazione di lesioni acute del rene nello sviluppo di zebrafish

Questo protocollo descrive le procedure per indurre la lesione renale acuta (AKI) nel pesce zebra adulto usando il cisplatino come agente nefrotossico. Abbiamo dettagliato i passaggi per valutare la riproducibilità della tecnica e due tecniche per analizzare l'infiammazione e la morte cellulare nel tessuto renale, citometria del flusso e TUNEL, rispettivamente.

Modello di lesione renale acuta indotto dal cisplatino nel pesce zebra adulto

Scopri un metodo quantitativo per valutare la funzione renale in Danio rerio mediante un test di clearance con fluoroforo. Questa tecnica non invasiva supera i limiti dei metodi tradizionali e facilita la ricerca sulle malattie renali croniche.

Valutazione del rene Zebrafish Funzione Con un test Clearance fluorescente

Esplora altri video