Mappatura diffusione molecolare nella membrana plasmatica da parte di più-Target Tracing (MTT)

Hi.In questo video presentiamo un singolo esperimento completo di tracciamento quantistico. Un algoritmo dedicato è stato interamente concepito in collaborazione con esperti di immagini ISIS. Durante questo video, utilizzeremo il recettore del fattore di crescita epidermico come modello per descrivere il metodo di questa tecnica.

Il recettore del fattore di crescita epidermico è una proteina transmembrana. Questo recettore sarà marcato utilizzando un anticorpo monoclonale, che viene ridotto per mantenere solo il frammento A e B. Il frammento A a B viene biotinilato e successivamente, legato alla streptavidina del punto quantico, il sistema di pareti riconoscerà con precisione il recettore EGF.

Il nostro obiettivo è quello di fornire una visione completa della dinamica dei recettori della superficie cellulare. Infatti, le traiettorie molecolari possono deviare dalla diffusione del brot essendo confinate all'interno di nano domini. Ad esempio, e questa può essere la firma di un'interazione sottostante con, ad esempio, partner di segnalazione o scaffold molecolari.

Il nostro obiettivo è quello di descrivere tali eventi in modo esaustivo mappandoli sulla cellula, il che richiede di lavorare ad un'alta risoluzione temporale SPECT insieme ad un'alta densità di marcatura. Da qui il nome di questo approccio multi targett tracing. Il primo passo dell'esperimento è la preparazione del campione.

Lavoriamo su cellule vive senza antibiotici. Qui utilizziamo sette cellule, che esprimono endogenamente i recettori EGF. Dopo aver staccato la cella, dobbiamo confermare con precisione per avere lo stesso numero di cellule nel pozzetto del laboratorio.

Un numero preciso di cellule è molto importante per aumentare la prevedibilità del numero di punti quantici per cellula Dopo aver dispensato la cellula in H, beh, è necessario incubare il labato per 24 ore a 37 gradi con il 7% di CO2. Il passo successivo è la preparazione di punti quantici accoppiati ad anticorpi. I punti quantici sono piccole nanoparticelle fluorescenti.

Queste particelle hanno un grande interesse qui perché sono molto luminose e stabili rispetto alle classiche sonde fluorescenti e al segnale. Il rapporto del naso è molto importante per questo tipo di esperimento. In questo caso, utilizziamo un mezzo completo per saturare gli idi della striscia attorno ai punti quantici e per prevenire l'aggregazione.

Successivamente, abbiamo avuto i punti quantici nella proteina euforica bioTE o gli anticorpi di interesse con un rapporto uno a uno per avere punti quantici statisticamente più monovalenti. In questo esperimento, utilizziamo un frammento a b contro il recettore EGF prodotto in laboratorio da anticorpi monoclonali e che sono bersagliati con la biotina. Durante l'incubazione, della durata di circa 15 minuti, è possibile mantenere il controllo sotto aggregazione e omogeneità utilizzando un agitatore a 1.200 rotazioni al minuto e due gradi cinque.

Quando il composto è pronto, puoi aggiungerlo alle tue cellule. Rimuovete il terreno dal pozzetto molto delicatamente per evitare il distacco delle cellule sulla tecnologia di laboratorio e aggiungete la quantità necessaria di miscela per l'esperimento. In questo caso, aggiungeremo 100 microlitri di miscela per pozzetto.

Dopo l'aggiunta della miscela, puoi incubare la tua cellula per 15 minuti. In questo caso a 37 gradi con il 7% di CO2. Dopo questa incubazione, si può trovare un numero elevato di punti gemelli frequenti in sospensione sul terreno.

Questi punti quantici devono essere rimossi prima dell'imaging. A causa del rumore che portiamo. È per questo che dobbiamo lavarci ciascuno, beh più volte in questo caso, cinque volte per lavarci.

Utilizzare un mezzo di imaging senza autofluorescenza. Qui usiamo il buffer HBSS con aps. Ora le tue cellule sono pronte.

È ora di passare alla configurazione per l'acquisizione. La configurazione è composta da quattro parti principali, un microscopio invertito, una fotocamera con sensibilità oculare, una potente lampada al mercurio e un'incubatrice per mantenere la cella a 37 gradi. La luce della lampada al mercurio passa attraverso una fibra e attraverso una ruota portafiltri prima di illuminare il campione.

L'eSense dell'influenza del campione viene filtrato e raccolto da una telecamera E-M-C-C-D a sinistra. Attualmente utilizziamo 1,3 e 1,49 ad apertura numerica di olio mercantile di obiettivi. Il passo centrale di questo esperimento è l'acquisizione in sé.

Una volta che le cellule sono a fuoco, ne esaminiamo una rappresentativa con un'etichetta forte. Nei punti quantici, acquisiamo prima una singola immagine in luce bianca trasmessa, che può essere ulteriormente utilizzata per controllare l'aspetto cellulare e il limite speciale dei podi LA. Quindi acquisiamo il video in genere a una velocità di 36 millisecondi, la velocità più alta consentita nel full frame.

Usiamo un CCD moltiplicatore di elettroni per raggiungere la sensibilità di una singola molecola con un rapporto segnale/nord sufficiente almeno superiore a 20 decibel. In genere intorno ai 25 decibel, di solito acquisiamo 300 fotogrammi. Per valutare un determinato set di dati, è sufficiente fornire il passaggio alla directory contenente i file video.

Digitando quindi il comando, il testo si riconnette in MetLab o o il comando MTT 23 I, che visualizza prima un elenco di interfacce grafiche. Tutti i parametri utilizzati avvieranno l'analisi completamente automatizzata. L'analisi MTT di base viene eseguita su ogni fotogramma, richiamando tre compiti principali, il primo rilevamento per ogni pixel della presenza o dell'assenza di un debito quantistico target.

Quindi, per ogni rilevamento, viene stimata la destinazione parametri rilevanti come la posizione dei pixel, l'intensità del segnale e così via. Ultima riconnessione dei nuovi obiettivi. Con le tracce già costruite sui fotogrammi precedenti per ogni pixel.

Considerando una sottoregione locale, confrontiamo due ipotesi di presenza, sia di rumore che di segnale. Con la funzione di diffusione dei punti, ModuLite ha un picco hin. Utilizziamo una soglia che garantisce falsi allarmi sufficientemente bassi con meno di un rilevamento di perus per fotogramma per ogni bersaglio rilevato.

Successivamente eseguiamo un piede nutriente fantasma almeno quadrato per stimare la posizione, la larghezza e l'altezza del Goshen rilevato. Ciò fornisce in particolare la posizione della cella spic del colorante, in genere una precisione compresa tra 10 e 20 nanometri per i tipici rapporti segnale/rumore a picchi ad alta densità può spesso essere troppo chiusa e picchi forti possono ostacolare quelli più deboli per gestirlo. Sgonfiamo i picchi rilevati dall'esecuzione iniziale dell'immagine.

Anche in questo caso, il rilevamento sul residuo può in genere distorcere il 10% dei picchi. Raggiungere un rilevamento quasi esaustivo è molto fruttuoso per una riconnessione accurata. Quindi l'insieme dei nuovi obiettivi viene confrontato con l'insieme delle tracce precedenti per questo alunno.

Al fine di assegnare ogni traccia a un bersaglio, se possibile, e gestire eventuali lampeggianti, utilizziamo tutte le informazioni statistiche disponibili ottenute dalla fase di rilevamento. Pertanto, le destinazioni non vengono assegnate solo alla traccia più vicina. In caso di conflitti, quando le tracce possono incrociarsi, cioè le rispettive regioni di ricerca rilevanti si sovrappongono, si considererà il valore statistico di intensità, velocità, larghezza e lampeggio sia per le tracce che per i target.

In questo modo si ottiene un punteggio di riconnessione statisticamente ottimale. La strategia permette di evitare, quando possibile, di polarizzare la riconnessione verso i vicini più prossimi, ovvero il movimento più lento. Successivamente utilizziamo una funzione per valutare il possibile confinamento transitorio all'interno delle traiettorie.

Questa funzione è inversamente correlata alla diffusione locale come stabilito da Sexton Simpson e collaboratori. L'applicazione di una soglia consente di definire episodi confinati o meno. Iterando queste tracce complessive, possiamo finalmente mappare la dinamica della membrana in termini di confinamento transitorio, evidenza di rallentamento, e questo può essere rappresentato.

In alternativa, utilizzando i valori binari o discreti di questo indice di confinamento, per impostazione predefinita, MTT eseguirà automaticamente tali attività, salvando per ogni video, i parametri di riga per ogni picco in un file eski e per ulteriori indagini avanzate. Risultati tipici come la mappa delle tracce su ogni cella e i grafici degli istogrammi per i parametri di interesse, le intensità di picco, il rapporto segnale/rumore, i valori di carenza locale, e quindi questo aspetto può essere facilmente adattato a qualsiasi indagine dedicata. Questo video riassumerà ora i risultati tipici ottenuti da MTT.

Una parte sostanziale del lavoro risiede nell'elaborazione dell'algoritmo, che potrebbe dover essere adattato a indagini dedicate come le modalità di movimento o le interazioni sofferenti. Ma l'esecuzione di MTT è molto semplice. Gli utenti devono ottimizzare solo alcuni parametri come i limiti di spazio e di tempo.

Durante l'elaborazione dell'MTT, abbiamo mirato a riconsiderare completamente le opzioni analitiche utilizzate per ogni attività. Ottimizziamo il processo lungo due assi sfidanti. In primo luogo, la gestione di densità elevate per ottenere le migliori informazioni speciali sulla superficie superficiale e, in secondo luogo, la gestione di SNR deboli, che in genere consente di lavorare a bassa eliminazione e confinamento ad alta velocità, può essere interpretata come la firma di un'interazione sottostante.

I recettori di membrana possono interagire con il citoscheletro sottomembrana o con i domini pro lipidici, ad esempio. Tali eventi possono essere indagati attraverso variazioni di confinamento nello spazio e nel tempo. Le misure dinamiche possono essere paragonate ad approcci complementari come FRA, F, C o merci.

Il codice open source è disponibile per la ricerca accademica. Può essere scaricato dalla nostra pagina web all'indirizzo CML dot univ se un S fr sulla nostra pagina dei team, che fornisce un link per il download. Anche gli industriali interessati sono invitati a contattarci.

Vorremmo ringraziare in particolare i membri del nostro team e delle strutture comuni per il supporto e le discussioni fruttuose. Questo progetto è sostenuto dal finanziamento del CNRS in c MAA University Pac Region National de La, e la Fondazione Medica è supportata dal controllore della lega. Grazie per l'attenzione.