Valutazione del rene Zebrafish Funzione Con un test Clearance fluorescente

L'obiettivo generale di questa procedura è generare un saggio quantitativo della funzione renale nel pesce zebra. Questo viene ottenuto anestetizzando prima gli embrioni di pesce zebra a 72 HPF. Successivamente, gli embrioni vengono trasferiti in uno stampo per iniezioni e orientati in modo che i loro cuori si trovino a sinistra del campo visivo.

Successivamente, la cavità pericardica viene iniettata con un colorante fluorescente rumina dextrale e vengono acquisite immagini fluorescenti della regione cardiaca mediante un microscopio stereoscopico a fluorescenza in episcopio. Infine, la clearance renale di un colorante fluorescente viene valutata utilizzando la microscopia a fluorescenza in episcopio. Il vantaggio principale di questa tecnica è che fornisce un'analisi quantitativa della funzione renale del pesce zebra senza richiedere test ematici o urinari, che non sono praticabili nel pesce zebra.

Questo metodo fornisce uno strumento potente per valutare la funzione renale in modelli di malattia di zebrafish. Dopo aver preparato gli aghi e realizzato uno stampo secondo il protocollo descritto nel testo, versare innanzitutto una soluzione di aro al 2% preparata in acqua per pesci in una piastra di Petri da 90 millimetri. Posizionare lo stampo sulla piastra di Petri, consentendo ai bordi sovrapposti dei vetrini di immergersi ad angolo sotto la superficie dell'aro.

Lasciarlo riposare per 30 minuti. Rimuovere la stampa del vetrino e utilizzare acqua fresca per pesci contenente anestetico trica in un rapporto di uno a 25. Coprire il vetrino con aros stampati per eseguire iniezioni di colorante fluorescente nei pesci zebra.

Utilizzare un impianto standard per microiniezione costituito da un compressore d'aria collegato a un sistema regolatore di pressione che alimenta un porta-pipetta dritto da usare con capillari di diametro esterno 1,0. Il porta-pipetta deve essere alloggiato all'interno di un manipolatore micrometrico tridimensionale MN 33. Un supporto magnetico fissa il manipolatore a una piastra di base in acciaio. L'utente si avvale di un microscopio stereoscopico per visualizzare, manipolare e iniettare gli embrioni, mantenendo i pesci zebra in condizioni standard come descritto nel protocollo testuale.

Utilizzare linee di pesci zebra di tipo selvatico o transgeniche, a seconda dell'esperimento. Mantenere una densità di allevamento di 15 maschi e 15 femmine per ogni vasca da otto litri per garantire la raccolta del massimo numero di uova senza disturbare i pesci. Immergere le vasche di riproduzione nelle vasche contenenti pesci di tipo selvatico la sera precedente la raccolta.

Nel giorno del prelievo, attendere da 30 a 40 minuti affinché i pesci si riproducano. Successivamente, utilizzare un colino a maglie fini e acqua fresca dell'acquario per raccogliere e risciacquare le uova. Deporre le uova pulite in una piastra di Petri da 90 millimetri contenente mezzo per embrioni e incubare a 28,5 gradi Celsius per inibire la miogenesi.

Dopo otto ore dalla fecondazione (HPF), trasferire gli embrioni vitali con il minimo quantitativo di liquido in nuove piatti di Petri contenenti da uno a 100 PTU nel mezzo per embrioni e proseguire l'incubazione a 28,5 gradi Celsius.

Utilizzare pinzette fini per rompere l'estremità dell'ago. Successivamente, spostare l'RD fino alla punta dell'ago massimizzando la durata dell'impulso sull'impostazione di un minuto. Quando la soluzione raggiunge la punta, tornare alla scala dei millisecondi.

Posizionare un micrometro sul palco del microscopio e, utilizzando il regolatore di pressione e le regolazioni della punta dell'ago, regolare le dimensioni della goccia espulsa a un diametro di 100 micron o a un volume di 0,5 nanolitri prima dell'iniezione. Preparare 2 piastre di Petri da 35 millimetri, ciascuna contenente cinque millilitri di mezzo per embrioni; etichettarne una come trica e l'altra come recupero.

Aggiungere 200 microlitri di trica stock alla piastra etichettata con trica. Una volta pronti per l'iniezione, selezionare un singolo embrione a 72 HPF. Trasferire la quantità minima di liquido nella piastra con trica e monitorare l'attività dell'embrione.

Dopo aver anestetizzato l'embrione, trasferirlo nel mold per iniezioni e orientarlo nella scanalatura in modo che il lato sinistro sia rivolto verso l'alto, posizionando il cuore sul lato sinistro del campo visivo. Per iniettare il RD nel cuore, utilizzare l'ago per perforare il pericardio e iniettare un nanolitro di RD nella cavità pericardica.

Dopo aver rimosso l'ago, trasferire l'embrione iniettato con il minimo volume di liquido nella piastra di recupero e osservare per un minuto. Successivamente, trasferire l'embrione singolarmente in una piastra a 24 pozzetti contenente un millilitro di mezzo per embrioni fresco contenente PTU e etichettare in modo appropriato. Dopo aver iniettato almeno 10 embrioni per gruppo sperimentale, incubare a 28,5 gradi Celsius per tre ore.

Tre ore dopo l'iniezione o HPI, anestetizzare gli embrioni come descritto in precedenza e trasferirli in una piastra di Petri da 35 millimetri contenente cellulosa metilica al 3%. Spingere delicatamente gli embrioni nella cellulosa metilica e orientarli in modo che il lato laterale possa essere immaginato.

Utilizzando un filtro di emissione di 570 nanometri per la luce UV, acquisire un'immagine dell'embrione. Lasciare che l'embrione si riprenda prima di riposizionarlo nel pozzetto designato; acquisire immagini per tutti gli embrioni iniettati, quindi continuare l'incubazione a 28,5 gradi Celsius. Dopo aver acquisito un secondo ciclo di immagini a 24 HP, utilizzo il software ImageJ per quantificare l'intensità di fluorescenza di ciascun embrione iniettato, aprendo un'immagine e definendo una regione di interesse o ROI.

Scegliendo l'opzione modifica selezione, specificare e impostare il valore a 100 pixel quadrati. Posizionare il cuore al centro della regione di interesse (ROI) e selezionare analizza, imposta misure e configurare le misure in modo da includere la scala di grigi media e l'area. Successivamente, effettuare la misurazione, quantificare la fluorescenza per ogni serie di immagini a 3 HPI e 24 HPI per ogni embrione e trasferire i valori medi della scala di grigi in un foglio di calcolo per ulteriori elaborazioni.

Utilizzare un software appropriato per eseguire l'analisi statistica e confrontare i gruppi per determinare la significatività statistica mediante il test T di Student, come mostrato qui. L'iniezione di RD nei bbbs di nove pesci Morpho ha determinato lo sviluppo di cisti pronefriche nel 40% degli embrioni entro cinque giorni dalla fecondazione. Inoltre, i pesci morphin hanno mostrato una riduzione della capacità di eliminare il colorante fluorescente dopo 24 HPI rispetto ai controlli.

È necessario che un gruppo di 10 pesci venga iniettato entro 15 minuti. Dopo aver visto questo video, si dovrebbe avere una buona comprensione di come sfruttare la trasparenza ottica del pesce zebra per monitorare quantitativamente la rimozione nel tempo di un colorante fluorescente microiniettato, come indicatore efficace della funzionalità renale del pesce zebra.