Name: Mappatura diffusione molecolare nella membrana plasmatica da parte di più-Target Tracing (MTT) (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-05-27T14:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 19 s
Description: Scopri l'algoritmo Multi-Target Tracing per tracciare molecole singole nella membrana plasmatica utilizzando il recettore del fattore di crescita epidermico come modello. Questo metodo computazionale permette di analizzare la dinamica nanoscopica dei recettori di superficie cellulare in tempo reale.

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Ringraziamo i membri del nostro team, in particolare Blache MC per l&#39;assistenza tecnica, nonché M Irla e B Imhof, per il sostegno e proficue discussioni. I dati relativi deflazione e il confinamento riprodotto per gentile concessione di Nature Methods. Questo progetto è sostenuto da finanziamenti istituzionali del CNRS, l&#39;INSERM e Marsiglia University, e da contributi specifici della Regione Provence-Alpes-Côte-d&#39;Azur, Institut National du Cancer, Agence Nationale de la Recherche (ANR-08-PCVI- 0034-02, ANR 2010 blan 1214 01) &amp; Fondation pour la Recherche Médicale (Equipe labélisée FRM-2009). VR è supportato da una borsa di studio per il Cancro Ligue Nationale Contre le.

In questo video, vi presentiamo un completo unico esperimento di tracciamento di particelle, utilizzando quantum-dots rivolti ad un recettore di membrana specifico. L&#39;obiettivo principale di questo esperimento consiste nel discriminare differenti tipi di comportamenti diffusione molecolare misurata nella membrana plasmatica di cellule vive. Infatti, i movimenti molecolari che derivano a livello della membrana in genere può discostarsi dalla diffusione browniano essendo linearmente diretto o confinata all&#39;interno nanodomains 26-29, per esempio. Il nostro obiettivo è contemporaneamente in seguito come molti recettori tecnicamente possibile, di fornire un&#39;istantanea della varietà risultante nelle dinamiche che si verificano all&#39;interno della membrana di una cellula dal vivo. Questo è infine previsto per consentire decifrare dei meccanismi che regolano segnalazione cellulare recettore di superficie. 1. Coltura cellulare <ol><li> Preparare il campione cellulare: utilizzare aderenti COS-7 cellule che esprimono endogenamente l&#39;epidermal growth factor receptor (EGFR) 30. Quandolavorare con le cellule vive senza antibiotici assicurarsi di non avere latente sub-contaminazione rilevabile mediante appropriate tecniche sterili in qualsiasi momento durante la preparazione. </li><li> Crescere le cellule in mezzo completo (DMEM con 10% siero di vitello, glutammina 1%, 1% HEPES e sodio piruvato 1%, vedi tabella di reagenti specifici indicati), a 37 ° C con il 7% di CO 2, avendo cura di disporre in sub-confluenti, la crescita esponenziale prima di diffondersi in Lab-Tek. </li><li> Il giorno prima dell&#39;esperimento, diffondere 5000 cellule / pozzetto a 8-ben camere (Lab-Tek) e incubare durante la notte. Contare le cellule assicura una densità costante di cella, quindi un rapporto riproducibile dei quantum-punti per cella. </li></ol> 2. Cella Labeling Preparare quantum-dots con un rivestimento specifico. Quantum-dots sono nanoparticelle fluorescenti composte da semiconduttori. Queste nanoparticelle presentano un elevato interesse perché sono molto luminosi e fotostabili rispetto alla classicasonde fluorescenti 31,32, che permette raggiungimento di un opportuno segnale di rumore (SNR) per l&#39;imaging singola molecola. <ol><li> Prima l&#39;esperimento, produrre frammenti Fab contro EGFR dalla linea cellulare di ibridoma (mAb 108, ATCC HB-9764), mediante digestione con papaina come descritto in precedenza 21. </li><li> Fab coniugato con biotina, come da istruzioni del produttore (EZ-link solfo-NHS-LC-biotinylation Kit; Thermo Scientific, Fig. 1A.). </li><li> Utilizzare quantum-dots funzionalizzati con streptavidina (Invitrogen) e che emette a 605 nm (lunghezza d&#39;onda di emissione ottimale per la brillantezza, l&#39;individuazione e separazione dal cellulare autofluorescenza). </li><li> Preparare la soluzione di etichettatura in mezzo completo (vedi tabella di reagenti specifici), per saturare i streptavidins presenti intorno alle quantistica per punti, così come per prevenire l&#39;aggregazione e legame non specifico per le cellule e il vetrino. </li><li> Preparare due soluzioni intermedie:uno con quantum-dots-streptavidina e un altro con Fab biotinilato, ciascuno a 20 nm. </li><li> Mescolare un volume uguale di queste due soluzioni: mescolare i quantum-dots con Fab in rapporto 1:1 per ottenere una concentrazione finale di lavoro di nM Fab 10: quantum-dots complessa. Utilizzo di un rapporto equimolare favorisce la formazione di complessi mono-funzionalizzati composti da uno quantum dot-e un frammento Fab biotinilato. Ciò favorisce l&#39;etichettatura monovalente, limitando le osservazioni artefatto dovuto al recettore cross-linking 33,34. </li><li> Incubare per 15 minuti a 25 ° C, usando un agitatore a 1200 giri al minuto per prevenire l&#39;aggregazione. La miscela è quindi pronto per l&#39;uso in cellule viventi. </li><li> Incubare le cellule in 100 pl di miscela per 5 minuti a 37 ° C con il 7% CO 2. </li><li> Lavare le cellule con non-autofluorescente mezzo di imaging (tampone HBSS, 1% HEPES, vedere tabella di reagenti specifici) preriscaldata a 37 ° C. </li><li> Rimuovere con cura l&#39;eccesso di etichette per impedire l&#39;necessario rovinare il SNR da non legato, fuori fuoco quantum-dots, ampiamente da lavare ogni pozzetto con una media di imaging, di solito 5 volte a temperatura ambiente, con almeno 5 minuti di ritardo prima che l&#39;ultimo lavaggio. </li></ol> 3. Setup Optical Il video-microscopia installazione si compone di quattro parti principali: <ol><li> Un microscopio invertito con un cubo specifico fluorescenza (FF01-457/50 eccitazione, FF495-DI02 dicroico e FF01-617/73 filtri di emissione, Semrock) e un&#39;apertura numerico ad elevata (1.3 o 1.49) ad immersione in olio obiettivo 100x. </li><li> Una lampada a mercurio da 100 W (accoppiato al microscopio attraverso una fibra ottica, evitando interferenze con termoregolazione). </li><li> Una sensibilità di 512 x 512 pixel di altezza EMCCD fotocamera per ottenere una sufficiente SNR. </li><li> Un incubatore di mantenere i campioni biologici a 37 ° C durante l&#39;esperimento. </li></ol> 4. Acquisizione <ol><li> Selezionare le celle isolate e ben diffusa. Questofavorisce l&#39;estensione di Nizza, lamellipodia piatto, più adatto a cercare il movimento planare di molecole di membrana. </li><li> Valutare lo stato fisiologico cellulare, per il suo aspetto, sia in luce trasmessa e in fluorescenza: traffico vescicolare intenso, l&#39;assenza di segni necrotiche o apoptotiche, autofluorescenza bassa e medio-forte quantum-dot etichettatura (di solito fino a 1.000 quantum-dots per cella, vedere Fig. 1B, C). </li><li> Selezionare un alta densità di etichettatura, che è critica per monitorare simultaneamente i recettori quante più possibile. Questo è effettivamente limitato sia dalla fisiologica (espressione di superficie, accessibilità epitopo, movimento laterale) e parametri algoritmici (senza sovrapposizioni point-spread funzioni (PSF), anche tenendo conto sfocatura dovuta al movimento, per consentire una corretta rilevazione e riconnessione). </li><li> Per ogni cella, prima acquisire un&#39;immagine campo campo chiaro (preferibilmente utilizzando DIC, se disponibile) che consentono di verificare ulteriormente l&#39;aspetto delle cellulee limiti spaziali della lamellipodia. </li><li> Salva questa immagine utilizzando lo stesso nome come il video-stack (come ad esempio cell1.tif &amp; cell1.stk per esempio), in una sotto-cartella denominata DIC, dal momento che, con queste convenzioni, l&#39;algoritmo può automaticamente ritrovare l&#39;immagine corrispondente per ogni pila. </li><li> Acquisire video da 1 a 3 per cella, in continuo, tipicamente a 36 ms rate, il più rapido tasso ottenibile in full frame con questa fotocamera. Tuttavia si può acquisire a frequenze più elevate, fino a 1-ms frequenza, utilizzando CCD dedicato con sensibilità e / o meno pixel. Il frame-trasferimento di tecnologia fornisce ritardo trascurabile tra i fotogrammi. </li><li> Valorizzazione moltiplicano Electron dovrebbe sempre essere impostato al massimo (appena al di sotto di saturazione, se del caso) per consentire di raggiungere sensibilità unica molecola, con una sufficiente SNR, almeno superiore a 20 dB (per un efficace rilevamento di picco 1), tipicamente intorno 25-30 dB. </li><li> Tipicamente acquisire 300 fotogrammi al video, il peccatotraiettorie ce sono ricostruiti oltre ~ 100 frames in media, per lo più limitate da lunghi eventi lampeggianti. Video frequenza e la lunghezza può essere adattata per una data misura, che potrebbe richiedere più tracce per esempio. </li></ol> 5. Analisi MTT <ol><li> Selezionare il percorso della directory contenente i file video per valutare un dataset dato con Matlab o Octave. </li><li> Per avviare l&#39;analisi completamente automatizzato 1,35, digitare il comando detect_reconnex23 in Octave, o MTT23i in Matlab. Questo programma sta per &quot;versione 2.3, con interfaccia utente&quot; ed è disponibile per il download, insieme con la precedente versione 2.2. Si prima visualizza una interfaccia grafica che elenca tutti i parametri utilizzati, come mostrato in fig. 2. </li></ol> 6. Risultati rappresentativi MTT analizza automaticamente ogni video recorder, per fornire le tracce degli obiettivi individuati e stimati, integrati da ulteriorevestigations, come il rilevamento confinamento. Questo permette in ultima analisi, tracce di mappatura sulle immagini delle cellule (Fig. 1C e 3). Descrizione MTT L&#39;analisi MTT nucleo viene eseguita su ogni frame, invocando 3 compiti principali (Fig. 3): <ol><li> Rilevazione della presenza o assenza di un bersaglio (quantum dot-), scorrevole entro una sub-regione successivamente centrata attorno ad ogni pixel, dove sono confrontati due ipotesi: presenza sia di un segnale, con la PSF modellizzato come una bi-dimensionale gaussiana picco , o solo il rumore, con una soglia di allarme basso assicurando abbastanza falso, con meno di un riconoscimento spurio per fotogramma. Questo porta ad una mappa di probabilità di rivelazione. Ogni massimo locale viene considerato come un bersaglio putativo, assicurando che il suo livello di probabilità è superiore ad un valore minimo, impostato in base alla probabilità di falso allarme desiderata (PFA). Tale limite è fissato abbastanza basso di discriminare in modo efficiente SIGNalles dal rumore, evitando nel migliore dei rilevamenti spurie (PFA di 10 -6 per impostazione predefinita, per assicurare meno di un errore in 512 x 512 pixel le immagini), pur consentendo una probabilità sufficientemente elevata di rilevazione, raggiungendo il predetto teoricamente uno ottimale. Si noti che l&#39;esigenza di utilizzare un sub-regione implica che i bordi dell&#39;immagine (3 pixel, per una finestra predefinita di 7 x 7 pixel) non può essere valutato. </li><li> Stima, per ciascun bersaglio rilevato, dei parametri rilevanti, come sub-pixel posizione e l&#39;intensità di segnale. Per ogni obiettivo individuato, uno dei minimi quadrati di Gauss-Newton fit è accanto eseguita per stimare la posizione, la larghezza e l&#39;altezza del rilevato gaussiana. Questo fornisce in particolare la sub-pixel posizione del colorante (10 a 20 nm precisione per valori tipici SNR e coloranti immobili o lentamente diffusore, aumentando fino a circa 100 nm per coloranti diffondenti a 0,1 um 2 / s). </li><li> Riconnessione dei nuovi obiettivi con latracce già costruito nei fotogrammi precedenti. L&#39;insieme di nuovi bersagli è abbinato con la serie di tracce precedenti. Per questo scopo, al fine di assegnare ciascun bersaglio a una traccia, se possibile, tutte le informazioni disponibili statistiche ottenuto dalla fase di rilevamento viene utilizzato, non solo la posizione, ma anche l&#39;intensità, larghezza, lampeggiante e statistiche associate. Di conseguenza, gli obiettivi non sono solo assegnate al più vicino traccia: in caso di tracce che attraversano, intensità, velocità, larghezza e lampeggianti saranno prese in considerazione. Questo fornisce il punteggio riconnessione statisticamente ottimale. Questa strategia evita, quando possibile, di polarizzazione la riconnessione verso i vicini più prossimi. </li></ol> Picchi rilevati a posteriori può essere respinta se la loro stima o la riconnessione non riesce. Un test speciale gestisce l&#39;individuazione di nuovi picchi, che avrebbe avviato nuove tracce. Questo test utilizza un più spinto PFA (10 -7), poiché riconnessione un picco di una traccia può essere interpretato come un de facto o convalida<html> f la sua rilevanza (questo criterio essendo per definizione non si applica per i nuovi picchi). Traiettoria Analisi Possibile confinamento transitoria è prossima valutato da una funzione inversamente proporzionale alla diffusione locale 24-29. L&#39;applicazione di una soglia permette di definire confinato o meno episodi. Iterando questi su tutte le tracce, si può mappare membrana dinamica, in termini di confinamento transitoria / rallentare eventi. Questo può essere alternativamente rappresentato utilizzando il binario o valori discreti di questo indice confinamento. Per impostazione predefinita, esegue automaticamente MTT tali compiti, risparmiando 8 parametri di picco in un file di testo: numero di telaio, i e j posizione, intensità del segnale, il raggio, offset e lampeggia, per ogni fotogramma video (gruppo di 7 righe) e trace (colonna) . Questi parametri di output possono essere ricaricati in Matlab o Octave usando lo script fread_data_spt per ulteriori analisi delle tracce cioè o intensità di segnale, come esemplificato nella<html> &quot;Http://www.jove.com/files/ftp_upload/3599/MTT_example.txt&quot;&gt; script MTT_example in appendice. Ulteriori analisi portare a mappare le tracce su ciascuna cella (Fig. 1C e 3) e di fornire l&#39;istogramma della distribuzione dei parametri rilevanti (come intensità di punta, SNR o valori di diffusione locali). Per ogni file, media e deviazione standard di ogni parametro vengono salvate in un file di testo, insieme con l&#39;immagine degli istogrammi. Distribuzioni logaritmiche, come per spostamenti quadrati r 2, portare a media geometrica. Il coefficiente di diffusione D è calcolato da un fit lineare nel corso dei primi cinque punti della curva MSD. Questi valori forniscono una panoramica di un esperimento che coinvolge per esempio cinetica di reazioni cellulari o trattamenti farmaceutici / enzimatica che riguardano l&#39;organizzazione della membrana. Dal momento che MTT è un codice open-source, questo aspetto può essere facilmente adattato a qualsiasi indagine dedicata. 599fig1.jpg &quot;alt =&quot; Figura 1 &quot;/&gt; Figura 1. Monitoraggio recettori di membrana dinamica di MTT. (A) componenti di membrana, quali il EGFR, sono contrassegnati con i punti quantici accoppiati a frammenti Fab biotinilati (disegno schematico con scala approssimativamente corretta di ogni molecola). (B) Tipica immagine fluorescente acquisito da un live cellule COS-7, con 36 ms tempo di esposizione, raffiguranti diffrazione limitata picchi corrispondenti al recettore singolarmente etichettati. (C) Output dell&#39;analisi MTT mostra le traiettorie ricostituiti dei recettori ricoperti sull&#39;immagine brightfield della cella. <img src="/files/ftp_upload/3599/3599fig2.jpg" alt="Figura 2" /> Figura 2. Parametri di ingresso MTT. Esecuzione MTT23i apre una interfaccia utente grafica che elenca tutti i parametri di input, i nomi ei valori di default, come descritto nella nostra precedente pubblicazione 1. Nei parametri dell&#39;algoritmo, spazio e tempo (Windows Search, raggio di picco, la massima diffusione<html> e lampeggiante) sono adimensionali in unità standard, pixel e cornici. Calibrazioni può essere applicato a posteriori per convertire i risultati di uscita. I valori di default, corrispondente ad un 512BFT Cascade con ingrandimento 100x, sono pixel size: 156 nm / pxl e il ritardo dei fotogrammi: 36 ms / frame. Gli investigatori dovrebbero ottimizzare alcuni parametri critici, come il massimo coefficiente di diffusione previsto (&quot;Diff max&quot;) e massima scomparsa lampeggiante (&quot;T off&quot;). Questi due limiti di spazio e tempo sono quasi gli unici che devono essere riesaminate in una data condizione sperimentale, gli altri vengono impostati su valori predefiniti robusti. Ad esempio, il numero di falsi allarmi è direttamente impostato per assicurare meno di un errore per milione di pixel, quindi, meno di uno per fotogramma, che è soddisfacente in molti casi. Tutti i parametri vengono salvati in un file di testo nella cartella di output, consentendo agli utenti di verificare a posteriori che le impostazioni sono state utilizzate per l&#39;analisi. s/ftp_upload/3599/3599fig3.jpg &quot;alt =&quot; Figura 3 &quot;/&gt; Figura 3. Grandi passi dell&#39;analisi MTT. Partire da una pila sperimentale di immagini di fluorescenza, picchi vengono sequenzialmente e rilevate automaticamente, stimato mediante un accoppiamento gaussiana e ricollegato più fotogrammi (prima gamma di operazioni, parte superiore del diagramma). Tracce può essere ulteriormente analizzati per confinamento putativo, per esempio, portando in definitiva a una mappa dinamica di descrittori pertinenti (seconda gamma di operazioni, parte inferiore). <img src="/files/ftp_upload/3599/3599fig4.jpg" alt="Figura 4" /> Figura 4. Valenza etichettatura non ha alcun impatto MTT. Per valutare la possibile distorsione introdotta da artefatti etichettatura polivalente, l&#39;analisi MTT è stata effettuata per tenere traccia EGFR endogena codificate usando 2 diversi regimi, per generare e analizzare mappe di traiettorie. (A) recettori sono stati etichettati con biotinilato Fab e quantum-dots605-streptavidina, come descritto nel protocollo.In questo caso, il multi-valenza dei quantum-streptavidins punti e può provocare accoppiamento diversi recettori di un singolo colorante. (B) recettori sono stati etichettati con Fab direttamente accoppiato ad un colorante organico, Atto647N. In questo caso, un Fab, un recettore di conseguenza, possono essere accoppiati a più di un colorante. (C) Media quadrato spostamento (MSD) curva è stata calcolata per tutte le tracce per ogni cella, marcato sia con quantum-dot o coloranti ATTO (grafici a destra ea sinistra, rispettivamente). Coefficienti di diffusione sono stati calcolati dal fit lineare nel corso dei cinque primi punti della MSD (linea rossa tratteggiata). Ogni schema di etichettatura ha portato alla diffusione dei valori simili (grafico centrale). Qdot: quantum-dots605 (n = 5 celle), Atto: Atto647N (n = 7 cellule), NS: non significativo (Student t-test valore di p&gt; 0,05).

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<li>Meilhac, N., Guyader, L. L. e, Salome, L., Destainville, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+confinement+and+jumps+in+single-molecule+membrane+trajectories%5BTitle%5D)+AND+%22Phys.+Rev.+E.+Stat.+Nonlin.+Soft.+Matter+Phys%22%5BJournal%5D)">Detection of confinement and jumps in single-molecule membrane trajectories.</a> Phys. Rev. E. Stat. Nonlin. Soft. Matter Phys. 73, 011915(2006).</li>
<li>Saxton, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-particle+tracking%3A+effects+of+corrals%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">Single-particle tracking: effects of corrals.</a> Biophys. J. 69, 389-398 (1995).</li>
<li>Serge, A., Fourgeaud, L., Hemar, A., Choquet, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Receptor+activation+and+homer+differentially+control+the+lateral+mobility+of+metabotropic+glutamate+receptor+5+in+the+neuronal+membrane%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Receptor activation and homer differentially control the lateral mobility of metabotropic glutamate receptor 5 in the neuronal membrane.</a> J. Neurosci. 22, 3910-3920 (2002).</li>
<li>Simson, R., Sheets, E. D., Jacobson, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+temporary+lateral+confinement+of+membrane+proteins+using+single-particle+tracking+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">Detection of temporary lateral confinement of membrane proteins using single-particle tracking analysis.</a> Biophys. J. 69, 989-993 (1995).</li>
<li>Jacobson, K., Dietrich, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Looking+at+lipid+rafts%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Looking at lipid rafts.</a> Trends Cell Biol. 9, 87-91 (1999).</li>
<li>Kusumi, A., Sako, Y., Yamamoto, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Confined+lateral+diffusion+of+membrane+receptors+as+studied+by+single+particle+tracking+%28nanovid+microscopy%29.+Effects+of+calcium-induced+differentiation+in+cultured+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">Confined lateral diffusion of membrane receptors as studied by single particle tracking (nanovid microscopy). Effects of calcium-induced differentiation in cultured epithelial cells.</a> Biophys. J. 65, 2021-2040 (1993).</li>
<li>Livneh, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Large+deletions+in+the+cytoplasmic+kinase+domain+of+the+epidermal+growth+factor+receptor+do+not+affect+its+laternal+mobility%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Large deletions in the cytoplasmic kinase domain of the epidermal growth factor receptor do not affect its laternal mobility.</a> J. Cell Biol. 103, 327-331 (1986).</li>
<li>Medintz, I. L., Uyeda, H. T., Goldman, E. R., Mattoussi, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantum+dot+bioconjugates+for+imaging%2C+labelling+and%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Quantum dot bioconjugates for imaging, labelling and.</a> 4, 435-446 (2005).</li>
<li>Wu, X., Bruchez, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Labeling+cellular+targets+with+semiconductor+quantum+dot+conjugates%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Labeling cellular targets with semiconductor quantum dot conjugates.</a> Methods Cell Biol. 75, 171-183 (2004).</li>
<li>Mohammadi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aggregation-induced+activation+of+the+epidermal+growth+factor+receptor+protein+tyrosine+kinase%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Aggregation-induced activation of the epidermal growth factor receptor protein tyrosine kinase.</a> Biochemistry. 32, 8742-8748 (1993).</li>
<li>Howarth, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monovalent%2C+reduced-size+quantum+dots+for+imaging+receptors+on+living+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Monovalent, reduced-size quantum dots for imaging receptors on living cells.</a> Nat. Methods. 5, 397-399 (2008).</li>
<li>Bertaux, N., Marguet, D., Rigneault, H., Sergé, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiple-target+tracing+%28MTT%29+algorithm+probes+molecular+dynamics+at+cell+surface%5BTitle%5D)+AND+%22Protocol+Exchange%22%5BJournal%5D)">Multiple-target tracing (MTT) algorithm probes molecular dynamics at cell surface.</a> Protocol Exchange. , (1038).</li>
<li>Groc, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Surface+trafficking+of+neurotransmitter+receptor%3A+comparison+between+single-molecule%2Fquantum+dot+strategies%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+neuroscience+%3A+the+official+journal+of+the+Society+for+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Surface trafficking of neurotransmitter receptor: comparison between single-molecule/quantum dot strategies.</a> The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 27, 12433-12437 (2007).</li>
<li>Cui, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((One+at+a+time%2C+live+tracking+of+NGF+axonal+transport+using+quantum+dots%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">One at a time, live tracking of NGF axonal transport using quantum dots.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104, 13666-13671 (2007).</li>
<li>He, H. T., Marguet, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detecting+nanodomains+in+living+cell+membrane+by+fluorescence+correlation+spectroscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Phys.+Chem%22%5BJournal%5D)">Detecting nanodomains in living cell membrane by fluorescence correlation spectroscopy.</a> Annu. Rev. Phys. Chem. 62, 417-436 (2011).</li>
<li>Cebecauer, M., Spitaler, M., Serge, A., Magee, A. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Signalling+complexes+and+clusters%3A+functional+advantages+and+methodological+hurdles%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell.+Sci%22%5BJournal%5D)">Signalling complexes and clusters: functional advantages and methodological hurdles.</a> J. Cell. Sci. 123, 309-320 (2010).</li>
<li>Kao, H. P., Verkman, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tracking+of+single+fluorescent+particles+in+three+dimensions%3A+use+of+cylindrical+optics+to+encode+particle+position%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">Tracking of single fluorescent particles in three dimensions: use of cylindrical optics to encode particle position.</a> Biophys. J. 67, 1291-1300 (1994).</li>
</ol>

Non ci sono conflitti di interesse dichiarati.

In una singola particella di monitoraggio, oltre agli aspetti cellulari e microscopia, l&#39;analisi rappresenta una parte sostanziale del lavoro. Questo risolve l&#39;algoritmo utilizzato per eseguire le tre compiti principali: rilevazione, stima e ricollegando i picchi su ogni frame. Ma l&#39;aspetto conseguente di questo lavoro risiede nell&#39;elaborazione lo stesso algoritmo, che potrebbe essere necessario essere adattato per qualsiasi nuova inchiesta dedicata, essenzialmente per gli ultimi, i passaggi aggiuntivi (...

<table border="1"><tbody><tr><td> Reagente </td><td> Azienda </td><td> Numero di catalogo </td><td> Quantità </td></tr><tr><td> Cos-7 linea cellulare </td><td> ATCC </td><td> CRL-1651 </td><td> 5000 cellule / pozzetto </td></tr><tr><td> HBSS senza Ca 2 + </td><td> GIBCO </td><td> 14175 </td><td> 1 ml </td></tr><tr><td> 0,05% tripsina EDTA </td><td> GIBCO </td><td> 25300 </td><td> 1 ml </td></tr><tr><td> 8-ben Lab-tek </td><td> NUNC </td><td> 155441 </td><td> 1 </td></tr><tr><td> QDot-605 streptavidina </td><td> Invitrogen </td><td> Q10101MP </td><td> 20 mM </td></tr><tr><td colspan="4"> Fab biotinilato (per la sintesi Fab, vedere il riferimento 21) </td></tr><tr><td> Fab da mAb 108 </td><td> ATCC </td><td> HB-9764 </td><td> 200 pg </td></tr><tr><td> NHS-Biotina<html></td><td> Thermo Scientific </td><td> 21435 </td><td> 18,5 mcg </td></tr><tr><td colspan="4"> Completa media </td></tr><tr><td> DMEM </td><td> GIBCO </td><td> 41965 </td><td> 500 ml </td></tr><tr><td> Siero fetale bovino </td><td> SIGMA </td><td> F7524 </td><td> 50 ml </td></tr><tr><td> L-Glutammina </td><td> GIBCO </td><td> 25030 </td><td> 5 ml </td></tr><tr><td> HEPES </td><td> GIBCO </td><td> 15630 </td><td> 5 ml </td></tr><tr><td> Sodio piruvato </td><td> GIBCO </td><td> 11360 </td><td> 5 ml </td></tr><tr><td colspan="4"> Imaging media </td></tr><tr><td> HBSS con Ca 2 + </td><td> GIBCO </td><td> 14025 </td><td> 25 ml </td></tr><tr><td> HEPES </td><td> GIBCO </td><td> 15630 </td><td> 250 pl </td></tr></tbody></table>1 &quot;&gt; <tbody><tr><td> Attrezzatura </td><td> Azienda </td><td> Riferimento </td></tr><tr><td> Microscopio invertito </td><td> Nikon </td><td> Eclipse TE2000U </td></tr><tr><td> Lampada fluorescente </td><td> Nikon </td><td> Intensilight C-HGFIE </td></tr><tr><td> 1,3 NA obiettivo 100x </td><td> Nikon </td><td> Pianificare Fluor 1,30 </td></tr><tr><td> 1,49 NA obiettivo 100x </td><td> Nikon </td><td> APO TIRF 1,49 </td></tr><tr><td> Macchina fotografica </td><td> Roper Scientific </td><td> Cascade 512 B </td></tr><tr><td> Box termostatato </td><td> Vita Imaging Servizi </td><td> The Box </td></tr></tbody></table> Appendice: Script esempio di analisi supplementari MTT Funzione MTT_example (file_name) %% Sulla base esempi che mostrano come recuperare i risultati di output MTT %%% Per tracciare ogni trace per la costruzione e l&#39;istogramma %%% Di intensità di fluorescenza se nargin &lt;1% non file_name fornito? file = dir (&#39;* STK.&#39;); se IsEmpty (files), disp (&#39;nessun dato in corrente dir&#39;), di ritorno, fine . file_name = file (1) nome, default%: primo file stk disp ([&#39;utilizzando&#39; file_name &#39;di default&#39;]) fine file_param = [file_name &#39;_tab_param.dat&#39;];% del file di output %% Di carico di dati cd (&#39;output23&#39;)% o (&#39;output22&#39;), in base alla versione utilizzata % Disclaimer: versione 2.2 genera solo 7 parametri, % Un parametro aggiuntivo, il rumore, è stato aggiunto nella versione 2.3 % Per leggere tutti i parametri in una volta, in una singola tabella Tab_param% = fread_all_param (file_param); % Tab_i = tab_param (2:08: fine, :); tab_j = ... % Per leggere tutti i parametri (ad eccezione frame_number) in tabelle separate % [Tab_i, tab_j, tab_alpha, tab_radius, tab_offset, tab_blk, tab_noise] = fread_all_data_spt (file_param); tab_i = fread_data_spt (file_param, 3); indice è del 3% perché il numero di traccia e numero di telaio, non informativo, vengono scartate! tab_j = fread_data_spt (file_param, 4); tab_alpha = fread_data_spt (file_param, 5); tab_blk = fread_data_spt (file_param, 8); % Loop% su tracce N_traces size = (tab_i, 1); Le tabelle sulla N_traces sono linee di colonne N_frames per ITRC = 1: N_traces No_blk_index = tab_blk (ITRC, :)&gt; 0; sulla procedura non solo lampeggianti plot (tab_i (ITRC, No_blk_index), tab_j (ITRC, No_blk_index)) &amp; Nbsp; xlabel (&#39;i (pixel)&#39;), ylabel (&#39;j (pixel)&#39;) title ([&#39;trace #&#39; num2str (ITRC)]) disp (&#39;Si prega di premere un tasto per la traccia successiva&#39;), pausa fine % Istogramma% Fluo N_datapoints = sum (tab_blk (:)&gt; 0); sulla procedura non solo lampeggianti hist (tab_alpha (tab_blk&gt; 0), 2 * sqrt (N_datapoints))% con 2sqrt (N) bidoni xlabel (&#39;intensità (au)&#39;), ylabel (&#39;presenza&#39;) titolo (&#39;istogramma dell&#39;intensità di fluorescenza particelle&#39;)

mappatura diffusione molecolare nella membrana plasmatica da parte di più-target tracing (mtt)

Mapping Molecular Diffusion in the Plasma Membrane by Multiple-Target Tracing (MTT)

Il nostro obiettivo è quello di ottenere una descrizione completa dei processi molecolari che si verificano a membrane cellulari in diverse funzioni biologiche. Il nostro obiettivo è di caratterizzare la complessa organizzazione e le dinamiche della membrana plasmatica a livello di singola molecola, mediante lo sviluppo di strumenti analitici dedicati al Single-Particle Tracking (SPT) ad alta densità: Multipli-Target Tracing (MTT) 1. Singola molecola videomicroscopia, offrendo millisecondo e la risoluzione nanometrica 1-11, consente una rappresentazione dettagliata di organizzazione della membrana 12-14 mappare con precisione da descrittori quali la localizzazione delle cellule recettori, la mobilità, parto o interazioni. Abbiamo rivisitato SPT, sia sperimentalmente che algoritmicamente. Aspetti sperimentali incluso ottimizzare la configurazione e l&#39;etichettatura delle cellule, con particolare attenzione al raggiungimento della densità di etichettatura più alto possibile, al fine di fornire una fotografia dinamica di dinamica molecolare unos avviene all&#39;interno della membrana. Problemi algoritmici in questione ogni passo utilizzare per la ricostruzione delle traiettorie: picchi di rilevazione, la stima e la riconnessione, affrontato da specifici strumenti di analisi delle immagini 15,16. Implementazione deflazione dopo che il rilevamento consente picchi di salvataggio inizialmente nascosta da vicini, i picchi più forti. Da notare, migliorando il rilevamento influisce direttamente riconnessione, la riduzione delle lacune all&#39;interno di traiettorie. Le prestazioni sono state valutate con simulazioni Monte-Carlo per la densità e l&#39;etichettatura diversi valori di rumorosità, che in genere rappresentano i due principali limiti per le misure parallele ad alta risoluzione spazio-temporale. La precisione nanometrica 17 ottenuta per singole molecole, utilizzando successive on / off o photoswitching ottica non lineare, in grado di fornire osservazioni esaustive. Questa è la base di metodi nanoscopia 17 come STORM 18, PALM 19,20, RESOLFT 21 o STED 22,23, which possono spesso richiedere campioni di immagini fisse. Il compito centrale è l&#39;individuazione e la stima dei picchi di diffrazione limitata provenienti dalle singole molecole. Quindi, fornendo adeguati presupposti, quali la gestione di un costante precisione di posizione invece del moto browniano, MTT è semplicemente adatto per le analisi nanoscopica. Inoltre, MTT possono fondamentalmente essere utilizzato in qualsiasi scala: non solo per le molecole, ma anche per cellule o animali, per esempio. Quindi, MTT è un algoritmo di rilevamento potente che trova applicazioni su scala molecolare e cellulare.

Multiple-bersaglio tracciatura è un algoritmo casalingo sviluppato per il monitoraggio singolarmente molecole marcate nella membrana plasmatica di cellule viventi. In modo efficiente la rilevazione, la stima e la rintracciabilità nel tempo molecole ad alta densità fornire una user-friendly, strumento completo per studiare la dinamica della membrana su scala nanometrica.

Mappatura diffusione molecolare nella membrana plasmatica da parte di più-Target Tracing (MTT)

Il nostro obiettivo è ottenere una descrizione completa dei processi molecolari che avvengono nelle membrane cellulari in diverse funzioni biologiche. Miriamo a caratterizzare la complessa organizzazione e la dinamica della membrana plasmatica a livello di singola molecola, sviluppando strumenti analitici dedicati al Single-Particle Tracking (SPT) ad alta densità: il Multiple-Target Tracing (MTT)1. La videomicroscopia a singola molecola, che offre una risoluzione millisecondaria e nanometrica1-11, permette una rappresentazione dettagliata dell'organizzazione di membrana12-14 mappando accuratamente descrittori quali la localizzazione, la mobilità, il confinamento o le interazioni dei recettori cellulari. Abbiamo rivisitato l'SPT, sia dal punto di vista sperimentale che algoritmico. Gli aspetti sperimentali hanno incluso l'ottimizzazione del setup e della marcatura cellulare, con particolare enfasi nel raggiungere la più alta densità di marcatura possibile, al fine di fornire un'istantanea dinamica della dinamica molecolare così come avviene all'interno della membrana. Le questioni algoritmiche hanno riguardato ogni fase utilizzata per la ricostruzione delle traiettorie: rilevamento, stima e riconnessione dei picchi, affrontate attraverso strumenti specifici di analisi delle immagini15,16. L'implementazione della deflazione dopo il rilevamento consente di recuperare i picchi inizialmente occultati da picchi adiacenti più forti. È opportuno sottolineare che il miglioramento del rilevamento influisce direttamente sulla riconnessione, riducendo i gap all'interno delle traiettorie. Le prestazioni sono state valutate utilizzando simulazioni Monte-Carlo per vari valori di densità di marcatura e di rumore, che tipicamente rappresentano le due principali limitazioni per le misurazioni parallele ad alta risoluzione spazio-temporale. L'accuratezza nanometrica17 ottenuta per singole molecole, utilizzando sia il photoswitching on/off successivo che l'ottica non lineare, può fornire osservazioni esaustive. Questo costituisce la base di metodi di nanoscopia17 quali STORM18, PALM19,20, RESOLFT21 o STED22,23, che spesso possono richiedere l'imaging di campioni fissati. Il compito centrale è il rilevamento e la stima di picchi limitati dalla diffrazione provenienti da singole molecole. Pertanto, adottando presupposti adeguati, come la gestione di un'accuratezza posizionale costante invece del moto browniano, l'MTT risulta direttamente adatto per le analisi nanoscopiche. Inoltre, l'MTT può essere fondamentalmente utilizzato a qualsiasi scala: non solo per le molecole, ma anche, per esempio, per cellule o animali. Di conseguenza, l'MTT è un potente algoritmo di tracking che trova applicazioni a scala molecolare e cellulare.

Ciao. In questo video presentiamo un esperimento completo di tracciamento quantistico singolo. Un algoritmo dedicato è stato interamente concepito in collaborazione con esperti del gruppo ISIS per l'analisi delle immagini. Durante questo video, utilizzeremo il recettore del fattore di crescita epidermico come modello per descrivere il metodo di questa tecnica.Il recettore del fattore di crescita epidermico è una proteina transmembrana. Questo recettore verrà marcato utilizzando un anticorpo monoclonale, ridotto per mantenere solo il frammento A a B. Il frammento A a B viene biotinilato e successivamente legato alla streptavidina del punto quantico, in modo che il sistema riconosca con precisione il recettore EGF.Il nostro obiettivo è fornire una visione completa della dinamica dei recettori della superficie cellulare. In effetti, le traiettorie molecolari possono discostarsi da una diffusione libera restando confinate all'interno di nano domini. Ad esempio, questo potrebbe rappresentare la firma di un'interazione sottostante con, per esempio, partner di segnalazione o impalcature molecolari.Il nostro obiettivo è descrivere in modo esaustivo tali eventi mappandoli sull'intera cellul

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Questo documento fornisce una guida passo per passo per la tecnica di analisi fluttuazione k-Image Space Correlation Spectroscopy (CCI) per misurare i coefficienti di diffusione delle fluorescente proteine ​​di membrana plasmatica in cellule di mammifero vive.

Facile Misura di diffusione Coefficienti di EGFP-tagged plasma proteine ​​di membrana Uso k-spazio Spettroscopia di correlazione Immagine

La distribuzione spaziale e la dinamica temporale delle proteine e dei lipidi della membrana plasmatica è un argomento caldo in biologia. Qui questo problema è affrontato da un'analisi di fluttuazione dell'immagine spazio-temporale che fornisce concettualmente le stesse quantità fisiche di tracciamento di singole particelle, ma utilizza piccole etichette molecolari e configurazioni di microscopia standard.

Da Veloce imaging di fluorescenza di Molecular legge Diffusione su membrane cellulare dal vivo in un microscopio commerciale

Il protocollo presentato descrive l'analisi del trasporto mediato da proteine di membrana a livello di singolo trasportatore utilizzando doppi strati lipidici privi di solventi che attraversano i pori. Ciò si ottiene grazie alla creazione di chip array di nanopori prodotti in serie, combinati con l'acquisizione e l'analisi dei dati altamente parallele, consentendo la futura creazione di screening degli effettori delle proteine di membrana.

Trasporto di membrana processi analizzati da un altamente parallelo sistema Nanopore Chip a risoluzione della proteina singolo

Viene descritto un metodo per misurare la diffusione delle proteine nelle membrane delle cellule immunitarie primarie utilizzando la spettroscopia di correlazione della fluorescenza (FCS). In questo articolo viene illustrato l'uso di anticorpi per la marcatura fluorescente.

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Qui, presentiamo un protocollo per singola particella monitoraggio analisi delle immagini che permette la valutazione quantitativa dei coefficenti di diffusione, tipi di movimento e cluster di dimensioni delle singole particelle rilevate mediante microscopia a fluorescenza.

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Microscopia di tracciamento a singola molecola - Uno strumento per determinare gli stati diffusivi delle molecole citosoliche

Questo articolo si propone di presentare un protocollo su come costruire un microscopio per spettroscopia di correlazione di fluorescenza a variazione spot (svFCS) per misurare la diffusione molecolare sulla membrana plasmatica delle cellule viventi.

Spettroscopia di correlazione di fluorescenza a variazione spot per l'analisi della diffusione molecolare sulla membrana plasmatica di cellule viventi

Questo protocollo descrive un approccio basato sull'elaborazione delle immagini e sul tracciamento di singole particelle basato su iSCAT che consente l'indagine simultanea della massa molecolare e del comportamento diffusivo delle macromolecole che interagiscono con le membrane lipidiche. Le istruzioni dettagliate per la preparazione del campione, la conversione da massa a contrasto, l'acquisizione di filmati e la post-elaborazione sono fornite insieme alle indicazioni per prevenire potenziali...

Tracciamento delle particelle sensibili alla massa per caratterizzare la dinamica delle macromolecole associate alla membrana

Qui viene presentato un protocollo per eseguire e analizzare il legame, la mobilità e l'assemblaggio di singole molecole su membrane lipidiche affollate artificiali utilizzando la microscopia a fluorescenza a riflessione interna totale a singola molecola (smTIRF).

Diffusione e assemblaggio di singole molecole su membrane lipidiche affollate di polimeri

Questo articolo fornisce una descrizione dettagliata di come creare campioni per il tracciamento a singola proteina in bistrati lipidici supportati da solidi. Spiega anche un microscopio a fluorescenza semplice con sensibilità a singola molecola e un frame rate elevato. Infine, delineiamo la procedura per estrarre traiettorie a singola proteina.

Tracciamento di singole proteine nei bilayer lipidici tramite microscopia a fluorescenza

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Mappatura diffusione molecolare nella membrana plasmatica da parte di più-Target Tracing (MTT)

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