Mappatura diffusione molecolare nella membrana plasmatica da parte di più-Target Tracing (MTT)

Ciao. In questo video presentiamo un esperimento completo di tracciamento quantistico singolo. Un algoritmo dedicato è stato interamente concepito in collaborazione con esperti del gruppo ISIS per l'analisi delle immagini. Durante questo video, utilizzeremo il recettore del fattore di crescita epidermico come modello per descrivere il metodo di questa tecnica.

Il recettore del fattore di crescita epidermico è una proteina transmembrana. Questo recettore verrà marcato utilizzando un anticorpo monoclonale, ridotto per mantenere solo il frammento A a B. Il frammento A a B viene biotinilato e successivamente legato alla streptavidina del punto quantico, in modo che il sistema riconosca con precisione il recettore EGF.

Il nostro obiettivo è fornire una visione completa della dinamica dei recettori della superficie cellulare. In effetti, le traiettorie molecolari possono discostarsi da una diffusione libera restando confinate all'interno di nano domini. Ad esempio, questo potrebbe rappresentare la firma di un'interazione sottostante con, per esempio, partner di segnalazione o impalcature molecolari.

Il nostro obiettivo è descrivere in modo esaustivo tali eventi mappandoli sull'intera cellula, il che richiede di lavorare con un'elevata risoluzione temporale SPECT insieme a un'elevata densità di marcatura. Denominiamo pertanto questo approccio tracciamento multiplo di bersagli. Il primo passo dell'esperimento è la preparazione del campione.

Lavoriamo su cellule vive con o senza antibiotici. Qui utilizziamo sette cellule, che esprimono endogenamente recettori per l'EGF. Dopo aver staccato la cellula, dobbiamo confermare con precisione per avere lo stesso numero di cellule in ogni pozzetto della piastra.

Un numero preciso di cellule è molto importante per aumentare la prevedibilità del numero di punti quantici per cellula. Dopo aver dispensato le cellule nel pozzetto H, è necessario incubare il preparato per 24 ore a 37 gradi con il 7% di CO2. Il passo successivo è la preparazione dei punti quantici coniugati con anticorpi. I punti quantici sono nanoparticelle fluorescenti di piccole dimensioni.

Queste particelle hanno un interesse molto elevato qui perché sono molto luminose e stabili rispetto ai classici sonde fluorescenti e al segnale. Il rapporto tra naso è molto importante per questo tipo di esperimento. In questo caso, utilizziamo un mezzo completo per saturare le strisce intorno ai punti quantici e prevenire l'aggregazione.

Dopodiché, abbiamo messo i punti quantici nell'eluatato proteico bioTE o negli anticorpi di interesse in rapporto uno a uno, al fine di ottenere statisticamente un numero maggiore di punti quantici monovalenti. In questo esperimento, utilizziamo un frammento F(ab')₂ contro il recettore del fattore di crescita epidermico (EGFR), prodotto in laboratorio a partire da anticorpi monoclonali e marcati con biotina. Durante l'incubazione di circa 15 minuti, è possibile mantenere il controllo contro l'aggregazione e garantire l'omogeneità utilizzando un agitatore a 1.200 giri al minuto e a 25 gradi Celsius.

Quando il mix è pronto, è possibile aggiungerlo alle cellule. Rimuovere delicatamente il mezzo dal pozzetto per evitare il distacco delle cellule e aggiungere la quantità necessaria di mix per il proprio esperimento. In questo caso, aggiungeremo 100 microlitri di mix per pozzetto.

Dopo l'aggiunta della miscela, è possibile incubare la cellula per 15 minuti. In questo caso, a 37 gradi con il 7% di CO2. Al termine di questa incubazione, si potrebbe osservare un elevato numero di coppie di puntini frequenti in sospensione nel mezzo.

Questi punti quantici devono essere rimossi prima dell'acquisizione delle immagini. A causa del rumore che introduciamo, è necessario lavarli ogni volta, in questo caso più volte, cinque volte per eliminare eventuali contaminazioni.

Utilizzare un mezzo di imaging senza autofluorescenza. Qui usiamo un buffer HBSS con aps. Ora le cellule sono pronte.

È il momento di passare all'allestimento per l'acquisizione. L'allestimento è composto da quattro parti principali: un microscopio invertito, una telecamera con sensibilità oculare, una potente lampada a mercurio e un incubatore per mantenere le cellule a 37 gradi. La luce proveniente dalla lampada a mercurio passa attraverso una fibra e una ruota portafiltri prima di illuminare il campione.

L'intensità luminosa del campione viene filtrata e raccolta da una camera E-M-C-C-D posizionata a sinistra. Attualmente utilizziamo obiettivi con apertura numerica a olio pari a 1,3 e 1,49. Il passaggio centrale di questo esperimento è l'acquisizione in sé.

Dopo aver messo a fuoco le cellule, ne osserviamo una rappresentativa con un'etichettatura intensa. Nei punti quantici, acquisiamo innanzitutto una singola immagine in luce trasmessa bianca, che può essere successivamente utilizzata per verificare l'aspetto della cellula e il limite specifico dei podi LA. Successivamente, acquisiamo un video tipicamente a una frequenza di 36 millisecondi, la velocità massima consentita su tutta la superficie del fotogramma.

Utilizziamo un CCD a moltiplicazione elettronica per raggiungere la sensibilità a singola molecola con un rapporto segnale-rumore sufficiente, almeno superiore a 20 decibel. Tipicamente intorno a 25 decibel, acquisiamo solitamente 300 fotogrammi. Per valutare un determinato set di dati, è sufficiente fornire il percorso alla directory contenente i file video.

Quindi digitando il comando, il testo si ricollega in MetLab oppure con il comando MTT 23 I, che inizialmente visualizza un'interfaccia grafica contenente un elenco. Tutti i parametri utilizzati avvieranno un'analisi completamente automatizzata. L'analisi principale MTT viene eseguita su ogni fotogramma, richiamando tre operazioni principali: innanzitutto la rilevazione, per ciascun pixel, della presenza o assenza di un debito quantico del bersaglio.

Quindi, per ogni rilevamento, stima dei parametri rilevanti della traccia, come la posizione in pixel, l'intensità del segnale, e così via. Infine, riconnessione delle nuove tracce con quelle già costruite nei fotogrammi precedenti per ogni pixel.

Considerando una sottoregione locale, confrontiamo due ipotesi di presenza, ovvero quella di solo rumore o di un segnale. Con la funzione di diffusione del punto, ModuLite presenta un picco hin. Utilizziamo una soglia che garantisce un numero sufficientemente basso di falsi allarmi, con meno di un'allerta per ogni rilevamento per fotogramma per ciascun bersaglio rilevato.

Successivamente eseguiamo un'analisi ai minimi quadrati dei picchi fantasma dei nutrienti per stimare la posizione, la larghezza e l'altezza dei Goshen rilevati. Ciò fornisce in particolare la posizione spic del colorante, tipicamente con un'accuratezza compresa tra 10 e 20 nanometri; per rapporti segnale-rumore tipici, a elevate densità i picchi possono spesso essere troppo vicini e i picchi più intensi possono ostacolare quelli più deboli. Procediamo quindi alla deflazione dei picchi rilevati a partire dall'immagine iniziale.

Anche in questo caso, il rilevamento sul residuo può tipicamente ri-squilibrale il 10% dei picchi. Raggiungere un rilevamento quasi esaustivo è molto utile per una riconnessione accurata. Successivamente, l'insieme dei nuovi bersagli viene abbinato all'insieme delle tracce precedenti per questa pupilla.

Per assegnare, se possibile, ogni traccia a un bersaglio e gestire eventuali fenomeni di blinking, utilizziamo tutte le informazioni statistiche disponibili ottenute dal passaggio di rilevamento. Pertanto, i bersagli non vengono semplicemente assegnati alla traccia più vicina. In caso di conflitti, quando le tracce possono incrociarsi, il che significa che le rispettive regioni rilevanti di ricerca si sovrappongono, prenderemo in considerazione il valore statistico di intensità, velocità, larghezza e blinking sia per le tracce sia per i bersagli.

Questo fornisce il punteggio di riconnessione statisticamente ottimale. La strategia permette di evitare, quando possibile, un bias della riconnessione verso i vicini più prossimi, ovvero verso il movimento più lento. Successivamente utilizziamo una funzione per valutare possibili stati transitori di confinamento all'interno delle traiettorie.

Questa funzione è inversamente correlata alla diffusione locale, come stabilito da Sexton Simpson e collaboratori. L'applicazione di una soglia consente di definire episodi di confinamento o meno. Iterando questo processo su tutte le tracce, è infine possibile mappare la dinamica della membrana in termini di confinamento transitorio ed evidenza di rallentamento, e ciò può essere rappresentato.

In alternativa, utilizzando i valori binari o discreti di questo indice di confinamento, per impostazione predefinita MTT eseguirà automaticamente tali operazioni, salvando per ogni video i parametri grezzi per ciascun picco in un file eski e per ulteriori analisi avanzate. Risultati tipici come la mappa delle tracce su ogni cellula e gli istogrammi dei parametri di interesse, intensità dei picchi, rapporto segnale-rumore, valori locali di deficienza, possono essere facilmente adattati a qualsiasi indagine specifica. Questo video ora riassumerà i risultati tipici ottenuti con MTT.

Una parte sostanziale del lavoro consiste nell'elaborare l'algoritmo, che potrebbe necessitare di essere adattato a indagini specifiche come i modi di movimento anomali o le interazioni. Tuttavia, eseguire MTT è molto semplice. Gli utenti dovrebbero soltanto ottimizzare alcuni parametri, come i limiti spaziali e temporali.

Quando abbiamo elaborato l'MTT, abbiamo mirato a riconsiderare completamente le opzioni analitiche utilizzate per ogni compito. Abbiamo ottimizzato il processo lungo due assi impegnativi. Primo, gestire alte densità per ottenere la migliore informazione spaziale possibile sulla superficie, e secondo, affrontare un basso rapporto segnale-rumore (SNR), che tipicamente permette di lavorare a bassa eliminazione e alta velocità; il confinamento può essere interpretato come la firma di un'interazione sottostante.

I recettori della membrana possono interagire con il citoscheletro submembranoso o con domini ricchi di lipidi, ad esempio. Tali eventi possono essere studiati attraverso variazioni di confinamento nello spazio e nel tempo. Le misure dinamiche possono essere confrontate con approcci complementari come FRA F Cs o freight.

Il codice open source è disponibile per la ricerca accademica. Può essere scaricato dalla nostra pagina web su CML dot univ if an S fr nella pagina del nostro team, che fornisce un link per il download. Invitiamo anche aziende interessate a contattarci.

Vorremmo ringraziare in particolare i membri del nostro team e delle strutture condivise per il supporto e le discussioni fruttuose. Questo progetto è finanziato dal CNRS nella c MAA University Pac Region National de La, e la Fondazione Medica è sostenuta dal league controller. Grazie per averci seguito.