Ad alta risoluzione Spatiotemporal Analisi del recettore Dynamics per singola molecola di microscopia a fluorescenza

Questo protocollo descrive come utilizzare la microscopia a fluorescenza a riflessione interna totale per visualizzare e tracciare singoli recettori sulla superficie delle cellule viventi e quindi analizzare la mobilità laterale del recettore, le dimensioni dei complessi recettoriali e per visualizzare le interazioni transitorie recettore-recettore. Questo protocollo può essere esteso ad altre proteine di membrana.

L'obiettivo generale del seguente esperimento è quello di visualizzare singoli recettori sulla superficie delle cellule viventi e analizzare la loro posizione, il movimento e l'associazione dinamica in complessi supramolecolari. Ciò si ottiene esprimendo recettori snap tagged a livelli molto bassi sulla superficie delle cellule viventi e marcandoli con fluorofori organici luminosi per consentire il rilevamento di singole molecole. In una seconda fase, le cellule vengono visualizzate mediante microscopia a fluorescenza a riflessione interna totale, che consente di acquisire una rapida sequenza di immagini delle singole particelle recettoriali che si muovono sulla superficie cellulare.

Successivamente, vengono applicati algoritmi automatizzati di rilevamento e tracciamento alla sequenza di immagini al fine di ottenere la posizione e l'intensità di ciascuna particella recettore nel tempo. Si ottengono risultati che mostrano un'analisi precisa delle dimensioni dei complessi recettoriali in questo esempio, beta due recettori adrenergici basati su un adattamento gaussiano misto della distribuzione di intensità delle particelle all'inizio della sequenza di immagini. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo della biologia cellulare, come ad esempio come i nostri recettori si organizzano nei domini od della superficie delle cellule viventi.

Come interagiscono tra loro per formare dimeri e oligomeri e come si verificano effettivamente eventi dinamici alla base della segnalazione del recettore. Il vantaggio principale di questa tecnica rispetto ai metodi biochimici e microscopici standard è che studia il comportamento di singoli recettori nell'ambiente naturale, permettendoci così di studiare aspetti importanti che sono tipicamente nascosti nelle misurazioni d'insieme. I vetrini coprioggetti per i campioni devono essere accuratamente puliti per ridurre al minimo la fluorescenza di fondo Durante l'imaging, utilizzare una pinzetta pulita per posizionare un diametro di 24 millimetri.

Il coperchio in vetro si infila in un supporto per vetrino coprioggetto che separa i singoli vetrini. Mettere il supporto con i vetrini coprioggetti in un becher e aggiungere il cloroformio fino a quando i vetrini coprioggetti non sono coperti. Coprire il becher con un foglio di alluminio per ridurre l'evaporazione e sonicare in un bagno.

Sonicare per un'ora a temperatura ambiente. Dopo un'ora, estrarre il supporto del vetrino coprioggetto dal becher e lasciare asciugare il vetrino coprioggetto. Quindi, posizionare il supporto con i vetrini coprioggetto in un altro becher e aggiungere una soluzione di idrossido di sodio a cinque molari fino a coprire i vetrini coprioggetti.

Come prima, coprire il bicchiere con un foglio di alluminio e sonicare per un'ora a temperatura ambiente, trasferire il supporto del vetrino coprioggetto in un nuovo bicchiere e lavare tre volte con acqua distillata. Infine, metti i vetrini coprioggetti puliti in una capsula di coltura cellulare di vetro riempita con etanolo al 100%. Qui sono mostrati i vetrini coprioggetti prima e dopo la pulizia, ripresi mediante fluorescenza a riflessione interna totale o microscopia del tappeto erboso.

I campioni di calibrazione Cal vengono utilizzati per stimare l'intensità di singole molecole fluorescenti durante la microscopia del tappeto erboso. Per preparare i campioni, sciogliere il colorante fluorescente nel solvente appropriato. Preparare una diluizione seriale da uno a 10 del colorante fluorescente che va da un picamolare a un anomolare.

In acqua sterilizzata con filtro. Lavare i vetrini coprioggetti precedentemente puliti trasferendoli in una piastra di coltura cellulare riempita con acqua sterilizzata con filtro. Successivamente, posizionare ciascun vetrino in un pozzetto di una piastra per colture cellulari a sei pozzetti e attendere che si asciughino per individuare 20 microlitri di ciascuna diluizione di colorante fluorescente su un vetrino coprioggetti pulito separato.

Lascia asciugare la copertura sotto una cappa sterile. Proteggere i vetrini coprioggetto dalla luce e dalla polvere fino all'uso prima della trasfezione. Preparare una piastra per colture cellulari a sei pozzetti Lavare i vetrini di copertura puliti con PBS sterile e posizionare un vetrino di copertura in ciascun pozzetto della piastra di coltura cellulare a sei pozzetti.

Le cellule CHO da trasfettare per questo studio vengono coltivate a 37 gradi Celsius in CO2 al 5% in una, una miscela di nutrienti media F 12 ECCO modificata con il 10% di siero bovino fetale penicillina e streptomicina dopo tripsina e contando le cellule seguendo metodi standard seme a una densità di tre volte 10 alla quinta cellula per pozzetto. Nella piastra di coltura cellulare a sesto pozzetto contenente i vetrini di copertura, lasciare crescere le cellule in un incubatore per 24 ore al fine di ottenere circa l'80% di fluenza di CO, che è la densità cellulare ottimale. Per la trasfezione.

L'aspetto più difficile di questo protocollo è quello di raggiungere un livello di espressione estremamente basso dei recettori di membrana sulla superficie cellulare per garantire il successo. La condizione di trasfezione. Ad esempio, la quantità di più media NA e il tempo dopo la trasfezione devono essere ottimizzati il giorno della trasfezione.

Preparare i reagenti di trasfezione per ciascuno diluirà due microgrammi del DNA plaid desiderato in 500 microlitri di terreno ottimale in un'altra provetta. Per ogni pozzetto diluire sei microlitri di Lipectomia 2000 in 500 microlitri di terreno Optum. Incubare entrambe le provette a temperatura ambiente per cinque minuti.

Dopo cinque minuti, unire entrambe le soluzioni in un tubo e mescolare per ottenere una miscela di trasfezione. Incubare la miscela di trasfezione a temperatura ambiente per 20 minuti. Nel frattempo, preparate le cellule CHO.

Lavare le cellule due volte con PBS pre-avvertito Dopo il secondo lavaggio, sostituire il PBS con un millilitro per pozzetto di terreno D-M-E-M-F 12 privo di rosso fenolo integrato con il 10% di FBS, ma senza antibiotici. Aggiungere un millilitro della miscela di trasfezione, goccia a goccia, su ciascun pozzetto e far oscillare delicatamente la piastra avanti e indietro per garantire una miscelazione completa. Incubare a 37 gradi Celsius in 5% di CO2 per due o quattro ore prima di procedere immediatamente alla marcatura delle proteine.

Per iniziare questa procedura, diluire un microlitro del derivato benzoguinico coniugato fluoro quattro o della soluzione madre di fluoro quattro BG in un millilitro di terreno D-M-E-M-F 12 integrato con il 10% di FBS per ottenere una concentrazione finale di un micromolare. Recuperare le cellule trasfettate dall'incubatore e lavare due volte con PBS preriscaldato. Sostituire il PBS con un millilitro di una soluzione micromolare di fluoro quattro BG e incubare a 37 gradi Celsius in CO2 al 5% per 20 minuti.

Successivamente, lavare le cellule tre volte con D-M-E-M-F 12 con il 10% di FBS ogni volta, seguito da un'incubazione di cinque minuti a 37 gradi Celsius. Ha utilizzato una pinzetta per trasferire i vetrini coprioggetto con le cellule marcate in una camera di imaging. Lavare due volte con 300 microlitri di tampone di imaging.

Aggiungere 300 microlitri di tampone di imaging fresco e procedere immediatamente all'acquisizione delle immagini di imaging. Utilizzando un microscopio per tappeti erbosi dotato di un obiettivo a immersione in olio, un'alta apertura numerica, laser adatti, un dispositivo accoppiato di carica moltiplicatrice di elettroni, una fotocamera e un'incubatrice e un controllo della temperatura. Impostare i parametri del microscopio desiderati, ovvero la linea laser, l'angolo del tappeto erboso, il tempo di esposizione, la frequenza dei fotogrammi e il numero di immagini per filmato.

Mettere una goccia di olio da immersione sull'obiettivo 100 x del microscopio. Posizionare la camera di imaging con le cellule marcate sul portacampioni del microscopio e mettere a fuoco le cellule. Utilizzo dell'illuminazione a campo chiaro.

Passa all'illuminazione del tappeto erboso. Mantenere la potenza del laser il più bassa possibile per consentire la ricerca della cella desiderata, ma allo stesso tempo ridurre al minimo lo sbiancamento delle foto. Seleziona la cella desiderata e multa.

Regolare la messa a fuoco. Aumenta la potenza del laser a un livello che consenta la visualizzazione di singoli quattro della flora. Acquisire una sequenza di immagini e salvare la sequenza di immagini grezze come file tiff per la calibrazione.

Assemblare ogni campione di calibrazione nella camera di imaging e posizionarlo sul microscopio. Scegliere un campione contenente una diffrazione ben separata. Macchie limitate che sbiancano in un solo passaggio.

Le sequenze di immagini del tappeto erboso vengono successivamente acquisite nello stesso modo dimostrato per le celle marcate. Per preparare una sequenza di immagini, utilizzare un software di elaborazione delle immagini come Image J per ritagliare le immagini. Salva i singoli fotogrammi come immagini TIFF separate in una nuova cartella che indica il numero di fotogramma su ciascuna immagine.

Il rilevamento e il tracciamento delle particelle vengono eseguiti con un software non commerciale come U Track in un ambiente MATLAB. Dal prompt dei comandi di MATLAB digitare movie selector, GUI. Per aprire l'interfaccia di selezione dei filmati, seguire le istruzioni per creare un nuovo database di filmati a partire dalle immagini separate salvate in precedenza.

Fornisci la dimensione dei pixel in nanometri, l'intervallo di tempo in secondi, l'apertura numerica, la profondità di bit della fotocamera e la lunghezza d'onda di emissione del fluoroforo necessaria per il rilevamento e il tracciamento delle particelle. Salvare il database dei filmati dall'interfaccia di selezione dei filmati. Eseguire l'analisi scegliendo le singole particelle come tipo di oggetto.

Eseguire l'algoritmo di rilevamento, quindi eseguire l'algoritmo di rilevamento. Utilizzare la routine di visualizzazione dei filmati contenuta nel pacchetto URAC per visualizzare le tracce e verificare la qualità del rilevamento e del tracciamento. Apri il file dot MAT per vedere la posizione e l'ampiezza delle particelle tracciate ad ogni fotogramma.

La dimensione delle particelle può anche essere calcolata dai dati acquisiti. Qui è mostrato il primo fotogramma di una tipica sequenza di immagini di una cellula trasfettata con recettori beta due adrenergici marcati a scatto e marcata con un derivato della ghinea benzilica coniugata al fluoro quattro. Le macchie rappresentano singoli recettori o complessi recettoriali.

Un algoritmo di rilevamento viene applicato alla stessa sequenza di immagini e ogni particella rilevata è indicata da un'applicazione di un cerchio blu di un algoritmo di tracciamento. Alla stessa sequenza di immagini si ottengono le traiettorie delle singole particelle indicate in blu. I segmenti verdi rappresentano gli eventi di unione, mentre i segmenti rossi rappresentano gli eventi di divisione.

Questo metodo acquisisce anche eventi dinamici. In questo esempio, due particelle subiscono un'interazione transitoria, si muovono insieme per diversi fotogrammi e si dividono di nuovo. Le traiettorie delle singole particelle vengono utilizzate per calcolare i loro coefficienti di diffusione.

Questo risultato rappresentativo mostra che il recettore adrenergico beta due ha un'elevata mobilità. Mentre il recettore gaba B ha una mobilità limitata, la dimensione dei complessi recettoriali può essere stimata con precisione adattando le distribuzioni delle intensità delle particelle con un modello gaussiano misto. Questa analisi può anche rivelare la coesistenza di monomeri e dimeri.

Qui sono mostrati esempi di sbiancamento delle particelle di un recettore monomerico in un passaggio e di uno sbiancamento delle particelle del recettore diametrale in due passaggi. Queste procedure possono essere estese e adattate per funzionare con altre proteine della superficie cellulare, metodi di livellamento e modelli cellulari. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come produrre un sonno pulito e coperto, come ottenere bassi livelli di espressione e un'etichettatura efficiente con fluoro organici luminosi, nonché come acquisire e analizzare le immagini del tappeto erboso, che rappresentano tutti i passaggi chiave per il successo di una singola molecola.